Alta efficienza differenziazione delle cellule staminali pluripotenti umane di cardiomiociti e Caratterizzazione mediante citometria di flusso

Subarna Bhattacharya; Paul W. Burridge; Erin M. Kropp; Sandra L. Chuppa; Wai-Meng Kwok; Joseph C. Wu; Kenneth R. Boheler; Rebekah L. Gundry

doi:10.3791/52010

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Articolo metodologico

Alta efficienza differenziazione delle cellule staminali pluripotenti umane di cardiomiociti e Caratterizzazione mediante citometria di flusso

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DOI:

10.3791/52010

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23 settembre 2014

Subarna Bhattacharya^*¹ , Paul W. Burridge^*² , Erin M. Kropp¹ , Sandra L. Chuppa¹ , Wai-Meng Kwok³ , Joseph C. Wu² , Kenneth R. Boheler⁴^,⁵ , Rebekah L. Gundry¹^,⁶

¹Department of Biochemistry, Medical College of Wisconsin, ²Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, ³Department of Anesthesiology, Medical College of Wisconsin, ⁴Stem Cell and Regenerative Medicine Consortium, LKS Faculty of Medicine, Hong Kong University, ⁵Division of Cardiology, Johns Hopkins University School of Medicine, ⁶Cardiovascular Research Center, Biotechnology and Bioengineering Center, Medical College of Wisconsin

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

L'articolo descrive la metodologia dettagliata per differenziare efficacemente le cellule staminali pluripotenti umane in cardiomiociti selettivamente modulando la via di Wnt, seguita da analisi citofluorimetrica di marcatori di riferimento per valutare l'omogeneità e l'identità della popolazione.

Abstract

Vi è un urgente bisogno di sviluppare approcci per riparare il cuore danneggiato, la scoperta di nuovi farmaci terapeutici che non hanno effetti tossici sul cuore, e migliorare le strategie per modellare con precisione la malattia di cuore. Il potenziale di sfruttare la tecnologia umana indotto cellule staminali pluripotenti (hiPSC) per generare il muscolo cardiaco "in un piatto" per queste applicazioni continua a generare entusiasmo alto. Negli ultimi anni, la capacità di generare in modo efficiente le cellule cardiomyogenic da cellule staminali umane pluripotenti (hPSCs) è notevolmente migliorata, offrendoci nuove opportunità di modellare primissime fasi dello sviluppo cardiaco umano non altrimenti accessibili. A differenza di molti metodi precedenti, il protocollo di differenziazione dei cardiomiociti qui descritto non richiede l'aggregazione delle cellule o l'aggiunta di Activin A o BMP4 e genera robusta colture di cellule che sono altamente positivo per la troponina cardiaca I e T (TNNI3, TNNT2), Iroquois proteine classe homeodomainIRX-4 (IRX4), miosina catena leggera normativo 2, isoforma ventricolare / muscolo cardiaco (MLC2v) e miosina catena leggera normativo 2, isoforma atriale (MLC2a) dal giorno 10 in tutti cellule staminali embrionali umane (hESC) e le linee hiPSC testato per data. Le celle possono essere diversi passaggi e mantenuti per più di 90 giorni di coltura. La strategia è tecnicamente semplice da implementare e conveniente. Caratterizzazione dei cardiomiociti derivati da cellule pluripotenti spesso include l'analisi dei marcatori di riferimento, sia a livello di mRNA e proteine. Per l'analisi delle proteine, citometria a flusso è un potente strumento analitico per valutare la qualità delle cellule in coltura e determinazione sottopopolazione omogeneità. Tuttavia, la variazione tecnica in preparazione del campione può influenzare significativamente la qualità della citometria a flusso di dati. Così, la standardizzazione dei protocolli di colorazione dovrebbe facilitare il confronto tra le varie strategie di differenziazione. Di conseguenza, ottimizzati protocolli di colorazione per l'analisi di IRX4, MLC2v, MLC2a, TNNI3, e TNNT2 mediante citometria di flusso sono descritti.

Introduzione

La generazione di cardiomiociti da hPSCs, tra cui hESC e hiPSC, può funzionare come un modello in vitro di molto precoci processi di sviluppo cardiache umane, permettono di approfondire le fasi non altrimenti accessibili per gli studi meccanicistici. Questo modello di sistema fornisce opportunità uniche per studiare i meccanismi molecolari che controllano l'impegno lignaggio cardiaco e le specifiche destino cellulare. Negli ultimi anni, la capacità di generare in modo efficiente le cellule cardiomyogenic da hPSCs è notevolmente migliorata ^1-15. Tuttavia, tra protocolli c'è variazione linea cellulare rispetto alla efficienza nella generazio....