Method Article

Confocale Time lapse imaging come un metodo efficiente per la valutazione citocompatibilità di compositi dentali

DOI:

10.3791/51949

⸱

November 9th, 2014

 ,  ,  , 
1Laboratoire des Multimatériaux et Interfaces, UMR CNRS 5615, Université Lyon1, 2UFR d'Odontologie, Université Lyon1; Service de Consultations et de Traitements Dentaires, Hospices Civils de Lyon, 3UFR d'Odontologie, Université Paris Diderot; Service d'Odontologie, APHP, Hôpital Rothschild

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'aspetto più studiato della biocompatibilità dei compositi dentali è la loro citotossicità 3D CLSM lasso di tempo di imaging combinato con fluorescente quantificazione del segnale consente di valutare sensibile del destino delle cellule nel corso del tempo. Utilizzando questo metodo potrebbe essere uno strumento efficace per valutare la citocompatibilità di compositi dentali.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

E 'generalmente accettato che l'interazione in vitro materiale cella è un criterio utile nella valutazione di materiale dentale biocompatibilità. L'obiettivo di questo studio è stato quello di utilizzare 3D CLSM tempo di imaging lasso confocale per valutare la biocompatibilità in vitro di compositi dentali. Questo metodo fornisce un'indicazione precisa e sensibile della frequenza di cellule vitali in contatto con estratti compositi dentali. L'ELS in più basso ritiro, un composito dentale usato per restauro diretto, è stato preso come esempio. In vitro valutazione è stata effettuata su cellule di fibroblasti umani in coltura primarie gengivali utilizzando Live / colorazione Morto. Le immagini sono state ottenute con il sistema invertito confocale biologico FV10i e analizzati con il software 3.1 FV10-ASW. L'analisi delle immagini mostrava un leggero citotossicità in presenza del composto testato dopo 5 ore di time lapse. Una leggera diminuzione della vitalità cellulare è stato mostrato in contatto con il composito estratti Compar testatoed alle cellule di controllo. I risultati hanno evidenziato l'uso del 3D CLSM immagini time lapse come metodo sensibile per valutare qualitativamente e quantitativamente il comportamento biocompatibilità dei compositi dentali.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uno dei principali standard indicati nelle raccomandazioni ISO per definire biocompatibilità è l'assenza di tossicità materiale per le cellule. Compositi dentali a base di resine possono rilasciare i componenti dalla matrice resinosa, che potrebbe essere inizialmente a causa di polimerizzazione parziale, e / o in seguito a causa di processi di degradazione nel tempo 1-4. Questi componenti rilasciati venire a contatto con i tessuti orali e possono avere vari inconvenienti, come orticaria e reazioni della mucosa 5, lo sviluppo di reazioni allergiche e di ipersensibilità in pazienti 6, modifiche di fibroblasti gengivali morfologia e riduzione di collagene di tipo I di proteine ​​7, immunosoppressione o Immunostimolazione su mitogeno -driven proliferazione di purificate linfociti T e delle cellule della milza 8 e danni al DNA in fibroblasti gengivali umani primari, che sottolinea il loro potenziale genotossico 9. Molti parametri possono influenzare la tossicità composito dentale, come l'ombra del composite, la fotopolimerizzazione, la composizione chimica del monomero della resina, il riempimento e il grado di conversione 10- 13. Dal potenziale tossico in vitro dei materiali può prevedere in situazioni in vivo e potrebbe essere paragonato a situazioni cliniche da parte lo studio di alcuni endpoint rilevanti. La citotossicità di compositi dentali e dei loro componenti sono stati ampiamente valutati usando sistemi di colture cellulari 14- 16.

Questi sistemi in vitro sono stati sviluppati per valutare compositi dentali biocompatibilità in termini di: crescita cellulare e l'apoptosi delle cellule utilizzando THP-1monocytes come le cellule 17, citotossicità in fibroblasti gengivali umani 18, potenziale infiammatorio in HaCaT cheratinociti come le cellule 2, la funzionalità delle cellule odontoblast- come MDPC-23 cellule 19, la riduzione dei livelli di RNA totale, e aumento significativo di induzione di apoptosi in gengivale cheratinociti umani 20 eDanno al DNA in fibroblasti gengivali e polpa di cellule 21.

