Articolo metodologico

Un metodo altamente riproducibile e semplice da eseguire In Vivo Oculare enucleazione del mouse dopo apertura degli occhi

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DOI:

10.3791/51936

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6 ottobre 2014

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1Department of Biology, KU Leuven - University of Leuven

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

La rimozione degli occhi, chiamato anche enucleazione, fornisce una strategia utile per studiare gli aspetti di visual, cross-modale, e la plasticità dello sviluppo lungo il sistema visivo dei mammiferi poiché induce irreversibile parziale (monoculare) o completa (binoculare) perdita della vista. Qui si descrive un approccio altamente riproducibile e semplice da eseguire in vivo enucleazione.

Abstract

Enucleazione o la rimozione chirurgica di un occhio possono generalmente essere considerate un modello per nervo deafferentazione. Esso fornisce un valido strumento per studiare i diversi aspetti della visuale, cross-modale e la plasticità dello sviluppo lungo il sistema visivo dei mammiferi 1-4.

Qui, dimostriamo una tecnica elegante e diretto per la rimozione di uno o entrambi gli occhi nel topo, che viene convalidato in topi di 20 giorni di età fino agli adulti. In breve, un disinfettati pinze curve viene utilizzato per bloccare il nervo ottico dietro l'occhio. Successivamente, movimenti circolari vengono eseguiti per costringere il nervo ottico e rimuovere il bulbo oculare. I vantaggi di questa tecnica sono alta riproducibilità, minimo a nessun sanguinamento, rapido recupero post-operatorio e una soglia molto bassa di apprendimento per lo sperimentatore. Quindi, una grande quantità di animali può essere manipolato e trattati con sforzo minimo. La natura della tecnica può indurre lievi danni alleretina durante la procedura. Questo effetto collaterale rende questo metodo meno adatti rispetto a Mahajan et al. (2011) 5, se l'obiettivo è quello di raccogliere e analizzare tessuto retinico. Inoltre, il nostro metodo è limitata ad aprire post-eye età (mouse: P10 - 13 in poi) in quanto il bulbo oculare deve essere spostato dalla presa senza rimuovere le palpebre. La tecnica di enucleazione in vivo descritto in questo manoscritto è stato recentemente applicato con successo con piccole modifiche nei ratti e sembra utile studiare il percorso visivo afferente dei roditori in generale.

Introduzione

Rimozione di un occhio e quindi irreversibilmente distruggendo la superficie del recettore sensoriale (retina), impone una notevole perdita di input sensoriali lungo il percorso visivo. Il modello enucleazione nel sistema visivo giovanile e adulta ha dimostrato di essere utile nella comprensione dello sviluppo, plasticità e la funzione dei diversi centri visivi 1-4. Le conseguenze molecolari, cellulari e fisiologici di questa deprivazione sensoriale in grado di fornire intuizioni su come normale sviluppo è regolato e come definiti, circuiti corticali affrontare e cambiano la loro struttura e funzione in risposta a una tale vasta alterazione esperienza.

Esistono diversi metodi di deprivazione visiva e tutti hanno i loro vantaggi specifici di ricerca sulla visione-correlati. Per esempio allevamento scuro specificamente elimina l'attività guidata visivamente ma non influenza l'attività retinica spontanea. Visua Allo stesso modo, suture coperchio o patch occhi Togliere modellatol ingresso senza disturbare l'attività spontanea, ma permettono la penetrazione della luce dispersa attraverso gli occhi chiusi. Tali metodi sono reversibili e hanno dimostrato di essere utile nella comprensione del ruolo della fantasia visione e di basso livello di correlazione degli ingressi binoculari a scolpire circuiti corticali durante lo sviluppo 6-8. Nella ricerca glaucoma, il nervo ottico modello cotta in animali adulti è stato ampiamente utilizzato perché stabilisce una progressiva perdita di ingressi cellule gangliari della retina che costituiscono il nervo ottico 9,10. D'altra parte, enucleazione, dove l'occhio e quindi la retina è completamente ed immediatamente rimosso, è la scelta appropriata di privazione quando lo scopo è quello di eliminare irreversibilmente visione sia spontanea e modellata in una volta. Induce anche una robusta attività di squilibrio intraoculare che può migliorare il rapporto segnale-rumore negli studi di mappatura dell'attività 11,12. Confrontando cambiamenti funzionali e strutturali in risposta a enucleazione con those dopo deprivazione con metodi meno drastici come il coperchio di sutura per esempio, potrebbe anche esporre nuove intuizioni sul ruolo dell'attività spontanea retinica in entrambi i tipi omeostatici e di plasticità sinaptica.

