Isolamento di cellule staminali mesenchimali umane e la loro coltivazione in poroso Bone Matrix

Sommario

Le cellule staminali mesenchimali (MSC) hanno un potenziale di differenziazione verso la linea osteoblastica quando vengono stimolate con fattori solubili o biomateriali specifici. Questo lavoro presenta una nuova opzione per la somministrazione di MSC dalla membrana amniotica umana (AM-hMSCs) che impiega la matrice ossea bovina Nukbone (NKB) come scaffold.

Abstract

Le cellule staminali mesenchimali (MSC) hanno un potenziale di differenziazione verso la linea osteoblastica quando vengono stimolate con fattori solubili o biomateriali specifici. Questo lavoro presenta una nuova opzione per la somministrazione di MSC dalla membrana amniotica umana (AM-hMSCs) che impiega la matrice ossea bovina Nukbone (NKB) come scaffold. Pertanto, l'applicazione delle MSC nei processi di riparazione e rigenerazione tissutale dipende principalmente dall'efficiente implementazione delle tecniche per posizionare queste cellule in un tessuto ospite. Per questo motivo, la progettazione di biomateriali e scaffold cellulari ha acquisito importanza negli ultimi anni perché le caratteristiche topografiche dello scaffold selezionato devono garantire l'adesione, la proliferazione e la differenziazione nel lignaggio cellulare desiderato nel microambiente del tessuto leso. Questa opzione per la somministrazione di MSC dalla membrana amniotica umana (AM-hMSCs) impiega la matrice ossea bovina come scaffold cellulare ed è una tecnica di coltura efficiente perché le cellule rispondono alle caratteristiche topografiche della matrice ossea bovina Nukbone (NKB), cioè diffondendosi sulla superficie, ricoprendo macroporosa e colonizzando la profondità del biomateriale, dopo il processo di isolamento cellulare. Presentiamo la procedura per l'isolamento e la coltura di MSC su matrice bovina.

Introduzione

Ci accoppiare e rigenerazione di tissuesis uno degli obiettivi themain della scienza medica perché una lesione in una ororgan tessuto può essere invalidante e, in alcuni casi, letali. Nel contesto, la salute dei lavoratori e dei ricercatori sono costantemente alla ricerca di tecniche, metodi e strumenti per fornire nuovo Alternative terapeutico promuovere ci processo paio-rigenerazione del tessuto danneggiato. Pertanto, le scienze biomediche sono concentrati sullo studio delle cellule staminali mesenchimali (MSC), in particolare le cellule staminali adulte, perché questa linea cellulare rappresenta un modello ideale per studiare il processo di rigenerazione dei tessuti, grazie alla sua capacità di differenziarsi a ectodermica, mesodermica, e endodermico linee cellulari Tuttavia, per rendere la terapia con cellule staminali mesenchimali una realtà, la caratterizzazione del potenziale thetherapeutic di MSC deve essere accompagnata dalla realizzazione di nuove tecniche di coltura cellulare utilizzando biomateriali e ponteggi cellulari che garantiscono il comportamento desiderato delle cellule staminali mesenchimali del tessuto ospite.