Diverse metodologie sono suggeriti per studiare la biocompatibilità dei materiali compositi dentali. Saggi colorimetrici, che coinvolgono coloranti specifici e misurazioni di assorbimento di luce, rimangono i più comunemente utilizzati, per la loro relativa semplicità e basso costo 22- 26. Analisi al microscopio per contrasto luce consuma spesso più tempo e comporta costi più elevati. Tuttavia, queste tecniche di microscopia presentano alcuni importanti vantaggi. L'osservazione della struttura cellulare fornisce informazioni estese sugli effetti tossici esperti, fornendo così dati più rilevanti e sensibili. In particolare, l'introduzione di microscopia confocale 27 ha permesso l'osservazione delle strutture biologiche con il miglioramento risoluzione assiale rispetto al livello di campo tradizionali microscopi a fluorescenza. Quindi, l'imaging confocale è diventato un potente strumento di indagine in diversi campi diricerche mediche e scientifiche. In contrasto con tecniche di microscopia elettronica a scansione microscopia confocale offre la possibilità di visualizzare componenti distinti di cellule per incorporazione di marcatori fluorescenti specifici. La maggior parte di questi traccianti specifici sono stabili in ambiente acquoso, sensibilmente misurabili, poco costoso e non tossico 28, permettendo il loro uso in clinica e ricerche di laboratorio. Inoltre, l'essiccamento del campione e la fissazione richiesto per convenzionale analisi al microscopio elettronico non è necessaria per tempo di imaging lapse confocale, rilevamento così dipendente dal tempo è possibile anche su campioni. Rispetto alle immagini bidimensionali, il principio confocale consente una visualizzazione esemplare sottosuolo e la struttura ricostruzione tridimensionale delle diverse immagini in profondità ottenuti; che provocano, più precise e più strutturali particolari 29, 30. Il presente studio video è un esempio dell'uso di tridimensionale Time-lapse Confocal Laser Scanning Microscopy (3D-CLSM) in combinazione con l'etichettatura Live / Dead fluorescenti e la quantificazione del segnale come un metodo innovativo. La tecnica presentata in questo documento ha il vantaggio di consentire la valutazione e time-lapse sensibili di imaging di cellule vive senza modificare la struttura cellulare della valutazione. Non ci sono fasi di preparazione sono necessari prima dell'analisi confocale. In precedenza, la stessa colorazione è stata utilizzata per valutare la vitalità delle colture nuclei spongiosa 31 ma senza confocale time-lapse seguente. Allo stesso modo la stessa procedura di time-lapse confocale è stato utilizzato per valutare l'attività eritromicina tempo-kill nei batteri dei fanghi attivi in base al loro tipo Gram 32 utilizzando uno specifico batteri vivi / morti colorazione. Questi metodi sono stati recentemente adattato e utilizzato per confrontare la tossicità dei compositi dentali a base di monomeri di metacrilato 11.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il protocollo consiste di tre fasi principali: la prima fase comprende la preparazione dell'estratto composito di coltura; la seconda riguarda la primaria gengivali umani fibroblasti (HGF) coltura cellulare, il contatto delle cellule con estratti compositi e colorazione delle cellule; il terzo passo consiste confocale e l'analisi del segnale fluorescente. Per i tessuti gengivali prendere, il protocollo è stato approvato in conformità con la legislazione francese, il consenso informato e del comitato etico locale.

1. composito Estratti Preparazione

Utilizzare modificato medie Aquila Dulbecco (DMEM) come mezzo di eluizione. Assicurarsi che il rapporto tra la superficie dei campioni e il volume del mezzo di estrazione è al livello più basso dei requisiti ISO 10993/12. La procedura è descritta di recente 11 e descritto brevemente qui di seguito:

  1. Formare campioni sferici del composito dentale non polimerizzato utilizzando una presa su misuraER. La dimensione del supporto è di 2 mm di raggio, che è in accordo con la profondità di polimerizzazione generalmente consigliata nel trattamento clinico orale.
  2. Preparare pozzetti della piastra, contenenti ciascuna 1 ml di terreno di coltura (DMEM), con una miscela al 5% di penicillina / streptomicina e 1% di amfotericina ma senza siero bovino fetale (FBS).
  3. Campioni Cure all'interno del pozzetto contenente mezzo DMEM con una lampada a luce LED con un cm -2 intensità di 1.070 mW (λ = 465-475 nm) per 40 sec. Assicurarsi che la distanza tra la punta e la polimerizzazione dei campioni è nel range di 0,5 mm. Utilizzare questa modalità di polimerizzazione per simulare il contatto temporaneo tra dente e il composito dentale non polimerizzato. Nella situazione clinica, il contatto si verifica quando il composito da restauro viene inserito nella cavità orale.
  4. Incubare campioni (campioni compositi in terreno DMEM) a 37 ° C in atmosfera umidificata al 5% di CO 2 in aria. Incubare terreno DMEM (senza campioni compositi) per le cellule di controllo nelle stesse condizioni.