Enucleazione innesca una perdita di influenze trofiche negli obiettivi diretti della retina. Ad esempio, i livelli di BDNF sono significativamente inibiti nel nucleo genicolato laterale (LGN) e collicolo superiore di ratti adulti enucleati 13. Le specie reattive dell'ossigeno, che funzionano come molecole messaggere di mediare rimodellamento strutturale, sono state rilevate anche in strutture sottocorticali del ratto adulto sistema visivo 14. Inoltre, microglia e l'attivazione astrogliale attraverso diverse strutture di destinazione visive sottocorticali nel topo si verificano in un determinato lasso di tempo post-enucleazione di una settimana 15. Insieme, i risultati deafferentazione ottica in diverse risposte sottocorticali a gliale, piano strutturale e molecolare. Nonostante questi sottocorticaleeffetti, che non necessariamente implicano effetti a livello corticale 16. Degno di nota, plasticità corticale cross-modale, comprese le modifiche in altre aree sensoriali accanto al rafforzamento degli ingressi non visive alla corteccia visiva privato si verificano dopo sia monoculare (ME) 3,4,17,18 e binoculare (BE) 1,17 enucleazione.

Oltre a contribuire alla neuroscienza visiva, enucleazione come un tipo di deafferentazione può essere usato per studiare l'equilibrio tra neuroprotettivi 19 e neurodegenerative 20-22 proprietà del sistema nervoso centrale.

Diverse procedure per eseguire l'enucleazione sono già descritti in letteratura. Alcune metodologie per in vivo ME su ratti e topi sono meno semplici a causa di inutili sezionamento dei muscoli e dei tessuti orbitali 23-25. Altre pubblicazioni come Mahajan et al. (2011) 5 forniscono un protocollo dettagliato con scollamento per una collezione high-throughput di occhi per studiare le correlazioni genotipo-fenotipo, probabilmente post-mortem. Per il loro scopo, il metodo è comodo e veloce. Tuttavia, questo metodo è meno adatto in vivo enucleazione quando si opta per studiare il percorso visivo afferente seguente enucleazione (animali vivi), piuttosto che l'occhio stesso. In un tale ambiente, la sopravvivenza post-enucleazione è di grande importanza. Inoltre, minimal danni vivo e la conservazione del nervo ottico e del tessuto orbitale è favorevole. Qui, presentiamo un metodo alternativo enucleazione, più simile a quello descritto da Faguet et al (2008) 26, che offre alcune caratteristiche positive. Esso è associato ad un rapido recupero post-operatorio ed è caratterizzata da una soglia di apprendimento molto bassa per i ricercatori. In generale, diversi metodi sono complementari a seconda del focus della ricerca successiva: morfologia dell'occhio o di ricerca via visiva.

ve_content "> In sintesi, l'enucleazione può essere applicato dalla ricerca di visione verso ricerche di plasticità omeostatica e cross-modale cervello, proprietà di risposta gliali, e la stabilità assone. In questo articolo visualizzato, dimostriamo un metodo fattibile e affidabile per in vivo degli occhi enucleazione in il mouse.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati approvati dal comitato etico della ricerca di KU Leuven ed erano in stretta conformità con le Comunità europee Direttiva del Consiglio del 22 settembre 2010 (2010/63 / UE) e con la legislazione belga (KB 29 maggio 2013). È stato fatto ogni possibile sforzo per ridurre al minimo la sofferenza degli animali e per ridurre il numero di animali.

1 Trattamento e Anesthetics animali

  1. Anestetizzare il mouse con un'iniezione intraperitoneale di una miscela di ketamina cloridrato (75 mg / ml) e medetomidina cloridrato (1 mg / kg) in soluzione salina.
  2. Controllare i riflessi pizzicando le dita dei piedi con una pinza per garantire il mouse è completamente sedato.
  3. Applicare il 70% di etanolo per disinfettare le palpebre e della regione circostante l'occhio con una punta di cotone. Controllare il riflesso palpebrale per valutare ulteriormente il grado di sedazione.

2 Rimuovere la Eye

  1. Assicurarsi che l'animale si trova su una superficie piana, asciutta esuperficie liscia.
  2. Sterilizzare una pinza con una curva, punta seghettata (formato di punta preferita: 0,5 x 0,4 millimetri).
  3. Premere delicatamente sul canto (angolo dell'occhio) con la pinza fino a quando il bulbo oculare viene spostata dalla presa e il nervo ottico è raggiungibile.
  4. Guida la pinza dietro l'occhio. Premere e tenere premuto il nervo ottico saldamente, preferibilmente con l'inizio della curva e non la punta della pinza. Ciò contribuirà a sollevare il globo dalla presa e per bloccare il nervo ottico completa.
  5. Effettuare movimenti circolari con la mano che tiene la pinza nella direzione con la minima resistenza mentre il mouse rimane sulla superficie piana. Il mouse oscillerà lungo la superficie secondo la direzione del movimento della mano.
  6. Eseguire questa azione con aumentando gradualmente la velocità fino a quando il nervo ottico è ristretto a due (di solito tra i 7 a 15 movimenti circolari, a circa metà di un giro completo al secondo). Quindi, il bulbo oculare è distaccatorimosso.

