Assay Semplice per la quantificazione della Social Prevenzione in Drosophila melanogaster

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per quantificare l'evitamento degli individui stressati. Questo paradigma è potente ma facile da usare e può essere utilizzato per valutare l'influenza dei geni e dell'ambiente su un tipo di interazione sociale in Drosophila melanogaster.

Abstract

Drosophila melanogaster è un modello emergente per studiare diversi aspetti delle interazioni sociali. Ad esempio, le mosche evitano le aree precedentemente occupate da conspecifici stressati a causa di un odorante rilasciato durante lo stress noto come odorante da stress Drosophila (dSO). Attraverso l'uso dell'apparato T-maze, è possibile quantificare l'evitamento del dSO da parte delle mosche responder in un test molto economico e robusto. Qui vengono presentate le condizioni necessarie per ottenere una buona performance. È necessaria un'esperienza stressante affinché le mosche emettano dSO, così come un numero sufficiente di mosche emettitrici per causare una robusta risposta di evitamento alla presenza di dSO. Il background genetico, ma non la dimensione del gruppo, ha fortemente alterato l'evitamento del dSO da parte dei moscerini responder. Canton-S ed Elwood mostrano prestazioni più elevate nell'evitare il dSO rispetto ai ceppi Oregon e Samarcanda. Questo test comportamentale consentirà l'identificazione dei meccanismi alla base di questo comportamento sociale e la valutazione dell'influenza dei geni e delle condizioni ambientali sia sull'emissione che sull'evitamento del dSO. Tale test può essere incluso in batterie di semplici test diagnostici utilizzati per identificare carenze sociali di mutanti o condizioni ambientali di interesse.

Introduzione

L'obiettivo di questo metodo è di quantificare facilmente un nuovo aspetto del semplice comportamento sociale in Drosophila melanogaster, indipendente dalla corteggiamento e aggressività.

Interazioni sociali sono fondamentali per il corretto sviluppo e la salute delle persone all'interno di una società, così come la funzionalità di un gruppo sociale nel suo complesso. La complessità di queste interazioni richiede campioni di grandi dimensioni e di un sistema che consente una semplificazione del comportamento come basi genetiche e neurali del comportamento sociale sono ancora poco conosciuti. Drosophila melanogaster è un modello genetico potente che può essere utilizzato per identificare il genetica e basi neurali delle interazioni sociali. Infatti, D. melanogaster ha un repertorio di comportamenti sociali complessi e alcune misure dirette di socializzazione sono già stato fatto ^1-7. Tuttavia, la maggior parte di questi sforzi sono stati concentrati sui comportamenti sociali relativamente complessi, come aggresinterazioni sive ^3,6, vari aspetti del corteggiamento ^3,8-12, e come i social esperienza influisce altri comportamenti quali l'apprendimento, o il ritmo circadiano ^13-17. Inoltre, molti di questi test si basano su analisi di modelli di interazione complesse di gruppi di mosche, con il monitoraggio di video e software per analizzare l'abbondanza risultante dei dati. Tali analisi hanno un valore inestimabile, e portare a nuove importanti informazioni quali la dinamica delle interazioni fly-fly in gruppi ^7. Un limite, però, è l'inaccessibilità di questi test per la comunità in generale, e la limitata conoscenza dei meccanismi alla base il riconoscimento degli altri. In altre parole, la base dell'emissione di un segnale da un individuo e il suo riconoscimento da un altro è ancora scarsamente compreso ^18.

Al contrario, vola anche mostrare un comportamento semplice, evitamento sociale, in cui gli individui si muovono da un segnale emesso da mosche sollecitate: la D. Melanogaster stress odorizzante o DSO ^19. In un saggio ad alta prestazione, questo comportamento può essere quantificato come la prevenzione di un segnale di stress emesso da altre mosche, o evitamento sociale ^19. Mosche sono posti in un apparecchio T-labirinto e data la scelta per evitare una fiala contenente DSO. Utilizzando questo test, CO ₂ ha dimostrato di essere un componente del DSO, e parte del circuito neuronale necessario per rispondere a CO ₂ è stato dissezionato ^19.

