La ghiandola lacrimale (LG) è un organo di ramificazione che produce i componenti acquose di lacrime necessarie per il mantenimento della visione e la salute oculare. Qui si descrive murino LG dissezione ed ex vivo le tecniche di coltura di decifrare vie di segnalazione coinvolte nello sviluppo di LG.
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Articolo metodologico
Manipolare il murino Ghiandola lacrimale
In questo articolo
Sommario
Abstract
La ghiandola lacrimale (LG) secerne lacrime acquose necessari a mantenere la struttura e la funzione della cornea, un tessuto trasparente essenziale per la visione. Nell'essere umano un'unica LG risiede nella orbita sopra l'estremità laterale di ciascun occhio fornire lacrime alla superficie oculare attraverso 3 - 5 condotti. Il mouse ha tre paia di ghiandole oculari, il più studiato dei quali è la ghiandola lacrimale exorbital (LG) anterior posizionato e ventrale all'orecchio. Simile ad altri organi ghiandolari, LG si sviluppa attraverso il processo di morfogenesi epiteliale ramificazione in cui un singolo gemma epiteliale all'interno di un mesenchima condensato sottoposto a vari cicli di gemme e di formazione condotto da formare una rete interconnessa intricata di acini secretori e condotti. Questo processo elaborato è stato ben documentato in molti altri organi epiteliali come il pancreas e ghiandole salivari. Tuttavia, la LG è stata molto meno esplorati e meccanismi che controllano la morfogenesi sono poco sottoc'era. Abbiamo il sospetto che questo sotto-rappresentazione come sistema modello è una conseguenza delle difficoltà connesse con l'individuazione, la dissezione e la coltura della LG. Così, qui descriviamo tecniche di dissezione per la raccolta embrionale e post-natale LG e metodi di coltura ex vivo del tessuto.
Introduzione
La ghiandola lacrimale (LG) è responsabile della secrezione lacrimale acquoso critico per l'acuità visiva e la salute, la manutenzione e la protezione delle cellule della superficie oculare. LG risultati disfunzione in uno dei disturbi oculari più comuni e debilitanti: acquosa carente malattia dell'occhio secco, che è caratterizzata da irritazione oculare, sensibilità alla luce e riduzione della visione 1. Nell'essere umano LG risiede nell'orbita sopra dell'estremità laterale dell'occhio dove che 3 - 5 escrezione lacrime deposito condotti sulla superficie oculare. Il mouse ha tre paia di ghiandole oculari, il più studiato dei quali ....
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Protocollo
Tutto il lavoro degli animali sono state eseguite in stretta conformità con le raccomandazioni nella Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health. Il protocollo è stato approvato dalla cura e l'uso Comitato Istituzionale Animal (IACUC) della University of California, San Francisco.
1. embrionali di topo lacrimale Ghiandole (LG): Raccolta e Microdissection
- A seguito di procedure approvate dalle Animali istituzionali per comitato della ricerca scientifica etica, eutanasia cronometrato in gravidanza CD-1 (o transgenici) femmine con l'aumento della CO 2 inalazione, seg....
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Risultati
La LG si sviluppa attraverso il processo di morfogenesi epiteliale ramificazione. Immagini in campo chiaro di enti locali embrionali sezionati a E14, E15, E16, E17, e P2 illustrano questo evento.
Figura 1. L'LG si sviluppa attraverso il processo di morfogenesi epiteliale ramificazione. Immagini in campo chiaro di enti locali embr.......