2. HGF coltura cellulare, Composite Estratti Test e Celle di colorazione

  1. Crescita e mantenimento di colture cellulari
    Isolare fibroblasti gengivali umani provenienti da biopsie dei tessuti gengivali sani di pazienti scattate durante estrazioni ortodontiche di routine.
    1. Coltivazione fibroblasti gengivali umani in DMEM in presenza del 10% FBS, 5% di penicillina / streptomicina e 1% Amfotericina B. mantenere le cellule a 37 ° C in incubatore in atmosfera umidificata al 5% di CO 2 in aria.
    2. Medie cambiata ogni 3 giorni, e le cellule di passaggio ogni 5 giorni. Dopo aver raggiunto confluenza, le cellule raccolto da tripsinizzazione.
    3. Centrifugare le cellule a 90 xg per 5 min e risospendere nel mezzo di coltura. Conteggio delle cellule con un contatore di cellule scettro palmare automatizzato.
    4. Sospensione cellulare Seed ad una densità cellulare di 2,5 x 10 4 cellule / ml in un sistema di scorrimento della camera. Consentire l'incubazione delle cellule durante la notte a 37 ° C in atmosfera al 5%.
  2. L'aggiunta di estratti compositi alle cellule in coltura
    1. Sostituire i supporti dei due pozzi della slitta della camera da 1 ml di estratti composti testati (dopo 24 ore di incubazione).
    2. Mantenere i due pozzetti rimanenti (cellule di controllo) nelle stesse condizioni.
    3. Incubare il vetrino camera contenente i quattro pozzetti a 37 ° C in incubatore, in atmosfera umidificata al 5% di CO 2 in aria.
  3. Colorazione fluorescente
    Utilizzare la macchia citotossicità Live / Dead cellule eucariotiche in base alle istruzioni del produttore.
    NOTA: il kit prevede un test di fluorescenza a due colori veloce per determinare la vitalità delle cellule in una popolazione sulla base di integrità della membrana plasmatica e l'attività esterasi. La macchia distingue in diretta da cellule danneggiate mediante l'etichettatura in contemporanea con verde fluorescente calceina-AM per indicare l'attività esterasi intracellulare e rosso fluorescente etidio omodimero-1 (EthD-1) per indicare la perdita di Membrane integrità.
    1. Preparare una soluzione di lavoro dei due reagenti di colorazione contenente 2 mM di calceina AM e 4 mM EthD-1 (concentrazione finale segnalato per essere adatto per fibroblasti colorazione). Aggiungere la macchia alle cellule aderenti in coltura in presenza o assenza dei composti estratti selezionati.
    2. Osservare direttamente e rapidamente le popolazioni di cellule colorate al almeno 15 minuti dopo colorazione e attraverso il time-lapse imaging. Non centrifugare e non fixe le cellule colorate.

3. confocale Time Lapse Imaging e analisi del segnale

Il sistema utilizzato è dotato di un quattro unità laser a diodi e un'immagine multi-tinto per un massimo di quattro coloranti fluorescenti per ciascun campione. Il sistema può eseguire una mappatura un'immagine (ingrandimento 10X) che fornisce una panoramica del campione su cui si può muovere per osservare una regione di interesse (600X ingrandimenti).

