Misurare Anafilassi locali nei topi

Sommario

Reazioni allergiche, caratterizzate da attivazione dei mastociti e dei basofili, sono guidati dal cross-linking delle IgE e il rilascio di mediatori proinfiammatori. Una valutazione quantitativa delle risposte allergiche può essere ottenuto utilizzando Evans colorante blu per monitorare i cambiamenti nella permeabilità vascolare dopo la sfida allergene.

Abstract

Reazioni allergiche sono il risultato dell'attivazione dei mastociti e basofili e il successivo rilascio di vasoattivo e mediatori proinfiammatori. L'esposizione ad un allergene in una persona sensibilizzata può causare sintomi clinici che variano da eritema lieve a pericolo di vita anafilassi. In laboratorio, sono stati sviluppati diversi modelli animali per capire i meccanismi di guida reazioni allergiche. Qui, descriviamo un metodo dettagliato per misurare i cambiamenti della permeabilità vascolare per quantificare le risposte allergiche localizzate. Il saggio anafilassi locale è stata segnalata per la prima nel 1920, ed è stato adattato dalla tecnica pubblicata da Kojima et al. nel 2007 ^1. In questo saggio, i topi sensibilizzati al OVA sono sfidati nel orecchio sinistro con il veicolo e l'orecchio destro con OVA. Questa è seguita da una iniezione endovenosa di Blu di Evans colorante. Dieci minuti dopo l'iniezione di Blu di Evans, l'animale è eutanasia e il colorante che è uscito dai vasi inper le orecchie viene estratto durante la notte in formammide. L'assorbanza del colorante estratto viene poi quantificato con uno spettrofotometro. Questo metodo assicura in maniera affidabile una manifestazione visiva e quantificabile di una reazione allergica locale.

Introduzione

Ipersensibilità di tipo I è mediata da antigene-indotta cross-linking delle IgE sulla superficie dei mastociti e basofili. Ciò si traduce in degranulazione cellulare e il rilascio di mediatori vasoattivi e proinfiammatori come l'istamina, triptasi, e fattore attivante le piastrine ^2. A seguito del rilascio di mediatori preformati durante degranulazione, mastociti sintetizzano e rilasciano prostaglandine e leucotrieni, che aumentano ulteriormente la permeabilità vascolare ^3. La risposta clinica iniziale avviene rapidamente ed è indicato come una "reazione immediata". Nella pelle, una risposta wheal-e-bagliori è facilmente visibile a pochi min....

Protocollo

1. Mice Sensibilizzare

1. Preparare una soluzione stock OVA diluendo OVA in 1x PBS ad una concentrazione finale di 20 mg / ml. Congelare le aliquote in cryovials e conservare a -80 ° C per un uso futuro.
2. Portare una o più aliquote di 20 mg / ml di OVA magazzino a temperatura ambiente. Diluire OVA in 1x PBS ad una concentrazione finale di 1 mg / ml in una provetta 5 ml di polistirolo rotonda fondo con un tappo. Vortex brevemente per miscelare.
3. Tenendo la provetta di polistirene contenente 1 mg / ml di OVA in un vortice funzionante a velocità media, aggiungere un volume uguale di fondo omogeneizzato Imject allume (40 mg / ml) goccia a goccia....

Risultati

Gli animali che hanno subito il test con successo avranno la pelle e gli occhi che appaiono blu. PBS animali sensibilizzati non dovrebbero reagire a uno o PBS sfida OVA, quindi entrambe le orecchie dovrebbero rimanere bianco (Figura 1A). Negli animali sensibilizzati OVA, l'orecchio riceve la sfida PBS (sinistra) dovrebbe essere completamente bianca o leggermente blu in modo localizzato nel sito di iniezione. L'orecchio riceve la sfida OVA (a destra) dovrebbe diventare progressivamente più scuro blu dura.......

Discussione

Numerosi marcatori di malattia allergica sono utilizzati per valutare la forza delle risposte allergiche seguenti sfida allergene, compresi i cambiamenti nei livelli di istamina circolante, Th2 produzione di citochine, e il reclutamento di cellule in liquido broncoalveolare nella cornice della sfida delle vie aeree. Mentre il monitoraggio dei cambiamenti in questi parametri è importante per studiare le reazioni allergiche, marcatori biologici non sempre correlano con malattia allergica clinica. Il test anafilassi locale.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
BALB/c Topi	The Jackson Laboratory	651
PBS pH 7.4	Qualità Biologico	114-058-101
Ovoalbumina	Sigma	A5503-10G
Imject Allume	Thermo Scientific	77161	Mescolare accuratamente prima dell'uso
Evans Blue Dye	Sigma	E2129
Formamide	Sigma	295876	99%+ Grado spettrofotometrico
Isoflurano, USP	Phoenix	NDC 57319-474-06
Siringhe da insulina da 1 cc	BD	329654
Siringa da insulina da 3/10 cc con ago da 31 G	Terumo	NDC 100861
aghi da 27 G	BD	305109
pinza	F.S.T.	11000-12
Forbici chirurgiche	F.S.T.14070-12
Provette da 5 ml in polistirene a fondo tondo	BD Falcon	352058
Provette per microcentrifuga da 1,5 ml	Medical Supply Partner	15-1151
Provette coniche da 15 ml	BD Falcon	352097
Piastra a fondo piatto da 96 pozzetti	Costar	3590
Scotch
RC2 Sistema di anestesia per roditori	VetEquip	922100
Vortex Genie 2	Scientific Industries	SI-0236	Modello G560 con piattaforma da 3 pollici