La pelle adulta di C. elegans è un modello trattabile per gli studi sulle risposte epiteliali delle ferite, tra cui la chiusura delle ferite, la formazione di cicatrici e l'immunità innata.
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Articolo metodologico
Metodi per la pelle Ferimento e saggi per risposte ferita C. elegans
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il C. elegans epidermide e cuticola formano uno strato di pelle ma sofisticato semplice che può riparare i danni localizzati derivanti da ferire. Studi di risposte ferita e riparazione di questo modello hanno illuminato la nostra comprensione del citoscheletro e risposte genomiche per danni ai tessuti. I due metodi più comunemente usati per la ferita C. elegans pelle adulta sono punture con aghi microiniezione e irraggiamento laser locale. Ago ferendo localmente interrompe la cuticola, epidermide, e matrice extracellulare associati, e può anche danneggiare i tessuti interni. Risultati irradiazione laser a danni più localizzato. Ferimento innesca una serie di reazioni prontamente analizzati, tra cui elevata epidermica Ca 2+ (secondi minuti), la formazione e la chiusura di un anello-actina contenenti presso il sito della ferita (1-2 ore), elevata la trascrizione di geni peptidi antimicrobici (2-24 hr), e formazione di cicatrici. In sostanza tutti gli animali adulti wild type sopravvivono ferimento, dovecome mutanti difettose nella riparazione delle ferite o altre risposte mostrano ridotta sopravvivenza. Vengono presentati i protocolli dettagliati per ago e il ferimento laser, e saggi per la quantificazione e la visualizzazione delle risposte della ferita e dei processi di riparazione (dinamica Ca, dinamiche actina, induzione peptide antimicrobico, e la sopravvivenza).
Introduzione
Pelle ferita meccanismi di guarigione sono di interesse biologico di base e rilevanti per la salute umana. La guarigione delle ferite nei vertebrati e mammiferi comprende una complessa serie di risposte coordinate di diversi tessuti e di segnalazione 1. Molti semplici organismi modello genetico sono anche in grado di guarire le ferite della pelle 2. È quindi interessante analizzare modelli geneticamente trattabili di riparazione delle ferite della pelle. Noi e altri abbiamo iniziato a utilizzare Caenorhabditis elegans come nuovo modello per la pelle ferita guarigione 3,4. L'obiettivo di questo protocollo è quello di conse....
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Protocollo
I seguenti protocolli descrivono la procedura dettagliata per C. pelle elegans ferendo e per saggiare le risposte ferite.
1. Ago Ferimento 3,4
- Crescere vermi unstarved sani sullo standard NGM (terreno di crescita nematode) piatti con E. batteri coli OP50 come cibo, mantenute in un incubatore a 20 °.
NOTA: I metodi per piastre di agar NGM e la coltivazione di routine di C. elegans può essere trovato alla www.wormbook.org 6. - Scegli 25 L4 vermi stadio ad un appena seminato piatto 1 giorno prima ferendo e cultura a 20 ° CO / N.
- Prima di fe....
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Risultati
Laser o ago ferimento attiveranno elevazione rapida e sostenuta in epidermiche livelli di Ca, come visualizzato con sensori Ca quali GCaMPs (Figura 1). L'elevazione Ca avviene in pochi secondi, e rimane elevata per decine di minuti. Needle ferendo riproducibile provoca la formazione di anelli F-actina in siti ferita (Figura 2); queste appaiono in pochi minuti, e gradualmente vicino oltre 1-2 ore dopo il ferimento. Anelli actina sono meno spesso si formano dopo più preciso ferimento lase.......
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Discussione
I metodi qui presentati per ago e ferimento laser offrono approcci complementari di valutazione della capacità dell'epitelio epidermica per riparare i danni. Ferimento laser è relativamente localizzato e (a seconda della configurazione laser) può essere limitato l'epidermide, mentre ferimento ago sconvolge l'epidermide, cuticola, e probabilmente membrane basali interni. Ago ferimento può assomigliare più accuratamente le ferite inflitte da agenti patogeni o danni meccanici in ambiente naturale. Come regola, .......
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Dichiarazioni
Gli autori non sono a conoscenza di interessi concorrenti.
Ringraziamenti
I metodi di feritura con ago per C. elegans sono stati sviluppati per la prima volta da Nathalie Pujol e Jonathan Ewbank; ringraziamo Nathalie Pujol per i commenti sul manoscritto. Il lavoro nel nostro laboratorio sulla riparazione delle ferite epidermiche di C. elegans è supportato da una sovvenzione del NIH all'A.D.C. (R01 GM054657).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Agarosio | Denville Scientific | CA3510-8 | |
| Piastra di Petri in plastica | Tritech Research | T3308 | 60 mm |
| Levamisole | Sigma | L9756 | 12 mM |
| Capillare in vetro borosilicato | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Estrattore ad ago | Sutter Instrument | P-2000 | |
| Worm pick (filo di platino) | Soluzione Tritech Research | PT-9010 | |
| M9 | Fatto in | 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O a 1 litro. Sterilizzare in autoclave | |
| Trizol | Invitrogen | 15596026 | Utilizzare 500 ml per 50 vermi |
| iQ SYBR Green | Bio-Rad | 1708882 | |
| SuperScript III | Invitrogen | 18080-051 | |
| Macchina per PCR | Bio-Rad | C1000/CFX96 | |
| Provette per PCR a 96 pozzetti | Bio-Rad | MLL9601 | |
| Software di analisi delle immagini | Dispositivi molecolari | Metamorph |
Riferimenti
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453, 314-321 (2008).
- Sonnemann, K. J., Bement, W. M. Wound repair: toward understanding and integration of single-cell and multicellular wound responses. Annu Rev Cell Dev Biol<....
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Ristampe e permessi