La sfida principale da superare nell'attuazione di una cultura con MSC nella rigenerazione ossea è quello di garantire l'adesione cellulare sul biomateriale selezionata, che presenta generalmente una struttura porosa con adistribution dei pori che variano da micrometri a millimetri sono stati impiegati ma spesso richiedono reagenti sofisticati, attrezzature e procedure che alterano il comportamento delle cellule. Queste procedure sono adatti per la stima in vitro, ma non per l'estrapolazione e implementazione in sistemi aperti complessi, come umano o in saggi in vivo. Tecniche che si concentrano sulla garanzia adesione delle cellule al topografie casuali, come materiali porosi ossee, sono stati studiati per l'adesione del materiale nei pozzetti di coltura e collageni e polimeri impiegati agarosio. Per questi metodi, le cellule che sono state seminate in superficie sono state conservate nei pori e sulla superficie superiore. Tuttavia, questo aspetto non può essere garantita in un in vivosistema, in cui i fluidi corporei che circondano il biomateriale potrebbe trascinare le cellule dal sito desiderato scaffold porosi è l'uso della stimolazione ad ultrasuoni, che richiede attrezzature sofisticate ma promuove l'espressione di marcatori osteoblastiche nei test in vitro ^5. L'uso di colture continue richiede bioreattori, che garantiscono una distribuzione omogenea dei nutrienti nel terreno di coltura; Tuttavia, una percentuale significativa delle cellule in coltura viene perso durante la sostituzione del mezzo di coltura a causa della portata che viene utilizzato in questa tecnica e l'adesione alle pareti mezzo dell'apparecchiatura. Questi problemi aumentano la massa cellulare che è necessario per questo tipo di coltura e il tempo per ottenere un numero sufficiente di cellule ^7. Così, il metodo presentato in questo lavoro rappresenta una tecnica che dovrebbe essere estrapolata a sistemi in vivo perché le cellule vengono seminate in micro-massa su un materiale superficie superiore, e dopo l'ademangiato tempi di incubazione, il 60% della massa cellulare iniziale sia rispettato. Inoltre, questa tecnica non richiede l'aggiunta di induttori osteoblastiche (p.es. desametasone, acido ascorbico, o beta-glicerofosfato) o stimoli ultrasuoni per indurre differenziazione osteoblastica e mantenimento del fenotipo osteoblasti perché NKB è un osteoconduttiva e ponteggi osteoinduttive ^8, il metodo per la cultura della MSC dalla membrana amniotica umana (AM-hMSCs) su biomateriali osso macroporosa presentato in questo representsapossibility lavoro per inserire cellule in tessuto osseo danneggiato e indurre la differenziazione alla stirpe osteoblastica.

Protocollo

Questa ricerca è stata effettuata in conformità con la dichiarazione dell'Associazione medica mondiale la di Helsinki per quanto riguarda la condotta etica della ricerca che coinvolge gli esseri umani ed è stato approvato dal Consiglio di Ricerca Etica Facultad de Medicina, UNAM (numero di progetto 101-2012).

1. Isolamento di mesenchimali umane Stem Cell

1. Preparazione di reagente
   1. Preparare la soluzione tampone fosfato salino (PBS) e supplemento con soluzione antibiotica-antimicotica 1%.
   2. Preparare Dulbecco Modified mezzo di Eagle, alto glucosio (HG-DMEM), e aggiungere il 10% di siero fetale bovino (FBS) e 1% solution.Sterilize antibiotico-antimicotico questo terreno di coltura per filtrazione con un filtro da 0,2 micron.
   3. Preparare una soluzione collagenasi II a 100 U / ml in HG-DMEM senza FBS o soluzione antibiotica-antimicotica.
   4. Sterilizzare i seguenti strumenti chirurgici, che sono necessari per l'isolamento, in autoclave: forbice di series, semplici dissettore, fine-point e pinza dentata e una maniglia bisturi (# 4).
2. L'isolamento di cellule staminali mesenchimali di membrana amniotica umana
   1. Tenere il cordone ombelicale con una mano e con l'altra mano, staccare la membrana amniotica (AM), che si presenta come un foglio trasparente, per ottenere un frammento di circa 5 cm ^2. Se la sezione corion è presente nel campione, separare il corion sottostante dalla dissezione manuale come sezione corion è più spesso del amnion.
   2. Rimuovere residui di sangue con tre lavaggi di 5 ml di PBS e rimuovere coaguli con semplici pinze. Fare un piccolo taglio al mattino con il bisturi per generare frammenti di circa 0,5 cm ^2.
3. Digestione enzimatica di membrana amniotica
   1. Incubare la AM con 5 ml di 0,125% tripsina / EDTA 0,5 mM soluzione a 37 ° C per 30 min in una provetta conica da 50 ml a 37 ° C in atmosfera di CO ₂ 5%. Centrifugare a 250xg e 25 ° C per 5 minuti e poi rimuovere la soluzione tripsina scartando il surnatante.
   2. Aggiungere 15 ml di soluzione di collagenasi tipo II e incubare per 2 ore a 37 ° C in atmosfera di CO ₂ 5%, con occasionale scuotitore secondo Leyva et al. ⁹
   3. Subito dopo la digestione con collagenasi II, aggiungere 15 ml di PBS e centrifugare a 250 xg e 25 ° C per 10 min.
   4. Eliminare il surnatante e lavare il pellet cellulare con 15 ml di soluzione di PBS e centrifugare a 250 xg e 25 ° C per 15 min. Scartare il surnatante.
   5. Risospendere il pellet cellulare in 10 ml di HG-DMEM agitando delicatamente.
4. Espansione di cellule staminali mesenchimali
   1. Seed 2 ml di sospensione cellulare (1 x 10 ⁴ cellule / cm ²⁾ in pallone di coltura, e 2 ml di DMEM-HG e incubare le cellule a 37 ° C in una atmosfera di CO ₂ 5%. Eliminare la cella non aderente cambiando il terreno di coltura dopo 5-7giorni.
   2. Trascorso questo tempo, cambiare il terreno di coltura ogni 3 giorni per altri 7-10 giorni per ottenere una confluenza cellulare del 90%.
   3. Recupero le cellule e incubare per 5 min a 37 ° C in una atmosfera di CO ₂ 5% con soluzione di tripsina / EDTA 0,125% (tripsinizzazione).
   4. Subito dopo tripsinizzazione, raccogliere le cellule con una pipetta e trasferimento in un tubo da 15 ml e centrifugare a 250 xg per 5 min.
   5. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 10 ml di HG-DMEM.
   6. Sospensione di coltura cellulare in due 75 centimetri ² cultura palloni (5 ml in ogni pallone), e mantenere la cultura fino al 90% di confluenza.
   7. Ripetere i punti 1.4.3. a 1.4.6, fino al 9 passaggio o sottocultura.
   8. Recuperare le cellule di tripsinizzazione come in passaggi 1.4.3 a 1.4.5 per citometria a flusso o di altri studi.