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Discussione
La versatilità alla cultura e manipolare la LG ex vivo fornisce vantaggi significativi per lo studio del suo sviluppo. Ciò comprende la velocità alla quale il ricercatore è in grado di testare ipotesi e la moltitudine di perturbazioni che possono essere eseguite per valutare come epiteliale, neuronali, cellule endoteliali e mesencyhmal interagiscono per formare l'organo. Tuttavia, ci sono una serie di avvertimenti quando si utilizza questo modello. In primo luogo, in virtù del suo isolamento ghiandola non è.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare finanziamenti previsti dal Programma di allocazione delle risorse UCSF.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| DMEM/F12 senza HEPES | SH3027101 | Thermo Scientific | |
| Penicillina-Streptomicina | P0781 | Sigma-Aldrich | |
| Soluzione di albumina da siero bovino | A9576 | Sigma-Aldrich | |
| Paraformaldeide 16% Soluzione | 15710 | Microscopia elettronica | Diluito al 4% in 1x PBS |
| Soluzione salina tamponata con fosfato 10x | BP665-1 | Fisher Scientific | |
| salina tamponata con fosfato 1x | Preparato da 10x | ||
| stock olo-transferrina bovina T1283 | Sigma-Aldrich | 25 mg/ml di soluzione madre in acqua. Congelare le aliquote monouso a -20 °C. Aggiungere al supporto DMEM/F12 fino a una concentrazione finale di 50 μ g/ml. | |
| Acido L-ascorbico (Vitamina C) | A4544 | Sigma-Aldrich | 25 mg/ml di soluzione madre in acqua. Congelare le aliquote monouso a -20 °C. Aggiungere al supporto DMEM/F12 fino a una concentrazione finale di 50 μ g/ml. |
| Piastre trattate con coltura tissutale BioLite da 100 mm | 130182 | Thermo Scientific | possibile utilizzare anche piastre trattate con coltura non tissutale. |
| Stereomicroscopio con illuminatore a tavolino | secondario Stemi 2000 | Carl Zeiss | È possibile utilizzare qualsiasi microscopio da dissezione stereo dotato di base a luce trasmessa. |
| Base illuminatore sottostadio per stereomicroscopio | TLB 4000 | Diagnostics Instruments, Inc. | |
| Falcon 35 Piastre trattate con coltura tissutale mm | 353001 | Corning | È possibile utilizzare anche piastre trattate con coltura non tissutale. |
| Piastre con fondo in vetro non rivestito da 50 mm | P50G-1.5-14-F | MatTek Corporation | |
| Microscopio a fluorescenza a campo largo | Axio Observer Z1 | Carl Zeiss | Qualsiasi microscopio a fluorescenza (verticale, invertito o stereodissecante a microscopio) può essere utilizzato per monitorare l'espressione della GFP a basso ingrandimento con una fotocamera digitale collegata. |
| Microscopio confocale | TCS SP5 | Leica Microsystems | La microscopia confocale è necessaria per vedere le strutture cellulari dettagliate. È possibile utilizzare qualsiasi microscopio confocale. |
| Pinze SWISS Micro-Fine, #5 (11.2 cm) | 17-305X | Integra LifeSciences Corporation | Per rimuovere il mesenchima dall'epitelio sono necessarie punte fini. Possono essere utilizzati anche aghi di tungsteno. |
| Pinze a punta standard Dumont, #5 (11 cm) | 91150-20 | Strumenti per le scienze fini (USA), Inc. | Ideale per la raccolta di ghiandole da embrioni. |
| Manici di coltelli chirurgici in plastica riutilizzabili, stile n. 3. | 4-30 | Integra LifeSciences Corporation | |
| Lame chirurgiche sterili in acciaio inossidabile, n. 10 | 4-310 | Integra LifeSciences Corporation | |
| Kit di isolamento RNAqueous-Micro Total RNA | AM1931 | Life Technologies | |
| Cultrex 3D Culture Matrix Laminin I | 3446-005-01 | Trevigen | 6 mg/ml stock diluito 1:1 con DMEM/F12 |
| Timed-pregnant Crl:CD1(ICR) topi | Charles River Labs | Gli embrioni vengono raccolti il giorno 14 (con il giorno della scoperta della spina designato come giorno 0). | |
| Membrane idrofile incise con nucleopori, 0,1 μ m dimensione dei pori, 13 mm | 110405 | Whatman | |
| Timed-pregnant Pax6-Cre, topi GFP | Tg(Pax-Cre, GFP)1Pgr | The Jackson Laboratory | Topi opzionali per imparare a localizzare il LG. |
Riferimenti
- Liu, K. C., Huynh, K., Grubbs, J., Davis, R. M. Autoimmunity in the pathogenesis and treatment of keratoconjunctivitis sicca. Current allergy and asthma reports. 14, 403(2014).
- Makarenkova, H. P., et al. FGF10 is an inducer and Pax6....
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Ristampe e permessi