  1. Tempo di imaging lapse
    1. Posizionare le specimens (la diapositiva camera contenente i campioni colorati) sulla stanza buia dell'incubatore integrato confocale (37 ° C, 5% di CO 2 e atmosfera umida).
    2. Selezionare i laser corrispondenti. Utilizzare le due sorgenti laser 473 nm (15 mW) e 559 nm (18 mW) per eccitare Calceina e EthD-1.
    3. Utilizzare una modalità a due sequenziale di acquisire immagini attraverso sequenze di linea senza crosstalk nella diagnostica per immagini con i due coloranti fluorescenti usati.
    4. Utilizzare un rivelatore con uno spettro di nuova concezione per impostare automaticamente le condizioni in conformità con il colorante fluorescente in unità di scansione.
    5. Ottimizzare le larghezze di banda di fluorescenza rilevata per ogni canale al massimo. Registra tutte le acquisizioni in sequenza per evitare il potenziale di cross-talking.
    6. Selezionare le condizioni di imaging più adatte in base alla selezione colorante fluorescente utilizzando il software di acquisizione.
    7. Acquisire un'immagine di mappa che viene creata automaticamente dal centro, in un percorso a spirale,con l'area di interesse essere facilmente selezionati per un esame più approfondito.
    8. Selezionare la modalità di osservazione. Selezionare fino a cinque tipi di modalità di osservazione, tra cui time-lapse, Z-stack, e multi-zona a seconda delle necessità. Utilizzare una combinazione di modi time-lapse Z-stack e nel presente studio e completare rapidamente l'acquisizione di immagini,
    9. Modificare e cambiare il colorante fluorescente. In alternativa, sovrapporre la fluorescenza e le immagini a contrasto di luce con l'altro. Osservare l'immagine dal vivo con il punto selezionato sulla schermata della mappa in basso a sinistra.
    10. Determinare l'area di esposizione utilizzando l'inquadratura e le funzioni di zoom. Facoltativamente, passare tra le visualizzazioni per ogni tipo di fluorescenza del colorante.
      NOTA: Il microscopio utilizzato in questo protocollo ha la stessa funzionalità di alto confocale tradizionale in un design compatto. Il microscopio è dotato di obiettivi di acqua-immersion invertiti considerate ottimali per stabile time-lapse imaging di cellule vive con un incubatore built-in semplificato.
  2. Analisi del segnale e quantificazione
    1. Utilizzare il software di imaging per quantificare il segnale di fluorescenza. Ottenere cinque immagini mappa con l'obiettivo 10X sia testato campione e cellule di controllo.
    2. Ottenuto 1.024 × 1.024 pixel immagini regolari, con una dimensione di 0,231 micron × 0,231 micron pixel. Memorizzare immagini come Formato Olympus immagine (OIF) per l'analisi dei segnali. Questo formato consente di memorizzare varie impostazioni dei parametri e le immagini insieme. Utilizzare diversi strumenti di analisi (misura del profilo di intensità, rapporto di intensità tra i due canali utilizzati).
    3. Conservare le immagini di proiezione massime come file TIFF a 12 bit / pixel.
    4. Preforme analisi statistiche utilizzando il software comandante R. Analizzare le differenze con l'analisi a senso unico della varianza (ANOVA) con un test di ripetizione. Riportare i risultati come media deviazione standard (± SD) e significatività statistica p <0.05.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La figura 1 mostra una panoramica dei morti cellule vive / colorate nelle immagini ottenute mappatura (obiettivo 10 volte) sia per il controllo e cellule esposte agli estratti composti testati (ELS bassissima ritiro). La struttura tridimensionale delle cellule può essere visualizzato alla 600X ingrandimento. Visualizzazione di cellule raccolte nella camera di controllo e di cellule raccolte nella camera alla presenza degli estratti compositi testati è presentato nella figura 2. La sporgenza massima (obiettivo 60X) mostra il destino di popolazioni cellulari selezionate all'inizio del time lapse (a 15 min) e alla fine del periodo di intervallo di tempo (in 5 ore). Cinquanta sette pile di immagini (xyzt scansione mod, 39 immagini per ogni stack, voxel-profondità 1,00 micron) sono stati ottenuti in questo periodo. Una leggera diminuzione del segnale fluorescente verde e molto leggera variazione nella fluorescenza rossa sono stati ottenuti in cellule esposte. Nessuna variazione significativa è stata osservata per il controllocellule. Cellule estratti esposte compositi assunto simile morfologia del mandrino alle cellule di controllo; morfologia non è stata alterata in queste condizioni sperimentali (nonostante la diminuzione segnale verde e l'aumento del segnale rosso in presenza del composto testato). L'analisi delle immagini è stata eseguita su cinque diversi stack di immagini selezionate corrispondenti alle diverse popolazioni cellulari delle immagini ottenute per il composito testato rispetto alle cellule di controllo negativo per il segnale verde e rosso. Il profilo di intensità di cellule colorate è illustrato nella figura 3; l'evoluzione segnale verde e rosso delle cellule a contatto con il composito testato era paragonabile a quelli di cellule di controllo. Calceina e EthD-1 fluorescenza intensità di emissione sono stati misurati in cellule di controllo e in cellule esposte compositi. La misurazione è stata eseguita a intervalli di un ora per fino a cinque ore. Il rapporto verde / rosso di fluorescenza (sulla base di intensità integrata del verde 495-515 nm e 620-650 rossi segnali nm) È stata calcolata durante il periodo di time-lapse. Gli indici di redditività per il controllo e cellule esposte a ELS estratti bassissima contrazione sono mostrati in grado T 1. In presenza del composito testato, la percentuale di cellule vive è stato trovato per diminuire leggermente dal 100% al 93,9% dopo 1 ora di contatto. Differenza significativa è stata osservata tra il composito testato e il controllo negativo (cellule senza estratti compositi) dopo 5 ore del periodo di time-lapse indicato.

figure-results-1
Figura 1: Panoramica immagine mappatura delle cellule ha mostrato macchiato di obiettivo 10X, (A), le cellule di controllo e (B), le cellule in presenza di estratti compositi (ELS bassissima contrazione) per l'inizio del periodo di intervallo di tempo (t = 15 min). Le aree verdi sono cellule vive e zone rosse sono le cellule danneggiate. In questocondizioni sperimentali, nessuna variazione (sia per fluorescenza verde e rosso) è stato osservato per compositi esposti cellule rispetto alle cellule di controllo negativo.

figure-results-2
Figura 2: immagini CLSM a obiettivo 60X di una popolazione di cellule da (A) e la camera di controllo (B) estratti compositi camera all'inizio e alla fine del periodo di esposizione time-lapse (I: 15 min e II: 5 ore, rispettivamente, ). Le aree verdi sono cellule vive e zone rosse sono le cellule danneggiate. Il pannello delle immagini dimostrata leggero cambiamento nel segnale di intensità (leggera diminuzione del segnale verde e molto leggero aumento quello rosso). Nessuna alterazione morfologia cellulare sono stati osservati in presenza di estratti compositi; esporre le cellule mantenuto la loro morfologia a forma di fuso e fibroblastica come cellule di controllo.


