Isolare e utilizzo Sezioni di mesenterica bovina arteria e vena come un saggio biologico per verificare Vasoactivity nel piccolo intestino

Sommario

L'intestino tenue è spesso esposto alle tossine che possono influenzare il flusso di sangue e di influenzare negativamente l'assorbimento dei nutrienti. Utilizzando un multimyograph e mesenterica arteria e vena isolati, composti o tossine di interesse possono essere sottoposti a screening per vasoactivity.

Abstract

Sistemi gastrointestinale dei mammiferi sono costantemente esposti a composti (desiderabili e indesiderabili) che possono avere un effetto sul flusso di sangue da e verso quel sistema. Le variazioni di flusso di sangue al piccolo intestino può provocare effetti sulle funzioni di assorbimento dell'organo. Particolare interesse per le tossine liberate dai mangimi attraverso processi fermentativi e digestivi si è sviluppata nei ruminanti come un settore in cui le efficienze produttive potrebbero essere migliorati. Il video associato a questo articolo viene descritto un test biologico in vitro sviluppati per i composti dello schermo per vasoactivity in isolate sezioni di bovini mesenterica arteria e vena con un multimyograph. Una volta che i vasi sanguigni sono montati ed equilibrati nel myograph, il saggio biologico in sé può essere utilizzata: come strumento di screening per valutare la risposta contrattile o vasoactivity di composti di interesse; determinare la presenza di tipi di recettori da parte farmacologicamente mira recettori con agonisti specificis; determinare il ruolo di un recettore con la presenza di uno o più antagonisti; o determinare potenziali interazioni di composti di interesse con antagonisti. Attraverso tutto questo, i dati vengono raccolti in tempo reale, il tessuto prelevato da un singolo animale può essere esposto a un gran numero di diversi trattamenti sperimentali (un vantaggio in vitro), e rappresenta vascolare su entrambi i lati del letto capillare per fornire un accurato immagine di ciò che potrebbe accadere nel afferenti ed efferenti apporto di sangue sostenere il piccolo intestino.

Introduzione

Le alterazioni del flusso sanguigno in un letto di tessuto può avere un grande impatto sulla funzione d'organo. Una funzione primaria del piccolo intestino è l'assorbimento dei nutrienti. Arteriosa flusso di sangue verso la superficie di assorbimento dell'intestino è necessario per l'assorbimento dei nutrienti e aumenta il flusso sanguigno per aiutare l'assorbimento dei nutrienti come Digesto si muove lungo la superficie ^1. Una diminuzione del flusso sanguigno può causare una riduzione dell'assorbimento dei nutrienti a causa di una diminuzione del gradiente transepiteliale ^2. Oltre ai nutrienti, il piccolo intestino può essere esposto a metaboliti secondari, farmaci o tossine che esercitano un effetto sul flusso sanguigno localizzato nel mesentere. Nel caso di animali ruminanti, composti possono essere liberati da un mangime (ad esempio, sostanze nutritive, quali aminoacidi, o tossine come ad esempio alcaloidi della segale cornuta) attraverso processi fermentativi del foregut. Se questi composti sopravvivono il metabolismo microbico di fermentazione ruminale, sono ora disponibili per l'assorbimentoo interazione mentre viaggiano attraverso il tratto gastrointestinale dell'animale.

Ci sono un certo numero di metodi diversi a disposizione per misurare il flusso di sangue in vivo (ad esempio, Doppler, insito flussometri sangue, microsfere radioattivi, e le tecniche di indicatore-diluizione) che permettono la valutazione dei vari scenari sperimentali o trattamenti. Tuttavia, per ottenere informazioni riguardanti le proprietà meccaniche o farmacologiche di muscolatura liscia vascolare, i metodi sono rimasti limitati alle imbarcazioni più grandi fino Mulvany e Halpern ³ ha pubblicato un articolo che descrive una tecnica con filo montato preparati anello vascolare in un miografo. Poiché lo sviluppo di questa tecnica, modifiche continuano ad essere apportata ai sistemi miografo associate che permettono una varietà di applicazioni differenti per la valutazione di strutture tubolari. Il sistema è stato anche adattato per utilizzare barre fissi per il montaggio di navi più grandi ⁴ dove perfusionetecniche non sono desiderati.