2. Preparazione del Porous Bone Matrix Disk (NKB)

1. Per bagnare i dischi NKB(Diametro 12 mm, spessore 2 mm)., Ogni disco incubare durante la notte con 3 ml di HG-DMEM senza FBS in atmosfera umidificata al 5% di CO ₂ a 37 ° C, secondo Fassina et al ⁵
2. Dopo il processo di bagnatura, posizionare il disco in un tubo da 50 ml e centrifugare a 250 xg per 5 minuti per rimuovere terreno di coltura in eccesso. Posizionare il disco in una piastra di coltura cellulare 24 bene.
   1. Aggiungere 500 pl di HG-DMEM e incubare per 30 min a 25 ° C. Assicurarsi che non bolle sono presenti sul disco NKB per favorire la corretta distribuzione dei nutrienti e cellule.
   2. Se bolle si osservano sul disco, agitare e aggiungere 300 ml di terreno di coltura e incubare per 15 min in atmosfera umidificata al 5% di CO ₂ a 37 ° C. Trascorso questo tempo togliere 300 ml di terreno di coltura succhiare attraverso la parete di coltura cellulare bene e confermano che si formano senza bolle.
3. Posizionare il disco in un nuovo 24-pozzetti con pinze semplici.

3. Coltura di cellule staminali mesenchimali umane sul Matrix bovina poroso

1. Seed una sospensione cellulare (5 x 10 ⁵ AM-hMSCs in 100 ml di DMEM-HG) da tre subcolture, sulla superficie del disco biomateriale pre-umidificato e incubare per 30 min in atmosfera umidificata al 5% di CO ₂ a 37 ° C. Eseguire questo passaggio lentamente e continuamente sulla faccia superiore del biomateriale per permettere alle cellule di interagire con la topografia di tutti scaffold. Nota: Questo procedimento il 60% delle cellule attaccate sul biomateriale indicato nella tabella 1.
2. Aggiungere 1,5 ml di DMEM-HG a 37 ° C, e mantenere la coltura per 3 giorni in atmosfera umidificata al 5% di CO ₂ a 37 ° C. Non generare turbolenze l'aggiunta di terreno di coltura per evitare che la deposizione di cellule sul fondo del piatto piastra di coltura. Questo è il tempo iniziale.