Figura 3: Profilo Linea di cellule osservate in microscopia time-lapse cellule (A) di controllo (B), le cellule estratti composito a vista, (I) a 15 min e (II) a 5 ore.. Nessuna variazione visibile nell'evoluzione segnale verde in presenza del composto testato indipendentemente dal tempo di contatto. Tuttavia, leggero aumento del segnale rossa è stata osservata in presenza del composto dopo 5 ore di contatto.

Tempo di contatto (ora) Vitalità cellulare (%)
1 2 3 4 5
Cellule di controllo 100 100 100 100 100
ELS in più basso ritiro ® 93.9 ± 7 91,3 ± 5 * 89.5 ± 3 * 87,6 ± 2 * 87,7 ± 3 *

Tabella 1:. Corsi dal vivo HGF cellule evoluzione dopo 1, 2, 3, 4 e 5 ore di contatto con gli estratti di compositi La vitalità cellulare è stata valutata mediante colorazione utilizzando il kit di citotossicità Live / Dead. I dati mostrano i valori medi ± DS di cinque immagini stack analisi. I valori sono significativamente diversi da cellule di controllo con p <0,05.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Comportamento del materiale biocompatibilità è il parametro più prerequisito per essere valutato prima uso medico. Norme internazionali riguardano dispositivi medici ISO 10993 33 e in particolare materiali dentali ISO 7405 34. L'assenza di effetti tossici alle cellule circostanti è la norma chiave nella valutazione biocompatibilità di tali materiali. Ecco perché i test di citotossicità ha tale importanza nella valutazione del materiale dentale biocompatibilità 35-37. L'ISO ha suggerito metodi di prova possono essere basati sull'attività metabolica o l'integrità della membrana. Endpoint selezionati devono seguire specifiche condizioni di Classifica effetti negativi indotti da un materiale di prova in modo da minimizzare il tempo e il costo dei test di valutazione. L'attuale metodo di indagine (3D tempo confocale lapse) è l'integrità della membrana base. La valutazione di citotossicità tramite questo endpoint sembra essere un valido indicatore di biocompa cellularepatibilità con materiali testati ed è anche ISO approvato endpoint. In vitro test sono progettati per determinare come un campione di materiale riguarda un particolare tipo di cellula. Il saggio colorimetrico MTT è stato originariamente descritto da Mossman (1983) come un metodo utile per la misura della citotossicità in vitro e proliferazione cellulare. Il test MTT è basato sulla conversione del sale di tetrazolio in cristalli di formazano dalle cellule attive, che determina l'attività mitocondriale. Questo può essere tradotto dal tasso vitalità 38. Gupta e collaboratori hanno riportato che il test MTT è il metodo più utilizzato per misurare la citotossicità delle resine composite. Succinico deidrogenasi e le risposte di fosfatasi alcalina sono stati utilizzati anche per lo stesso scopo 39. Tuttavia, le cellule destino non possono essere seguiti, poiché il saggio MTT richiede uccidere le cellule in ogni punto di misura. Per monitorare più da vicino il comportamento delle cellule colorate in questo studio, diè stata effettuata l'osservazione rect di cellule vive, grazie al tempo di imaging lasso CLSM combinato con una breve colorazione protocollo, l'analisi automatica di immagini e la quantificazione del segnale fluorescente.

Compositi dentali entrano in stretto contatto con i tessuti orali, in particolare le cellule gengivali e pulpari. I fibroblasti potrebbero essere bersaglio di componenti rilasciati da questi compositi da restauro 40-41. Inoltre, diversi studi hanno riportato che le cellule immortali e le cellule primarie possono avere diverse risposte cellulari a contatto con biomateriali. Cellule primarie sono risultati essere più opportuno valutare biomateriali effetti 42. Questo spiega l'uso di cellule di fibroblasti gengivali umani primari come modello cellulare per valutare la citotossicità del composito dentale testati in questo studio. Il potenziale tossicità delle sostanze rilasciate dal composito dentale è stato ampiamente studiato 43-44. Per valutare tegli citotossica potenziale dei materiali, due celle modello di contatto potrebbe essere eseguita. Nel sistema modello diretto contatto il materiale viene posto direttamente con le cellule bersaglio mentre nel sistema contatti indiretti, le cellule bersaglio sono in contatto con eluisce da supporti biologica. Nelle applicazioni cliniche e per le procedure di restauro, composito dentale sono messi in contatto diretto con i tessuti gengivali. Per questo motivo, il protocollo sperimentale attuale è focalizzata sul sistema di contatto indiretto con fibroblasti gengivali umani (cellule in presenza di estratti composti testati). Come precedentemente riportato da Dahl e collaboratori, le risposte di citotossicità sono stati classificati come gravi (<30%), moderata (30-60%), leggero (60-90%) o non-citotossico (> 90%) in base alla relativa attività di valori ottenuti per i controlli 45. Pertanto, secondo questa classifica e alla luce dei risultati ottenuti (Tabella 1), composito ELS bassissima ritiro può essere classificato come very leggermente citotossici e ha mostrato un comportamento simile alle cellule di controllo durante l'intero periodo di lasso di tempo. Utilizzando il proprio stesso metodo di indagine, i risultati di questo studio potrebbero essere paragonate a quelle di uno studio recente pubblicato. L'ELS bassissima ritiro composito dimostrato biocompatibilità superiore rispetto ai due composti precedentemente testati utilizzati per la stessa applicazione clinica che è la restaurazione diretta 11. Ulteriori studi sono ancora necessari per stabilire più completo confronto.