Il saggio evitamento sociale qui presentato è simile concettualmente ai semplici test comportamentali sviluppati nel laboratorio di Seymour Benzer che hanno permesso generazioni di ricercatori per analizzare comportamenti complessi ^20. Analisi di evitamento sociale può essere effettuata conveniente utilizzando il test T-maze, consentendo un più ampio studio del comportamento sociale. Ad esempio, utilizzando questo test abbiamo recentemente dimostrato che i diversi rischi genetici per l'autismo hanno effetti contrastanti in b socialesaggi ehavior. Mutanti di un gene candidato per l'autismo - neurobeachin ^21,22 - carenze presenti sia nello spazio sociale (descritte altrove ²³⁾ e l'evitare sociale ^24. Segnalazione dopaminergico anomala si propone anche di svolgere un ruolo nell'eziologia dell'autismo negli esseri umani ^25,26. In contrasto con i risultati ottenuti con neurobeachin, abbiamo scoperto che le prestazioni evitamento sociale è stata influenzata da un aumento o diminuzione dei livelli di Drosophila vescicolare Monoamino Transporter (VMAT) in cellule dopaminergiche, anche se lo spazio sociale è direttamente correlata a questi livelli di VMAT ^27. I risultati ottenuti con contrasto neurobeachin e VMAT sottolineano la possibilità di individuare varie forme di comportamento asociale, e quindi le differenti circuiterie neurali sottostanti modulano la risposta ad altri.

Protocollo

1. Attrezzature e reagenti creati in-house (vedi elenco dei materiali per gli altri)

1. Preparare una Drosophila apparecchiatura anestesia fredda per svolgere un lavoro mosca.
   1. Tagliare un foglio di polietilene porosa per coprire una piccola scatola di plastica (lungo 12,7 centimetri, larghezza 10,2 centimetri), in genere la copertura superiore di una scatola punte per pipette (lungo 12,7 centimetri, larghezza 10,2 centimetri, 3,8 centimetri di profondità).
   2. Riempire la scatola con ghiaccio tritato, coprire con il foglio di polietilene porosa.
2. Preparare un apparato T-labirinto; adattare l'apparecchiatura precedentemente descritta in dettaglio ^28-31.
3. Preparare un aspiratore mosca come descritto ^32.
4. Preparare un apparato di risposta fototassi per spostare le mosche dentro e fuori di flaconi di prova, senza stress:
   1. Utilizzare un apparato in controcorrente, come descritto da ^29,33.

NOTA: La T-maze può essere utilizzato anche per altri scopi, come descritto da ^28.

5. Garantire homcondizioni di luce ogeneous: eseguire l'esperimento su un banco coperto con un coperchio panchina bianca, e di fronte a un bordo bianco.
   NOTA: per questi esperimenti, i ceppi utilizzati sono stati mosca Drosophila melanogaster wild-tipo: Canton-S, Oregon e Samarcanda vola dalle nostre scorte di laboratorio ^34; Mosche Elwood sono stati raccolti in autunno 2011 nel quartiere Elwood di Huntington, a Long Island, New York, Stati Uniti d'America.

2. Preparare le mosche prima dell'esperimento

1-2 giorni prima di eseguire l'esperimento:

1. Mantenere mosche sul medio farina di mais-agar-melassa-lievito di serie a 25 ° C su un 12 ore di luce / buio ciclo.
2. Raccogliere linea risponditore sotto anestesia freddi 1-2 giorni prima di eseguire l'esperimento
   1. Trasferire le mosche dalle bottiglie in cui sono stati raccolti in 50 ml provette Falcon, con un imbuto.
   2. Posizionare il tubo falco con le mosche sotto il livello del ghiaccio, in unsecchiello per il ghiaccio isolato.
   3. Collocare l'apparecchio di anestesia fredda con ghiaccio tritato a -4 ° C per rilassarsi.
   4. Attendere 5 minuti per le mosche di entrare in un coma freddo.
   5. Trasferire le mosche sul foglio di polietilene porosa dell'apparato anestesia freddo.
   6. Raccogliere le mosche risponditore sull'apparato anestesia freddo. A RT, sotto uno stereomicroscopio, separare i 3-7 giorni vecchio maschio da mosche femmine e mantenere queste mosche in gruppi di 40.
3. Raccogliere linea emettitore 1-2 giorni prima di eseguire l'esperimento.
   1. Raccoglie delicatamente Canton-S mixed-sex aria dal loro bottiglie, con un aspiratore bocca, controllando per il loro numero.
   2. Mantenere queste mosche in gruppo di 60-100, in quanto saranno gli emettitori.
   3. Preparare tutti i campioni di emettitori come punti dati necessari.
4. Lasciare almeno una notte di recupero dopo la raccolta dei soccorritori e per gli emettitori, per ridurre al minimo qualsiasi effetto confondente dell'anestesia freddoe la raccolta della bocca di aspirazione sul comportamento.
5. Aprire la busta di fiale di prova, per permettere all'aria di plastica maleodoranti stantio nel sacchetto per essere sostituito da aria fresca, almeno 1 giorno prima dell'esperimento.