A causa delle differenze nei vasi di diverse origini anatomiche e distinzioni nelle stesse navi di diverse specie di animali, i dati da nave e tipo di animale non può essere facilmente estrapolati in diversi recipienti o sulla stessa nave in diversi tipi di animali ^5. Di conseguenza, test biologici separati devono essere sviluppati e convalidati in qualsiasi momento questi aspetti sono cambiati. Recentemente diversi test biologici sono stati sviluppati con queste tecnologie per l'uso in bovini laterali vena safena e destra arteria e vena ruminale ^6,7.

Questo saggio biologico è stato sviluppato specificamente per indagare gli effetti che alcaloidi dell'ergot hanno sul sistema vascolare sostegno tenue. E 'stato riferito che il 50-60% di alcaloidi alimentati appaiono in contenuti abomasali, ma solo il 5% viene recuperato nelle feci ^8. Strickland et al. ⁹ ha dichiarato in una recensione di alcaloidi della segale cornuta, che i dati Sugg disponibiliest che l'intestino tenue può essere il sito più importante per l'assorbimento ergopeptine. Eckert et al. ¹⁰ aspetti biofarmaceutici recensione di alcaloidi della segale cornuta e ha dichiarato che una volta che attraversano la barriera epiteliale, alcaloidi della segale cornuta sono trasportati dal sistema linfatico alla vena succlavia o via vena mesenterica e in sangue portale. Rhodes et al. ¹¹ ha registrato una diminuzione del flusso di sangue al duodeno e colon in manzi che consumano un (alto alcaloide della segale cornuta) dieta ad alto endophyte-infettati. Utilizzando il diritto ruminale arteria e vena biotest, Foote et al. ¹² hanno dimostrato che gli alcaloidi dell'ergot sono vasoattivi in vasi ruminale. Foote et al. ¹³ successivamente dimostrato in vivo che l'esposizione agli alcaloidi dell'ergot ruminale risultati in una diminuzione del rumine flusso di sangue epiteliale. Questa diminuzione del flusso di sangue alla superficie di assorbimento del rumine contemporaneamente ha provocato una riduzione dei nutrienti (acidi grassi volatili) flusso. Data la quantity di alcaloidi della segale cornuta che passano al piccolo intestino dal foregut; è stato ipotizzato che un effetto simile sulla piccola vascolare intestinale e l'assorbimento dei nutrienti si sarebbe verificato. Ciò ha richiesto lo sviluppo dei bovini prossimale dell'ileo mesenterica arteria e vena biotest.

Protocollo

Le procedure utilizzate in questo studio non hanno richiesto l'approvazione presso l'Università del Kentucky Animal Care and Use Committee, perché non sono stati utilizzati animali vivi. Prima di raccolta di ogni campione utilizzato nel presente documento, tutti gli animali sono stati storditi con un proiettile captivo e dissanguato. Questo è stato condotto in una struttura federale mattatoio ispezionato presso l'Università del Kentucky. Un rappresentante ufficiale della sicurezza alimentare e Inspection Servizio USDA ha osservato tutte le attività che si sono occupati con il live degli animali e la manipolazione della carcassa.