Al momento di decidere che citotossicità test per l'approvazione di una valutazione specifica endpoint, è importante capire i vantaggi ei limiti di ogni test. Lo scopo principale della confocale è realizzare un'architettura 3-D di cellule e organi. La tecnica è in grado di rivelare non solo la superficie di un campione, ma anche la sua sottosuolo. Il protocollo qui descritto evidenzia l'uso del 3D CLSM tempo di imaging lapse confocale, come SensiMetodo tivo per valutare il comportamento di biocompatibilità in vitro di un composito dentale. Tuttavia, al fine di evitare le limitazioni incontrate in questo lavoro, workstation antivibranti potrebbero essere utilizzati al fine di consentire l'imaging più stabile e più lungo periodo; il piano del tavolo potrebbe isolare il sistema confocale utilizzato dagli effetti dannosi che le vibrazioni in laboratorio possono causare. Inoltre, i materiali da utilizzare nella cavità orale dovrebbe idealmente essere innocuo per i tessuti gengivali e non devono contenere sostanze che potrebbero causare tossicità sistemica. Conformemente alla metodologia utilizzata ed i risultati ottenuti dal presente studio si può concludere che il composto testato (ELS bassissima ritiro) non è citotossica nelle presenti condizioni sperimentali. Dato che il metodo CLSM può dare sensibilmente il tasso iniziale di cellule vitali, altre possibilità potrebbero prevedere per valutare più endpoint. In particolare, come è stato recentemente riportato che i monomeri compositi colpiscono le cellule thrOugh specie reattive dell'ossigeno (ROS) 46- 48, sono necessarie ulteriori indagini per valutare le correlazioni eventuale citotossicità tra le reti e la produzione di ROS segnalazione. Il protocollo futuro potrebbe essere progettato per valutare contemporaneamente la produzione di ROS (H 2 O 2 e / o O 2 - colorazione) e il rapporto di citotossicità (Live colorazione / morti) con tempo di imaging lasso CLSM.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti, non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le aziende Saremco Dental Switzerland e Olympus Microsystems France sono grate per il loro sostegno finanziario. Saremco Dental è anche riconosciuta per la generosa donazione dei compositi dentali ELS a bassissimo restringimento. Gli autori desiderano inoltre esprimere il loro apprezzamento al dottor Simon Banks del dipartimento di Chimica (University College London) per la sua assistenza nella revisione dell'inglese.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Olympus Fluoview FV10i Microscopio confocaleOlympus
O2/CO2 IncubatorePnasonicMCO 5MIncubazione cellulare
Kit vivo/mortoInvitrogen MP 03224Macchia
ELS a bassissimo ritiro  SaremcoComposito dentale
DMEM medioSigmaD 6046Terreno di coltura
TripsinaSigmaT1426sistema di scorrimento a camera delle cellule di raccolta
   PAA14220040XCamera di coltura
penicillina/streptomicinaPAAP11-010Coltura cellulare
Amfotericina BPAAP11-001Coltura cellulare
Siero fetale bovino PAAA11-101Contatore
di celluleMerck Millipore00110230TP1Conteggio delle cellule 
per colture cellulari