4. cellulare marcatori di superficie Caratterizzazione da flusso Cytommetria

1. Staccare le celle da 9 ^° sottocultura prima di seminare sul disco di matrice. Utilizzare 0,25% / 1 mM EDTA tripsina e fissarli per 30 minuti in ghiaccio-freddo 2% di formaldeide. Dopo la fissazione, lavare le cellule una volta con 0,05% PBS.
2. Blocca legame non specifico incubando le cellule con il 20% immunoglobulina umana per 3 minuti su ghiaccio e incubare 0,1 x 10 ⁶ aliquote di cellule con ficoeritrina (PerCP) -conjugated MAb contro CD73, FITC-coniugato MAb CD90, MAb PE-coniugato contro CD34 , FITC-coniugato MAb CD45 e PE-coniugato MAb CD105 per 1 ora a 25 ° C al buio. Isotype-abbinato FITC-coniugato MAb, PE-coniugato MAb andPerCP coniugato MAb servirà come controlli negativi.
3. Calcolare i livelli di espressione dei marcatori di superficie utilizzando il software per l'acquisizione e l'analisi dei dati.

5. cellulare Detection Adesione da Scanning Electron Microscopy

1. Sciacquare i campioni di cellule-disco in 3 giorni di cultura due volte con PBSe fixthe campioni con 4% (v / v) glutaraldeide solutionin un tampone 0,1 M Na-cacodilato (pH 7,2).
2. Preparare i campioni per l'osservazione al microscopio, come precedentemente riportato da Rivera-N et al. ¹⁰ e osservare utilizzando un microscopio elettronico a scansione ad un potenziale elettrico di 15 kV e con un ingrandimento di 500X e 2000X.

6. Cell Proliferation Assay

1. Per i campioni di cellule-disco contenenti 1,5 ml di terreno di coltura, aggiungere 150 ml di colorante vitale (AB) secondo le indicazioni del produttore e incubare le cellule in atmosfera umidificata al 5% di CO ₂ a 37 ° C.
2. Immediatamente dopo l'aggiunta di AB (0 ore) e ogni 24 ore fino a raggiungere 7 giorni di coltura cellulare, misurare l'assorbanza a 570 nm con una lunghezza d'onda di riferimento di 600 nm.

7. Colony Forming unità (CFU) ¹¹

1. Cultura 100 cellule per ogni 100 mm di coltura tissutale Diskin HG-DMEM e incubare per 14giorni in atmosfera umidificata al 5% di CO ₂ a 37 ° C.
2. Lavare la cultura con PBS e macchia con 0,5% cristalvioletto in metanolo per 5-10 minuti a temperatura ambiente.
3. Lavare le piastre con PBS due volte e contare le colonie visibili con un emocitometro.

Risultati

Mesenchimali umane isolamento delle cellule staminali

Dopo separazione meccanica della AM dal corion utilizzando smussa (figura 1), una popolazione di cellule aderenti stato ottenuto tripsina e collagenasi II digestione. Queste popolazioni cellulari allegate nel piatto di coltura di fibroblasti Presenta simile morfologia cellulare a 3 giorni dopo l'isolamento come mostrato nella micrografia ottica (Figura 2A) e scanning electron microfotografia (Figura 2B) .I placenta utilizzati in questo lavoro sono stati ottenuti da donatori sani madri withprevious consenso informato.

Caratterizzazione delle cellule mediante citometria di flusso

La popolazione cellulare che è stato ottenuto dal mattino era fortemente reattiva al marcatori mesenchimali superficie CD90 + (93,5% ± 6,85) e CD73 + e CD105 + (79% ± 3,46) e ha mostrato una reazione negativa ai marcatori ematopoietici quali CD34- e CD45. Così,AM-hMSCs utilizzati in questo lavoro sono stati mesenchimali, in informazioni accordancewith precedentemente riportata da Leyva et al. (Figura 3). Inoltre, questo risultato coincide con le caratteristiche immunofenotipo stabiliti dalla International Society for Cellular Therapy (ISCT) per le cellule staminali mesenchimali.