1 Preparazione di Strumentazione

1. Per ridurre al minimo la quantità di tempo tra le collezioni di campioni di tessuto per l'inizio di un esperimento, impostare attrezzature e preparare i buffer prima di raccogliere il tessuto sperimentale (o se sono disponibili personale supplementare, queste attività possono verificarsi simultaneamente).
   NOTA: Questo non solo fornisce la maggior quantità di tempo che il tessuto rimane vitale per condurre esperimenti, ma alcuniesperimenti possono funzionare per lunghi periodi di tempo (o vi è il desiderio di completare più esperimenti in un giorno), quindi di solito è opportuno iniziare il più presto possibile.
2. Accendere il computer associato, attrezzature acquisizioni di dati, bagnomaria (per il buffer (s)) e myograph unità (s). Posizionare l'apparecchiatura di calibrazione sull'unità myograph (s) e accendere il calore myograph (preimpostato a 37,5 ° C) e lasciare le unità e le apparecchiature di taratura a caldo per preimpostare le temperature.
   1. Aprire un file di impostazioni del software Grafico creato in precedenza sul computer e avviare una corsa (ma non l'acquisizione di dati).
3. Riscaldare l'apparecchio per 10 min.
   1. Avviare l'acquisizione dei dati.
   2. Zero tutti i canali.
   3. Vedi, e condurre calibrazione (se necessario) su ciascun canale (4 canali per multimyograph) per standardizzare il segnale elettrico fornito dal rispettivo trasduttore di forza associata a quel canale a 2 g forza fornita da un peso certificata.
   4. Dopo la calibrazione e una conversione unità sono completate, memorizzare tutti i dati successivi come grammi. Cambia di conseguenza sulla base di desideri di ogni laboratorio separato; l'apparecchiatura e il software consentono l'uso di altre unità, come millinewton e volt.
4. Assicurarsi che le linee del gas sono chiare di blocchi e accendere fornitura di gas (95% O _2/5% di CO ₂₎ per myograph (s) unità. Continuamente gas tutti i buffer (nelle camere myograph) durante l'intera procedura.
5. Riempire tutte le camere myograph con il 70% di etanolo e ammollo per 10 minuti, rimuovere l'etanolo, e ripetere per un secondo 10 min ammollo.
   1. Dopo aver rimosso l'etanolo, lavare tre volte con acqua deionizzata, seguita da tre lavaggi con tampone preparato (vedi Sezione 2 per la preparazione di buffer), lasciando la terza aggiunta di tampone nelle camere.
      NOTA: A questo punto l'apparecchio può rimanere inattiva in questo stato fino a quando sono preparati tampone e il tessuto e il personale è pronto a procedere con le sperit.

2 Preparazione del buffer

1. Preparare una soluzione tampone 1 L Krebs-Henseleit per l'uso nel trasporto e lavorazione di campioni di tessuto per ottenere concentrazioni finali di 11.1 mm D-glucosio; 1.2 mM _MgSO4; 1,2 mm KH ₂ PO _4; 4.7 mM KCl; 118,1 mM NaCl; 3.4 mM CaCl _2; 24.9 NaHCO mm _3.
   1. Mescolare 9,6 g di sali Krebs in circa 900 ml di acqua deionizzata su un piatto mescolare.
   2. Mescolare in 0,373 g di cloruro di calcio diidrato seguita da 2,1 g di bicarbonato di sodio per L di tampone desiderato.
   3. Soluzione tampone a gas per 20 minuti con il 95% O _2/5% di CO _2.
   4. Dopo la gasazione, aggiustare il pH a 7.05 (filtrazione di tampone aumenta il pH; obiettivo finale pH dovrebbe essere 7.4) e regolare il volume di 1 L.
   5. Filtro sterilizzare tampone in un autoclave 1 L bottiglia e serbatoio tampone mezzi puliti a 4 ° C fino al momento dell'uso.
2. Preparare a parte Krebs-Hsoluzione tampone enseleit per l'uso negli esperimenti myograph come descritto al punto 2.1 per il trasporto tampone Krebs-Henseleit con composti aggiuntivi che riguardano gli esperimenti contrattilità.
   NOTA: in genere 2 L sarà sufficiente per esperimenti descritti in questo articolo, ma questo volume potrebbe dover essere aumentato o diminuito in base alla lunghezza dell'esperimento, numero di camere myograph, e sostituzioni tampone numero (relativi a integrazioni di trattamento).
   1. Prima della fase di gassificazione (punto 2.1.3), aggiungere 9,1 mg (per L di tampone in preparazione) di desipramina-HCl buffer.
   2. Preparare una soluzione di propranololo-HCl 1,0 micron e aggiungere 1 ml (per L di tampone in preparazione) di questa soluzione alla soluzione tampone Krebs-Henseleit. Rendere questo buffer nel giorno di utilizzo e mantenerlo a temperature myograph operativo (una temperatura che produce una temperatura di 37,5 ° nella myograph).
      NOTA: La desipramina viene aggiunto per inibire i meccanismi selettivi della ricaptazione delle ammine biogenee permettere compensazione di aggiunte sperimentali dal buffer di balneazione i vasi sanguigni a verificarsi più rapidamente. L'aggiunta di propranololo previene il legame di composti di trattamento di β-adrenergici recettori non specifico.