2 ore prima di eseguire l'esperimento:

6. Assicurarsi che la temperatura nel locale in cui viene eseguita l'esperimento è di circa 23-25 ​​° C, con anche la luce, e umidità superiore al 30%.
7. Trasferire i soccorritori e mosche emettitori di frutta in fiale di cibo fresco per garantire che queste mosche non sono affamate.
8. Lasciate che i moscerini della frutta regolare per l'ambiente per 2 ore, sulla panchina su cui verrà eseguita l'esperimento.

3. Eseguire l'esperimento sociale Prevenzione

1. Eseguire ogni esperimento allo stesso tempo del giorno, in un intervallo di 3-4 ore nel pomeriggio tra tempo Zeitgeber ZT5 e ZT9.
2. Posizionare il T-labirinto sul pad martellante, e stringere la clip vite così tegli ascensore è stabile.
3. Trasferire linea risponditore in un test flacone fresco. Snap questo flaconcino contenente linea risponditore sulla parte superiore della T-labirinto.
4. Inclinare l'apparecchio T-labirinto e toccare sul tappeto martellante in modo che i moscerini della frutta caduta in ascensore.
5. Spostare la parte superiore del l'ascensore in modo in linea sono tra la parte superiore e inferiore del T-labirinto, ma attenzione per mantenere l'ascensore sopra del punto scelta - per evitare le mosche fuoriuscita.
6. Ottenere fiale con DSO (vedi sezione 5 per generare fiale DSO-libero che in precedenza occupati da mosche).
   1. Mentre le mosche risponditore stanno adeguando a questo nuovo ambiente, mettere in linea emettitore in un flaconcino di prova.
   2. Posizionare un pezzo di cotone per chiudere la fiala in modo che i moscerini non sfuggono.
   3. Meccanicamente Agitare questo flaconcino su una mini-vortice come segue: vortex per 15 secondi, togliere il flacone dal vortice per 5 sec. Ripetere 3 volte per un totale di 55 sec.
   4. Remil sobrio linea emettitore dal flaconcino fresca - trasferendo in una fiala alimentare - e rapidamente posizionare questo DSO fiala riempita in uno dei due lati dell'apparato T-labirinto.
   5. Alternare il lato di posizionamento per il flacone DSO compilato in ogni nuova esecuzione.
7. Inserire un test flaconcino fresca sul lato della T-labirinto.
8. Portare l'ascensore fino in fondo, in modo che i moscerini della frutta possono scegliere tra il flacone di prova fresco e la fiala test con DSO, e avviare il timer.
9. Lasciate che i mosche scegliere tra la fiala fresco e la fiala DSO, per 1 minuto, se non diversamente specificato.
10. Dopo 1 min, spostare l'ascensore fino a separare le mosche nel flacone fresco, DSO flacone, e quelli bloccati in ascensore.
11. Contare il numero di mosche in ogni fiala, e in ascensore.
12. Ripetere questa operazione per ciascun genotipo / condizione.

4. Analizzare i dati sociale Prevenzione

1. Contare il numero di moscerini della frutta in ogni fiala per ogni genotipo, e trasferire i dati in un foglio di calcolo.
2. Utilizzando un foglio di calcolo, calcolare il Performance Index (PI) per ciascun genotipo sottraendo il numero di mosche in flaconcino DSO dal numero di mosche in flacone DSO-libera, e dividendo per il numero totale di mosche.
3. Confrontare Pis ": mediante software di analisi statistica per l'analisi dei risultati.
   1. Idealmente, preparare 2-3 ripetizioni interne per ogni esperimento, e 3 ripetizioni indipendenti, effettuate in giorni diversi, con diverse bottiglie o croci ^30.
   2. Utilizzare test statistici distribuzione gaussiana, come i dati seguono una distribuzione normale.
   3. Durante il test di un effetto (cioè, densità - figura 2), utilizzare un ANOVA, con post-test di confronto multiplo (colonna per colonna), o un semplice t-test per confrontare ogni risultato a un controllo.
   4. Quando gli esperimenti di gruppo vengono eseguiti, testare entrambe le condizioni e generi (flaconi vuoti, ha sottolineato und vola non-ha sottolineato; ed effetto genere - figura 1), utilizzando una ANOVA a due vie.