L'adesione cellulare su matrice ossea

Le micrografie scansione mostrano il comportamento dei AM-hMSCs sette giorni dopo stratificazione sulla NKB. La superficie del biomateriale è stato coperto con cellule sferiche (giorno uno), e alcune cellule diffusione apparentemente attaccate alla superficie della matrice bovina il settimo giorno. A maggiore ingrandimento, le cellule diffusione sembravano essere in stretto contatto con i processi filipodial (FL) (Figura 4).

La proliferazione cellulare sulla matrice ossea

I risultati del test AB mostrato una piccola diminuzione relativa assorbanza u lendini (RAU) della condizione di matrice (+ matrice ossea) bovini dopo 1 giorno di incubazione e poi il quinto giorno, la presenza del ponteggio induce un aumento della proliferazione cellulare statisticamente significativa rispetto cultura eseguita in assenza di bovini matrice (matrice -bone) (Figura 5).

Colony Forming Unità

La CFU è tradizionalmente test di cellule staminali. I AM-hMSCs isolate in questo lavoro conservato la sua capacità di formare colonie discrete a 14 giorni di coltura.

Figura 1: Isolamento di membrana amniotica. (A) Il cordone ombelicale (UC) viene tenuto con una mano per identificare la regione in cui si ottiene la membrana amniotica. (B) La membrana amniotica (AM) assomiglia a una pellicola traslucida senza innervazione sangue.

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Figura 2:. Caratteristiche morfologiche delle cellule staminali da membrana amniotica umana culture AM-hMSC a 3 giorni dopo l'isolamento sono stati osservati con un microscopio ottico e mostrate la morfologia fibroblasti-like.

Figura 3:. Citometria a flusso caratterizzazione Le cellule di membrana amniotica umana fosse cellule mesenchimali soprattutto perché erano positivi per i marcatori mesenchimali (CD73, CD90, CD105), come dimostra lo spostamento istogramma a destra, e negativo per i marcatori ematopoietici (CD34 e CD45), come confermato dallo spostamento dell'istogramma verso sinistra. Gli antigeni sono mostrati in istogrammi rosso, mentre il controllo isotypesfor fluorocromi PE e FITC si osservano innero.

Figura 4:.. L'adesione cellulare su matrice osso bovino Una serie di immagini SEM mostrano attacco delle cellule a pori del biomateriale (A) la visione panoramica di un poro NKB con più celle aderito al biomateriale nello stato sferica (CS) e appiattita (CF) sulla superficie del biomateriale, è anche possibile apprezzare l'osso lacuna indica come (Lac) alle tre giorni di coltura sulla matrice bovina. (B) amplificazione della cella nel processo di adattamento alla superficie il materiale attraverso proiezioni filipodial (C) Interazione tra due cellule aderito e appiattite sulla matrice bovina (C1, cella 1 e C2, cella 2).. Cliccare qui per view una versione più grande di questa figura.

Figura 5:. La proliferazione delle cellule di osso bovino matrice proliferazione cellulare è stata valutata la riduzione AB e espressa in unità di assorbanza relativi lungo 7 giorni di coltivazione. I risultati sono mostrati l'influenza della matrice ossea (+ matrice ossea) in AM-hMSCs proliferazione che era statisticamente differente rispetto alla condizione negativa (-bone matrice). (* P <0,05)

Figura 6: CFU dosaggio di MSC inizialmente placcato a quote differenziate e incubato per 14 giorni (media * / - SD, n = 10).

	Cellule rispettate	L'adesione cellulare (%)
Le cellule sul fondo	187.667 ± 1.208	62.47
Celle sul patibolo	312.333 ± 1.208	37.53

Tabella 1:. Efficienza di adesione su matrice bovina Le cellule aderito al fondo del piatto piastra e le cellule aderenti sull'impalcatura stati contati da emocitometro dopo essere recuperato trypsinization.The dati presentati nella tabella corrispondono ai due esperimenti indipendenti per triplicato ± deviazione standard

Discussione

Le cellule staminali che sono stati ottenuti dalla membrana amniotica umana (Figura 1) mostrano una morfologia simile fibroblasti, simili alle cellule mesenchimali (Figura 2) ed erano principalmente MSC. Inoltre, citometria a flusso test hanno rivelato che queste cellule sono stati positivi per i marcatori di cellule mesenchimali (CD73, CD90 e CD105) e negativo per i marcatori lignaggio ematopoietici (CD34, CD45) (Figura 3). Inoltre, le AM-hMSCs isolato in questo lavoro presentano la capacità di formare CFU (Figura 6). Analogamente, le cellule staminali mesenchimali isolate in questa forma mantenuto la possibilità di collegare al osteoinductor biomateriale (figura 4), ​​e proliferare sul ponteggio (Figura 5).