3 Raccolta e preparazione dei vasi

1. Non appena possibile, rimuovere il tratto gastrointestinale dalla carcassa. Una volta che l'animale non presenta alcun riflesso involontario, togliere la testa e nascondere e poi sollevare la carcassa in senso verticale. La rimozione dei visceri gastrointestinale (esofago all'ano) dalla carcassa dovrebbe essere completata da personale macelli riconosciuti (<20 min dal momento di stordimento).
   NOTA: quanto tempo, è generalmente limitata dalla posizione / struttura in cui il tratto intestinale viene raccolto da e procedure operative standard o procedure mandato federale seguite da personale dell'impianto.
   1. Nella maggior parte delle strutture, effettuare manipolazioni del tratto gastrointestinalein una posizione separata dalla trasformazione della carcassa che è destinata ad entrare nella alimentare. Utilizzare una zona comoda dove il tratto gastrointestinale può essere preso e sparsi per l'esame.
2. Una volta che il tratto gastrointestinale è sparso, identificare l'intestino tenue, la piega ileocecale collega il piccolo intestino per cieco, e la flangia ileale estende prossimalmente alla piega ileocecale (Figura 1A).
   1. Usando un bisturi o un coltello, molto leggermente fare un'incisione nella membrana mesenterica nel centro della flangia ileale. Utilizzando due dita indice, senza mezzi termini sezionare via il tessuto adiposo e connettivo, esponendo il sistema vascolare mesenterica (Figura 1B).
3. Da questa flangia o rigonfiamento nel mesentere intestinale, sezionare i rami multipli (~ 2 cm di lunghezza) delle arteria e vena mesenterica fasci esposti che supportano questa porzione dell'ileo (Figura 1C).
   1. Se ucantare pinze per afferrare il tessuto, fare attenzione a non afferrare o tirare direttamente sui vasi sanguigni a tutti durante la rimozione come qualsiasi tipo di stretching può danneggiare e effetto negativamente sulle prestazioni dei tessuti ^14. Rimozione dei vasi sanguigni è fatto meglio, tagliando attraverso ciascuna estremità della sezione da rimuovere e poi tagliando a fianco o parallela alla sezione ora isolato. Per facilità, rimuovere alcuni del tessuto circostante con vasi di fornire alcuni tessuti di cogliere con un paio di pinze.
   2. Con un paio di pinze, sommergere campione di tessuto in una provetta contenente ghiaccio freddo tampone Krebs-Henseleit e memorizzare in ghiaccio fino al trattamento può avvenire in laboratorio.
4. Mettere campione di tessuto su una superficie di taglio o in una scatola di Petri e parzialmente immergere in ghiaccio freddo Krebs-Henseleit.
   1. Utilizzando # 5 gioiellerie pinze, Noyes iris forbici, e la lampada di ingrandimento o dissezione portata (da 2,5 a 5.0X ingrandimento è sufficiente), sezionare con attenzione via il connecti grasso e dintornive tessuti e separare l'arteria e vena. Identificare l'apertura nave ad una estremità della sezione e afferrare con cura la fascia che circonda il vaso con le pinze.
   2. Effettuare un taglio con le forbici parallele alla nave facendo scorrere la punta della forbice sotto la fascia in rilievo. Dopo l'incisione iniziale, il grasso e tessuti connettivi possono essere ulteriormente staccati dal vaso riducendo entrambi i lati con le forbici. Assicurarsi che i vasi siano il più pulito possibile, riducendo al minimo la quantità di tempo che le navi passano in panchina.
   3. Ritorna vasi sanguigni per tubi di fresco tampone Krebs-Henseleit e conservare a 4 ° C (campioni rimangono memorizzati fino a 24 ore dopo la raccolta e ancora produrre dati contrattilità validi).
   4. Utilizzando una lama di rasoio, nave slice da utilizzare in myograph in numero desiderato di sezioni da 2 mm (è utile usare una affettatrice tessuto per ottenere sezioni coerenti).
   5. Esaminare ogni sezione sotto una sco dissezionepe (12,5X ingrandimento) per garantire che ogni sezione ha anomalie, rami, valvole, o danni superficiali inavvertitamente fatto durante la dissezione e la pulizia. Sostituire la sezione di nave se c'è qualche anomalia, ramo, valvola, o danni superficiali.
5. Conservare accettabili sezioni fette di navi (sommersi in tampone Krebs-Henseleit) su ghiaccio o a 4 ° C fino al momento per il montaggio in camere myograph (di solito <30 min).
6. Montare delicatamente il vaso sul myograph inserendo i supporti attraverso il lume e aumentare la tensione (utilizzando il micropositioner sul myograph) facendo attenzione a non allungare i vasi sopra una lettura da 2 a 3 g.
7. Una volta che tutte le camere sono coperte, aspirare il buffer da tutte le camere e riempire con 5,0 ml di tampone e avviare un timer di 15 minuti per iniziare il periodo di equilibrio e l'esperimento.