5. Generare fiale precedentemente occupato da mosche non accentate - Eseguire Invece di 3,5-3,6

1. Utilizzare fototassi preparare fiale occupati da mosche che non sono stati sottolineati, come controllo.
2. Trasferire le mosche in un flaconcino di prova, e farlo scattare in dell'apparato controcorrente, con fiale freschi vuoti nella posizione di fronte.
3. Posare l'apparecchio orizzontalmente con la fiala distale direttamente di fronte a 15 W fluorescente bianca fredda, e coprire con un panno nero.
4. Lasciate linea si muovono delicatamente nel flaconcino fresco. Questo potrebbe richiedere alcuni minuti. Una volta che la maggior parte delle mosche camminano verso la luce nel flacone distale, avviare il timer per 1 min.
5. Rimuovere delicatamente il panno nero, cambiare la posizione della luce, il recupero con il panno nero, e permettono in linea di lasciare il flacone di prova.
6. A quel tempo, initiate l'esperimento scelta in 3.2 a 3.5. Salta 3.6 e 3.7.
7. Spostare il cursore dell'apparecchiatura, per separare le mosche che liberate il flaconcino di prova dall'altro lato.
8. Utilizzare il flacone di prova sgomberato nel T-labirinto subito per l'esperimento scelta, come in 3.7.

Risultati

Il saggio evitamento sociale è una prova robusta quantificare la capacità di Drosophila melanogaster riconoscere un segnale di stress (DSO) emessa da altri mosche, e valutare quindi un aspetto delle interazioni sociali. Il test viene eseguito utilizzando un apparecchio comunemente usato in vari saggi comportamento noto come T-labirinto, che presentano in linea con una scelta tra due diverse opzioni - a sinistra oa destra ^19,28-31. In questo caso, l'efficienza con cui linea evitano il DSO è quantifica...

Discussione

Questo protocollo descrive una procedura dettagliata per il saggio evitamento sociale. Canton-S eviterà solo una fiala in che vola in precedenza stato meccanicamente sottolineato, e che il sesso e il numero di responder non influenza che le prestazioni evitamento sociale. Tuttavia, background genetico dei soccorritori ha una grande influenza.

Di seguito sono riportati alcuni passaggi critici per l'esecuzione di questo esperimento con successo: 1) il trasferimento sempre in linea 2 ore pr...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Microscopio zoom stereoscopico	Nikon	SMZ-645	Qualsiasi altro cannocchiale standard per la manipolazione delle mosche funzionerebbe
Piccoli pennelli			per mosche da spinta
Polietilene poroso, 12" x 12" Foglio	Flystuff - Genesee	46-100	http://www.flystuff.com/ProductInfo.php?productID=46-100 Foglio di plastica porosa per la scatola dell'anestesia fredda
Mini-Alarm Timer/Cronometro
Penne
Nastro adesivo
Mini vortex	Fisher	14-955-151	http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail Per l'agitazione meccanica delle mosche, qualsiasi vortice funzionerebbe.
Corning Life Sciences DL No.:352017, Provetta Falcon; fondo rotondo; monouso; senza chiusura, 14 ml; 17 x 100 mm	Fisher	14-959-8	http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalogId=29104&productId=2771811&distype=0&highlightProductsItemsFlag=Y&fromSearch=1&searchType=PROD&hasPromo=0 Questi si incastrano in un labirinto a T e in
batuffoli			chiudere le fiale dopo l'esperimento.
Pannello a tre ante e copertura			per fornire uno sfondo bianco e una luce omogenea.
		la copertura
			panca
Grande telo			per coprire l'apparato controcorrente in risposta alla fototassi .
luce bianca fredda	Home Depot	1000516563	http://www.homedepot.ca/product/illume-26-fluorescent-plug-in-linear/911423 qualsiasi luce lineare simile con lampadina fluorescente di colore bianco freddo a 13-15 W funzionerebbe