Specifici Sequenza Etichettatura degli acidi nucleici e proteine ​​con metiltransferasi e cofattore Analoghi

Summary

DNA e proteine ​​sono la sequenza-specifica etichettati con affinità o gruppi reporter fluorescente con DNA o proteine ​​metiltransferasi e analoghi cofattore sintetici. A seconda della specificità cofattore di enzimi, aziridina o doppi analoghi cofattore attivati ​​sono impiegati per l'etichettatura di uno o due step.

Abstract

S -Adenosyl-L-metionina (SAM) o AdoMet metiltransferasi-dipendente (MTase) catalizzano il trasferimento del gruppo metilico attivato dal AdoMet a specifiche posizioni in DNA, RNA, proteine ​​e piccole biomolecole. Questa reazione di metilazione naturale può essere espansa a un'ampia varietà di reazioni di alchilazione con analoghi sintetici cofattore. Sostituzione del centro solfonio reattiva di AdoMet con un anello di aziridina conduce cofattori accoppiabili con DNA da vari MTases DNA. Questi cofattori aziridina possono essere equipaggiati con gruppi reporter diverse posizioni della frazione adenina e utilizzati per S-specific equence M ethyltransferase- I nduced L Abel zione del DNA (sorridendo DNA). Come esempio tipico diamo un protocollo per biotinilazione di pBR322 plasmide DNA sequenza 5'-ATCG A T-3 'con il DNA MTase M.BseCI e il cofattore aziridina 6BAz inun passo. Estensione del gruppo metilico attivato con insaturi gruppi alchil risultati in un'altra classe di analoghi AdoMet che sono utilizzati per m ethyltransferase diretto T rasferimento di un ctivated ruppi G (MTAG). Poiché le catene laterali estesi vengono attivati ​​dal centro solfonio e il legame insaturo, questi cofattori sono chiamati analoghi AdoMet doppio attivati. Questi analoghi funzione non solo come cofattori per DNA MTases, come cofattori aziridina, ma anche per RNA, proteine ​​e piccole molecole MTases. Essi sono tipicamente utilizzati per modificazione enzimatica di substrati MTase con gruppi funzionali uniche che sono contrassegnati con gruppi del reporter in una seconda fase chimica. Questo è esemplificato in un protocollo per l'etichettatura di fluorescenza di proteine ​​istone H3. Un piccolo gruppo propargile viene trasferito dal SeAdoYn cofattore analogica alla proteina dalla lisina istone H3 4 (H3K4) MTase Set7 / 9 seguito da etichettatura clic delalkynylated H3 istone con TAMRA azide. Etichettatura MTase-mediata con analoghi cofattore è una tecnologia abilitante per molte applicazioni interessanti, tra cui l'identificazione e lo studio funzionale di substrati MTase e genotipizzazione del DNA e rilevazione metilazione.

Introduction

Etichettatura specifica degli acidi nucleici e proteine ^{​​1,2 3,4} è di grande interesse per le caratterizzazioni funzionali, diagnosi medica e (nano) biotecnologie. Qui vi presentiamo un metodo enzimatico di etichettatura per questi biopolimeri che si basa su S -adenosyl-L-metionina (SAM AdoMet o) metiltransferasi-dipendente (MTases). Questa classe di enzimi (EC 2.1.1.) Rivolge singole posizioni nucleofili (azoto, ossigeno, zolfo e atomi di carbonio) all'interno specifici residui di acidi nucleici e proteine ​​e naturalmente trasferisce il gruppo metilico attivato della AdoMet cofattore (Figura 1A) ^5. Inoltre, MTases po....

Protocol

1. Istruzioni generali

1. Conservare aziridina cofattore 6BAz (in DMSO) e di proteine ​​MTase Set7 / 9 a -80 ° C e tutti gli altri reagenti tra cui doppio attivato cofattore SeAdoYn e DNA MTase M.BseCI (nel 50% glicerolo) a -20 ° C.
2. Determinare la concentrazione di 6BAz e SeAdoYn tramite spettroscopia UV / Vis utilizzando i coefficienti di estinzione ε _269nm (6BAz) = 16000 centimetri ^-1 m ^-1 e ε _260nm (SeAdoYn) = 15400 centimetri ^-1 M ^-1 in acqua deionizzata. Determinare la concentrazione di MTases dal saggio Bradford o, se il coefficiente di estinzione è disponibile, tra....