4 Experiment

1. Equilibrare tutte le sezioni delle navi per 1,5 ore per ottenere una res stabileting tensione di 1,0 g.
   1. Sostituire il tampone di incubazione Krebs-Henseleit ogni 15 min.
   2. Durante l'equilibrio, costantemente regolare la tensione sulle sezioni dei vasi sanguigni fino a 2 g e quindi consentire di rilassarsi fino a circa 0,80 g. Cercate di non consentire alle navi di rilassarsi troppo (potrebbero scivolare i supporti). Cercate di ottenere una tensione di riferimento costante, dove la nave detiene 1 g tensione senza necessità di regolazione.
2. Durante l'equilibrazione, preparare una soluzione acquosa 1,32 M di KCl da utilizzare come riferimento.
3. A seguito del completamento di una equilibrazione soddisfacente, aggiungere 500 ml di soluzione 1,32 M KCl comportare una soluzione 0,12 M in soluzione 5,5 ml balneazione nave.
   1. Dopo l'aggiunta di 1,32 M KCl, non regolare manualmente la tensione come la risposta massima di tale aggiunta viene utilizzato per valutare la vitalità del tessuto e può essere utilizzato per normalizzare i dati di trattamento (ad esempio risposte di concentrazione di un agonist).
   2. Sostituire il buffer in intervalli di 15 minuti fino a quando la tensione è tornato al valore basale di 1,0 g.
4. Una volta raggiunto basale, modificare il buffer e contemporaneamente iniziare un 1 min timer. Fate questo per tutte le camere simultaneamente per evitare un impressionante di orari di inizio.
   1. Agitare la norma da aggiungere e preparare un commento per camera 1 durante il conto alla rovescia 1 min.
   2. Aggiungere le norme in 25 aliquote microlitri di ciascuna camera come i dettami esperimento (questo mantiene il trattamento al di sotto dello 0,5% del volume totale).
   3. Una volta aggiunto l'ultimo livello, avviare un 9 min timer.
   4. Alla fine del 9 min di incubazione standard rimuovere il tampone di trattamento contenenti dalle camere e aggiungere 5,0 ml di tampone fresco, e avviare il timer 2,5 min.
   5. Ripetere il punto 4.4.4.
   6. Alla fine del secondo 2,5 min risciacquo, aspirare sezioni e aggiungere tampone fresco, e avviare un 1 min timer per conto alla rovescia l'inizio della secondad aggiunta standard.
5. Continuare con questo ciclo per tutte le aggiunte standard della giornata.
6. Durante l'aggiunta dello standard finale e la successiva 9 min di incubazione preparare il composto di riferimento M KCl 1,32 per un fine dose aggiunta di riferimento run di 500 microlitri.
7. Dopo l'intervallo di 1 min dopo l'aggiunta del trattamento finale, aggiungere il KCl e avviare un 9 min timer.
   NOTA: L'aggiunta KCl è quello di confermare la vitalità del tessuto a conclusione dell'esperimento ed è utile se la somministrazione di un trattamento che si traduce in risposta trascurabile.
8. Al termine della finale 9 min composto di riferimento di incubazione, aspirare o rimuovere il tampone da tutte le camere. Non aggiungere tampone fresco. Concludere l'esperimento.
9. Salvare il file grafico, rimuovere le sezioni dei vasi sanguigni e smaltire correttamente e seguire il protocollo pulizia (fornito dal costruttore e possono essere specifiche di laboratorio) per le apparecchiature myograph.