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Van Landuyt, K. L., et al. How much do resin-based dental materials release? A meta-analytical approach. Dent. Mater. 27 (8), 723-747 (2011).
  2. Moharamzadeh, K., Van Noort, R., Brook, I. M., Scutt, A. M. Cytotoxicity of resin monomers on human gingival fibroblasts and HaCaT keratinocytes. Dent. Mater. 23 (1), 40-44 (2007).
  3. Santerre, J. P., Shajii, L., Leung, B. W. Relation of dental composite formulations to their degradation and the release of hydrolyzed polymeric-resin-derived products. Crit. Rev. Oral Biol. Med. 12 (2), 136-151 (2001).
  4. Geurtsen, W. Biocompatibility of resin-modified filling materials. Crit. Rev. Oral Biol. Med. 11 (3), 333-355 (2000).
  5. Hensten-Pettersen, A. Skin and mucosal reactions associated with dental materials. Eur. J. Oral Sci. 106 (2), 707-712 (1998).
  6. Paranjpe, A., Sung, E. C., Cacalano, N. A., Hume, W. R., Jewett, A. N-acetyl cysteine protects pulp cells from resin toxins in vivo. J. Dent. Res. 87 (6), 537-541 (2008).
  7. Falconi, M., Teti, G., Zago, M., Pelotti, S., Breschi, L., Mazzotti, G. Effects of HEMA on type I collagen protein in human gingival fibroblasts. Cell. Biol. Toxicol. 23 (5), 313-322 (2007).
  8. Jontell, M., Hanks, C. T., Bratel, J., Bergenholtz, G. Effects of unpolymerized resin components on the function of accessory cells derived from the rat incisor. 74 (5), 1162-1167 (1995).
  9. Urcan, E., Scherthan, H., Styllou, M., Haertel, U., Hickel, R., Reichl, F. -X. Induction of DNA double-strand breaks in primary gingival fibroblasts by exposure to dental resin composites. Biomaterials. 31 (8), 2010-2014 (2010).
  10. Sigusch, B. W., et al. Resin-composite cytotoxicity varies with shade and irradiance. 28 (3), 312-319 (2012).
  11. Attik, G. N., Pradelle-Plasse, N., Campos, D., Colon, P., Grosgogeat, B. Toxicity Evaluation of Two Dental Composites: Three-Dimensional Confocal Laser Scanning Microscopy Time-Lapse Imaging of Cell Behavior. Microsc. Microanal. 19, 596-607 (2013).
  12. Ausiello, P., et al. Cytotoxicity of dental resin composites: an in vitro evaluation. J. Appl. Toxicol. 33 (6), 451-457 (2011).
  13. Durner, D., Obermaier, J., Draenert, M., Ilie, N. Correlation of the degree of conversion with the amount of elutable substances in nano-hybrid dental composites. Dent. Mat. 28 (11), 1146-1153 (2013).
  14. Sigusch, B. W., Völpel, A., Braun, I., Uhl, A., Jandt, K. D. Influence of different light curing units on the cytotoxicity of various dental composites. Dent. Mater. 23 (11), 1342-1348 (2007).
  15. Knezevic, A., Zeljezic, D., Kopjar, N., Tarle, Z. Influence of curing mode intensities on cell culture cytotoxicity/genotoxicity. Am. J. Dent. 22 (1), 43-48 (2009).
  16. Krifka, S., Seidenader, C., Hiller, K. -A., Schmalz, G., Schweikl, H. Oxidative stress and cytotoxicity generated by dental composites in human pulp cells. Clin. Oral Investig. 16 (1), 215-224 (2012).
  17. Harorli, O. -T., Bayindir, Y. -Z., Altunkaynak, Z., Tatar, A. Cytotoxic effects of TEGDMA on THP-1 cells in vitro. Med. Oral Patol. Oral Cir. Bucal. 14 (9), 489-493 (2009).
  18. Reichl, F. X., et al. Cytotoxicity of dental composite (co)monomers and the amalgam component Hg(2+) in human gingival fibroblasts. Arch. Toxicol. 80 (8), 465-472 (2006).
  19. Aranha, A. M. F., Giro, E. M. A., Hebling, J., Lessa, F. C. R., Costa, C. A. deS. Effects of light-curing time on the cytotoxicity of a restorative composite resin on odontoblast-like cells. J. Appl. Oral Sci. 18 (5), 461-466 (2010).
  20. Schulz, S. D., König, A., Steinberg, T., Tomakidi, P., Hellwig, E., Polydorou, O. Human gingival keratinocyte response to substances eluted from Silorane composite material reveal impact on cell behavior reflected by RNA levels and induction of apoptosis. Dent. Mater. 28 (8), 135-142 (2012).
  21. Tadin, A., Marovic, D., Galic, N., Kovacic, I., Zeljezic, D. Composite-induced toxicity in human gingival and pulp fibroblast cells. Acta Odontol. Scand. 72 (4), 304-311 (2014).
  22. Schweikl, H., Schmalz, G. Toxicity parameters for cytotoxicity testing of dental materials in two different mammalian cell lines. Eur. J. Oral Sci. 104 (3), 292-299 (1996).
  23. Issa, Y., Watts, D. C., Brunton, P. A., Waters, C. M., Duxbury, A. J. Resin composite monomers alter MTT and LDH activity of human gingival fibroblasts in. 20 (1), 12-20 (2004).
  24. Brambilla, E., Gagliani, M., Ionescu, A., Fadini, L., García-Godoy, F. The influence of light-curing time on the bacterial colonization of resin composite surfaces. 25, 1067-1072 (2009).