Cura 3. post-operatorio

  1. In caso di sanguinamento (raro), riempire l'orbita con un coagulo viscoso e agente emostatico.
  2. Invertire l'anestesia iniettando 1 mg / kg di atipamezol cloridrato in soluzione fisiologica per via intraperitoneale.
  3. Somministrare 1 mg / kg di meloxicam per via intraperitoneale ogni 24 ore per alleviare il dolore.
  4. Applicare unguento occhio a occhio rimanente per prevenire la disidratazione della cornea.
  5. Sia l'animale recuperare su una piastra riscaldante o avvolgere l'animale in materiale isolante in una gabbia separata per controllare la temperatura corporea.
  6. Misurare il peso del mouse ogni giorno per almeno 2 giorni. La perdita di peso può indicare sofferenza e in questo caso, continuare il trattamento meloxicam finché l'animale è completamente recuperato.

Risultati

La figura 1 illustra la rimozione successo dell'occhio utilizzando il protocollo descritto ed è caratterizzato dall'assenza di sanguinamento o qualsiasi danno fisico apparente al tessuto orbitale o cavità oculare (figure 1A, 1B). Inoltre, l'occhio rimosso ha una cornea liscia, coroide e disco ottico, indicativo di un globo completamente intatto (Figura 1C). Dal nostro protocollo comprende il bloccaggio del nervo ottico dietro l'occhio e tornitura meccanica, il nervo ottico dell'occhio rimossa è ristretto alla base della retina (Figura 1D). Eseguire i risultati descritti procedura in un nervo ottico clean-cut, senza alcun danno per l'area del cervello circostante (Figura 1E).

Enucleazione monoculare, in combinazione con la mappatura dell'attività (Figura 2), permette di delineare nettamente le regioni ingresso funzionali o occhio specifiche nel visua controlateralel corteccia del mouse 12,27 o colonne di dominanza oculare, anche nei mammiferi di ordine superiore come le scimmie 28.

Negli esperimenti con i topi, la rimozione di uno (ME) o entrambi gli occhi (BE) in combinazione con mirata stimolazione visiva e il rilevamento di zif268 mRNA o di c-Fos livelli di espressione della proteina è stata applicata per scoprire attivazione neuronale regionale nella corteccia visiva 12,27 . Contrariamente ai controlli stimolati visivamente (Figura 2A), BE topi hanno mostrato attività basale nella corteccia visiva causa completare mancanza di input visivo (Figura 2B). Come tale, i confini tra la corteccia visiva con non-visiva (ad esempio. Corteccia somatosensoriale in più sezioni anteriori e corteccia uditiva in più sezioni posteriori) sono stati scoperti. I risultati di ME topi con un tempo di sopravvivenza di una settimana visualizzate le specifiche regioni ingresso oculari nella corteccia visiva controlaterale. Le due regioni monocularmente guidate erano ipoattivo e trova mediAl e laterale della zona centrale binoculare (Figura 2C).

Diagramma di dissezione del topo che mostra il processo di rimozione dell'occhio, la coroide, il disco ottico e l'anatomia del cervello.
Figura 1 Valutazione qualitativa dello stato post-enucleazione della cavità oculare, l'occhio rimosso e il nervo ottico. Dopo la rimozione degli occhi con una pinza curva (A) assenza di sanguinamento o danni si osserva nella cavità oculare (B). L'occhio è rimosso completamente intatto come riflesso da un normale aspetto della cornea e della coroide (C, D). Il nervo ottico viene costretto a disco ottico in cui lascia l'occhio (D). L'esame della parte ventrale del cervello rivela un nervo ottico taglio netto (asterisco) e nessun danno apparente di altre strutture (E). Barre di scala in C, D: 1 mm. Bar Scala in E: 5 mm. A: anteriore; L: sinistro; P: posteriore; R: destro.