Risultati

I vasi sanguigni utilizzati per generare i risultati inclusi sono stati raccolti da 6 manzi Holstein (425 ± 8 kg) all'interno di un intervallo di 3 settimane. Un esempio di una tipica mesenterica risposta contrattile vena di KCl e aggiunte di trattamento in aumento in concentrazione è presentato in Figura 2. L'entità della risposta varierà alcuni con le dimensioni del vaso (correlata alla dimensione dell'animale donatore), ma può anche essere influenzato (negativamente) da un uso improprio (stretching) ...

Discussione

La sfida iniziale per lo sviluppo di questo saggio biologico è stato la creazione di un centro di raccolta ripetibile per vascolarizzazione mesenterica. Consistenza sito campione è critica, in quanto alcune delle funzioni del piccolo intestino cambiamento durante la progressione del digiuno attraverso l'ileo e conseguentemente il mesentere variano in un modello simile. I rami ileali di mesenterica e vena sono stati i più facilmente identificabili attraverso punti di riferimento anatomici. Collocando il cieco e segue...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Multi Myograph	Danish Myo Technologies	610M	Un miografo è fondamentale per questo biotest, ma ci sono altre piattaforme disponibili per l'uso che saranno sufficienti.
Powerlab 8/sp	ADIntruments	ML785
LabChart 7	ADInstruments	Versione 7
Kit di calibrazione della forza	Danish Myo Technologies	100055	Specifico per miografi DMT
Filtro per flaconi	Nalgene	595-4520	0.22 μ m dimensione dei pori; Misura del manico 45 mm
#5 Jewler' s Pinze	Miltex	555008FT	È possibile utilizzare qualsiasi marca di pinze
Noyes Forbici per iride	Miltex	18-1510	È possibile utilizzare qualsiasi marca di forbici
Cannocchiale da dissezione	Zeiss	Stemi 2000-C	Qualsiasi marca di microscopio ottico da dissezione sarà sufficiente
Tessuto regolabile Matrice	Braintree Scientific	TM C12	Questo non è fondamentale per il test, ma riduce notevolmente la variazione di lunghezza da sezione a sezione e accelera notevolmente il processo di affettatura
Krebs-Hensleit Buffer	Sigma-Aldrich	K3753-10x1L	Non è necessario acquistare Krebs, questo può essere fatto in casa
Cloruro di calcio disidratato	Sigma-Aldrich	C7902-500G
Bicarbonato di sodio	Sigma-Aldrich	S5761-500G
Desipramina-HCl	Sigma-Aldrich	D3900-5G
Propranolol-HCl	Sigma-Aldrich	P0884-1G
KCl	Sigma-Aldrich	P9333-500G
95% O2/5% CO2	Scott Gross	UN3156