Results

One-step Etichettatura del DNA tramite aziridina Cofattori

Questa reazione viene effettuata ad esempio con il DNA MTase M.BseCI, che modifica il secondo residuo di adenina nel doppio filamento 5'-ATCG A T-3 'sequenza ed ha un sito di riconoscimento sul plasmide pBR322 (Figura 4A). Per verificare l'etichettatura plasmide, pBR322 è sfidato con la endonucleasi di restrizione (REase) R.TaqI (5'-TCGA-3 '). R.TaqI ha sette siti pBR322, uno dei quali è inc.......

Discussion

Etichettatura in un unico passaggio di DNA con MTases DNA e cofattori aziridina (DNA sorridendo) è un metodo robusto ma alcuni aspetti deve essere considerato al momento di pianificare l'esperimento.

Cofattore Aziridine: La concentrazione 6BAz per l'etichettatura del DNA con M.BseCI era di 60 micron. Quando si utilizzano altri MTases DNA la concentrazione cofattore dovrebbe essere ottimizzato, ad esempio concentrazioni partire da 20 micron sono stati impiegati con i.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
6BAz			Sintetizzato secondo Weinhold et al., numero di brevetto US 8,129,106, pubblicato il 6 marzo 2012.
β-Mercaptoetanolo	Serva	28625
Acido acetico	Fisher Scientific	10304980
Soluzione di acrilammide/bis, 37,5:1	Serva	10688
Agarosio ultrapuro	Invitrogeno	16500100
Persolfato di ammonio (APS)	Serva	13375
Bis-Tris	Gerbu	1304
Acido borico	Gerbu	1115
Blu di bromofenolo Sale di Na	Serva	15375
Solfato di rame (II)	Aldrich	C1297
Cloroformio	Fisher Scientific	10020090
Coomassie Blu brillante	Serva	17525
Sale disodico EDTA	Gerbu	1034
Etanolo	Merck	100983
GelRed (10.000x in acqua)	Biozio	41003
Glicerolo (99,5%)	Gerbu	2006
FastRuler Scala DNA a bassa gamma	Thermo Scientific	SM1103
Histone H3			Plasmide di espressione ottenuto dal Dr. Philipp Voigt e dal Prof. Danny Reinberg; espressione e isolamento secondo T. J. Richmond et al., J. Mol. Biol. 1997, 272, 301-311.
Plasmide di espressione M.BseCI			ottenuto dal Dr. Michael Kokkinidis; espressione e isolamento secondo Kapetaniou et al., Acta Cryst. 2006, F63, 12-14.
Metanolo	Fisher Scientific 10675112
Cloruro di magnesio esaidrato	J.T. Baker	4003
MOPS	Gerbu	1081
Cloruro di sodio	Gerbu	1112
Striscia di pH (Neutralit)	Merck	1.095.330.001
pBR322	Thermo Scientific	SD0041
R.TaqI (10 u/µ l)	Thermo Scientific	ER0671
SeAdoYn			sintetizzato secondo Willnow et al., ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173.
Plasmide di espressione Set7/9			ottenuto dal Prof. Danny Reinberg, espressione e isolamento secondo D. Reinberg et al., Genes Dev.2002, 16, 479-489.
Streptavidina	Gerbu	3058
(+)-Sodio L-ascorbato	Sigma Life Science	A7631
SDS Gerbu granulare		1833
di-sodio idrogenofosfato	Merck	106,586
TAMRA azide			Sintetizzato secondo il riferimento 30: Willnow et al., ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173.
Tampone TaqI (10x)	Thermo Scientific	B28
N,N,N',N'-Tetrametiletilendiammina (TEMED)	Acros Organics	42058
Tris-HCl	Gerbu	1028
Tris-X (TRIS-base)	Gerbu	1018
Tris(3-idrossipropiltriazolil-metil)ammina (THPTA)	Sigma-Aldrich	762342