Per queste ragioni, il metodo di coltura AM-hMSCs sul biomateriale macroporosa osso che è stato utilizzato in questo lavoro rappresenta un'opportunità per inserire le celle all'interno del tessuto osseo danneggiato e indurre il differentiation alla stirpe osteoblastica. Questo sistema di coltura non richiede l'aggiunta di induttori osteoblastiche per mantenere il processo di differenziazione degli osteoblasti e fenotipo osteoblastico perché NKB è un materiale osteoconduttivo andosteoinductive ^8. L'uso di tessuti di scarto, come placenta umana, rappresenta una semplice ed etico alternativo per accedere a una popolazione di cellule staminali con il potenziale di differenziarsi in MSC, in confronto con altre sorgenti che coinvolgono frequentemente metodi invasivi o resa cella bassa.

Il metodo proposto coltura potrebbe essere estrapolato per sistemi in vivo perché le cellule vengono seminate in micro-massa sul materiale superficie superiore, e le cellule colonizzare e aderire alla intera superficie biomateriale dopo i tempi di incubazione appropriati. Inoltre, i reagenti sofisticate, le attrezzature e le procedure non sono richieste, a differenza dei metodi esistenti nell'attuazione di questa tecnica sono i cultureas micro-massa e ladeposizione lenta e costante dell'aliquota cellulare sul materiale per garantire che le cellule interagiscono preferenzialmente con il biomateriale, e non con il fondo della piastra. Un altro punto critico è l'uso di materiale pre-umidificato prima coltivando le cellule, in quanto ciò assicura che le cellule avranno i nutrienti necessari dal mezzo di coltura quando sono integrati nel materiale indipendentemente se sono sulla superficie o all'interno dei pori. Infine, l'uso di un biomateriale osteoinduttiva è fondamentale per questo processo perché evita l'aggiunta di fattori esterni per indurre e mantenere la differenziazione osteoblastica. La limitazione della tecnica è che si basa sul potenziale osteoinduttivo della matrice bovina; Tuttavia, il sistema di coltura proposto può essere estrapolata a qualsiasi materiale poroso con una distribuzione dei pori da 20 a 200 micron. Pertanto, la procedura presentata in questo lavoro è un metodo alternativo per la coltura di cellule staminali mesenchimali in materiali diversi tcappello sono impiegati per l'ingegneria tissutale, soprattutto per la rigenerazione ossea.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
soluzione salina tamponata con fosfato sterile	GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES		colture cellulari
penicillina-streptomicina	GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES		colture cellulari
FBS	GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES		colture cellulari
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) con GIBCO AD ALTO GLUCOSIO	, LIFE TECHNOLOGIES	11965118	colture cellulari
collagenasi tipo II	GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES		per colture cellulari
3 mM di cloruro di calcio	SIGMA_ALDRICH	C5670	per colture cellulari
tripsina/0,5 mM di soluzione EDTA	GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES		per colture cellulari
Trypan Blue solution	GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES		per colture cellulari
ficoeritrina (PerCP)-coniugato CD73	BD Pharmigen	562245	citomeria
FITC- CD90,BD	Pharmigen	562245	citomeria
PE-CD34	BD Pharmigen	562245	citomeria
FITC-CD45	BD Pharmigen	562245	citomeria
PE-CD105	BD Pharmigen	562245	citomeria
BD FACSCalibur Flow Cytometer	BD Pharmigen	BD FACSCalibur	cytomery
alamarBlue (AB)	LIFE TECHNOLOGIES	DAL1025	test cellulare di proliferazione
SUNRISE-reader	TECAN, Germania	Saggio cellulare di proliferazione	Sunrise

10010023 10378016 26140111 per 17101015 R001100 15250061