  25. Modareszadeh, M. R., et al. Cytotoxicity of set polymer nanocomposite resin root-end filling materials. Int. Endod. J. 44, 154-161 (2011).
  26. Tamilselvam, S., Divyanand, M. J., Neelakantan, P. Biocompatibility of a conventional glass ionomer, ceramic reinforced glass ionomer, giomer and resin composite to fibroblasts: in vitro study. J. Clin Pediatr. Dent. 37 (4), 403-406 (2013).
  27. White, J. G., Amos, W. B., Fordham, M. An evaluation of confocal versus conventional imaging of biological structures by fluorescence light microscopy. J. Cell Biol. 105 (1), 41-48 (1987).
  28. Alpino, P. H. P., Pereira, J. C., Svizero, N. R., Rueggeberg, F. A., Pashley, D. H. Use of fluorescent compounds in assessing bonded resin-based restorations: a literature review. J. Dent. 34 (9), 623-634 (2006).
  29. Chen, Y., Liang, C. -P., Liu, Y., Fischer, A. H., Parwani, A. V., Pantanowitz, L. Review of advanced imaging techniques. J. Pathol. Inform. 3, 22(2012).
  30. Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. C. Advanced Fluorescence Microscopy Techniques—FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).
  31. Stoddart, M. J., Furlong, P. I., Simpson, A., Davies, C. M., Richards, R. G. A comparison of non-radioactive methods for assessing viability in ex vivo cultured cancellous bone: technical note. Eur. Cell Mater. 12, 16-25 (2006).
  32. Louvet, J. N., Attik, G., Dumas, D., Potier, O., Pons, M. N. Simultaneous Gram and viability staining on activated sludge exposed to erythromycin: 3D CLSM time-lapse imaging of bacterial disintegration. Int. J. Hyg. Environ. Health. 214 (6), 470-477 (2011).
  33. Dentistry - Preclinical evaluation of biocompatibility of medical devices used in dentistry - Test methods for dental materials. International Standards Organization. , (2009).
  34. Biological evaluation of dental devices. International Standards Organization. , (2009).
  35. Elshahawy, W. M., Watanabe, I., Kramer, P. In vitro cytotoxicity evaluation of elemental ions released from different prosthodontic material. Dent. Mater. 25 (12), 1551-1556 (2009).
  36. Williams, D. F. On the mechanisms of biocompatibility. Biomaterials. 29 (20), 2941-2953 (2008).
  37. Illeperuma, R. P., et al. Immortalized gingival fibroblasts as a cytotoxicity test model for dental materials. J. Mater. Sci. Mater. Med. 23 (3), 753-762 (2012).
  38. Wataha, J. C., Lockwood, P. E., Bouillaguet, S., Noda, M. In vitro biological response to core and flowable dental restorative materials. Dent. Mater. 19 (1), 25-31 (2003).
  39. Ergun, G., Egilmez, F., Yilmaz, S. Effect of reduced exposure times on the cytotoxicity of resin luting cements cured by high-power led. J. Appl. Oral Sci. 19 (3), 286-292 (2011).
  40. Yap, A. U., Han, V. T., Soh, M. S., Siow, K. S. Elution of leachable components from composites after LED and halogen light irradiation. Operative Dentistry. 29 (4), 448-453 (2004).
  41. Lee, S. Y., Greener, E. H., Menis, D. L. Detection of leached moieties from dental composites in fluids stimulating food and. 11 (6), 348-353 (1995).
  42. Anselme, K., Davidson, P., Popa, A. M., Giazzon, M., Liley, M., Ploux, L. The interaction of cells and bacteria with surfaces structured at the nanometre scale. Acta Biomateriala Journa. 6 (10), 3824-3846 (2010).
  43. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol. Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
  44. Gupta, S. K., Saxena, P., Pant, V. A., Pant, A. B. Release and toxicity of dental resin composite. Toxicol. Int. 19 (3), 225-234 (2012).
  45. Dahl, J. E., Frangou-Polyzois, M. J., Polyzois, G. L. In vitro biocompatibility of denture relining materials. Gerodontology. 23 (1), 17-22 (2006).
  46. Krifka, S., Seidenader, C., Hiller, K. A., Schmalz, G., Schweikl, H. Oxidative stress and cytotoxicity generated by dental composites in human pulp cells. Clin. Oral Investig. 16 (1), 215-224 (2012).
  47. Krifka, S., Spagnuolo, G., Schmalz, G., Schweikl, H. A review of adaptive mechanisms in cell responses towards oxidative stress caused by dental resin monomers. Biomaterials. 34 (19), 4555-4563 (2013).
  48. Chang, M. C., et al. The role of reactive oxygen species and hemeoxygenase-1 expression in the cytotoxicity, cell cycle alteration and apoptosis of dental pulp cells induced by BisGMA. Biomaterials. 31, 8164-8171 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Confocal Time Lapse ImagingDental Composite BiocompatibilityHuman Gingival FibroblastsLive Dead Staining3D CLSM ImagingCytotoxicity AssessmentFluorescent Signal AnalysisCell Viability MeasurementComposite Extract PreparationMaximal Projection Images

Related Articles