Figura 2.-eye ingresso funzionali suddivisioni nel topo corteccia visiva come rivelato dalla enucleazione. Linee nere e grigie che collegano gli occhi e la corteccia rappresentano il passaggio sopra di afferenze retiniche e delle specifiche regioni di ingresso oculari. L'attività neurale viene visualizzato su sezioni coronali di controllo (A), BE (B), e ME (C) topi radioattivi ibridazione in situ (ISH) per zif268 (scala di grigi) attorno al livello Bregma -3,40 mm. Negli animali di controllo (A), la corteccia visiva in entrambi gli emisferi esprime ad alta attività dopo stimolazione visiva. Quando uno o entrambi gli occhi (s) sono estirpato, una netta diminuzione del segnale di attività è visibile nelle corrispondenti regioni corticali svantaggiate. Monocularmente enucleato (C) topi mostrano una zona di alta actività nella zona binoculare della corteccia visiva circondato da un segnale ridotto nelle zone monoculare controlaterale all'occhio rimosso. Scala bar: 2 mm. Ristampato con il permesso di Van Brussel et al 12.

Discussione

Per eseguire una enucleazione di successo secondo il nostro metodo, i passaggi più critici da considerare sono: 1) utilizzando una pinza con punta ricurva e seghettata di dimensioni adeguate; 2) eseguire l'enucleazione su una superficie liscia e asciutta; e 3) gradualmente accelerare i movimenti circolari in senso con il minimo attrito.

Per un risultato efficace, è indispensabile utilizzare un appropriato pinza caratterizzate da una punta ricurva e seghettata (preferito il formato di punta: il mouse: 0,5 x 0,4 mm ratto: 2,15 x 1,3 mm). La curvatura consente un facile accesso al nervo ottico dopo spostamento bulbo oculare ed è necessaria per il posizionamento corretto mano durante l'esecuzione dei movimenti circolari. Punte lisce non sono raccomandati in quanto manca il grip necessario quando si tiene il nervo ottico. La mancata tenere il nervo ottico correttamente durante i movimenti circolari provoca rottura dell'arteria oftalmica, scarsa distacco dell'occhio e quindi scarsa riproducibilità.Pertanto, si raccomanda di prima pratica questa tecnica su animali eutanasia per l'ottimizzazione delle pinze di movimentazione in modo da garantire la massima protezione degli animali una volta che l'applicazione del metodo in vivo. Enucleazione dell'occhio successo è stato recentemente eseguito anche nel ratto nel nostro laboratorio utilizzando la stessa tecnica tranne per trasformare il corpo animale manualmente e mantenere la pinza stazionaria.

Una limitazione di questa tecnica è che si potrebbe danneggiare la retina. Pertanto questo metodo è meno adatto per la raccolta retine effettuare istologia 5. Inoltre, il nostro metodo è limitato a postare l'apertura dell'occhio secoli da quando il bulbo oculare deve essere spostato dalla presa, senza asportazione o il taglio delle palpebre.

Enucleazione dell'occhio in diverse specie, tra cui roditori, viene eseguita di routine con metodi alternativi, che spesso comportano la rimozione delle palpebre e il taglio del nervo ottico 18,23-25. Questi Methods tendono ad essere più invasivi e hanno una curva di apprendimento superiore alla tecnica qui descritta. Senza la necessità di rimuovere o sutura delle palpebre, il tempo di recupero post intervento chirurgico è ridotto al minimo, con conseguente incremento del benessere degli animali e risultati più riproducibili.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo Ellen Ytebrouck per le sue preziose informazioni riguardanti l'applicazione del metodo nel ratto. Questo lavoro è stato sostenuto dal Consiglio della Ricerca della KU Leuven (OT09/22) e dal Fondo per la Ricerca Scientifica delle Fiandre (FWO Vlaanderen). Jeroen Aerts è supportato da una borsa di dottorato dell'Agenzia per l'innovazione attraverso la scienza e la tecnologia delle Fiandre (IWT Vlaanderen) e Julie Nys da una borsa di dottorato di ricerca del FWO Flanders.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Ketamina cloridrato (Aneschetina)Prodotti veterinari Dechra (Eurovet)BE-V136516
Medetomidina cloridrato (Domitor)Orion Corporation (Janssen Animal Health)BE-V151742
Atipamezol cloridrato (Antisedan)Orion Corporation (Elanco Animal Health)BE-V153352
Antibiotici (cefazolina, Kefzol)Eurocept Prodotti farmaceuticiBE 106267
Unguento per gli occhi (fucithalmico)Leo Pharma nv-saBE 144654
Moria MC31 Pinze - Strumenti di scienza fine curvi seghettati11370-31Per l'applicazione nel mouse. È possibile utilizzare qualsiasi pinza con dimensioni simili, purché la punta sia curva e seghettata.
Pinze a modello stretto - curveFine Science Tools11003-13Per l'applicazione nel ratto. È possibile utilizzare qualsiasi pinza con dimensioni simili, purché la punta sia curva e seghettata.
Cotone idrofilo emostaticoQualipharN/A Altriagenti emostatici sono ugualmente adatti (es., Viscostat, #649, Ultradent Products)

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