Dopo l'esocitosi, la membrana plasmatica fusa viene recuperata attraverso un processo noto come endocitosi. Questo meccanismo riforma le nuove vescicole sinaptiche per il successivo ciclo di rilascio. I singoli eventi endocitici vengono catturati e analizzati attraverso l'uso delle registrazioni della capacità attaccata alle cellule nelle cellule cromaffini surrenaliche di topo.
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Articolo metodologico
Metodi per cellulari-attached Misure di capacità in mouse surrenale cromaffini cellulare
In questo articolo
Sommario
Abstract
La trasmissione neuronale è parte integrante della comunicazione cellulare all'interno del cervello. La depolarizzazione della membrana presinaptica porta alla fusione delle vescicole, nota come esocitosi, che media la trasmissione sinaptica. Il successivo recupero delle vescicole sinaptiche è necessario per generare nuove vescicole piene di neurotrasmettitori in un processo identificato come endocitosi. Durante l'esocitosi, la fusione delle membrane delle vescicole comporterà un aumento della superficie e la successiva endocitosi comporterà una diminuzione della superficie. Qui, il nostro laboratorio dimostra un'introduzione di base alle registrazioni della capacità attaccata alle cellule di singoli eventi endocitici nella cellula cromaffini surrenalica di topo. Questo tipo di registrazione elettrica è utile per registrazioni ad alta risoluzione di esocitosi ed endocitosi a livello di singola vescicola. Sebbene questa tecnica sia in grado di rilevare sia l'esocitosi che l'endocitosi delle vescicole, l'obiettivo del nostro laboratorio è l'endocitosi delle vescicole. Inoltre, questa tecnica ci permette di analizzare la cinetica di singoli eventi endocitici. Qui vengono descritti i metodi per la dissezione del tessuto della ghiandola surrenalica di topo, la coltura cellulare cromaffina, le tecniche di base di adesione alle cellule e i successivi esempi di tracce individuali che misurano un singolo evento endocitico.
Introduzione
Trasmissione sinaptica è mediata da esocitosi delle vescicole sinaptiche, contenenti neurotrasmettitori, e queste vescicole deve subire riciclaggio endocitica locale all'interno del nervo terminale per mantenere la comunicazione neuronale a lungo termine. Dato il ruolo essenziale della trasmissione sinaptica nel cervello, la comprensione del macchinario molecolare che costituisce il ciclo delle vescicole sinaptiche è un fondamento essenziale verso una migliore comprensione nella comunicazione cellulare nel suo complesso. Tra sistemi modello delle cellule, la cellula cromaffini surrenale ha fornito alcune delle l'intuizione più definitiva nel meccanismo moleco....
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Protocollo
NOTA: L'intera procedura è stata condotta in conformità con le linee guida del National Institutes of Health, come approvato dalla cura e uso degli animali Comitato della University of Illinois a Chicago.
1. Soluzioni e Media Cultura Preparati
- Conservare tutte le soluzioni a -20 ° C per un massimo di sei mesi. Tenere il terreno di coltura a 4 ° C per un massimo di 3 mesi.
- Preparare 100 ml di coltura mescolando 1 ml di soluzione di pen-strep e 1 ml di ITSX (Insulin-transferrina-Selenio-supplementazione) a 100 ml con DMEM.
- Preparare la soluzione enzimatica mescolando 250 ml di DMEM, 2,5 ml di 100 mM CaCl <....
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Risultati
La vitalità delle cellule e la qualità di tenuta gigaohm sono critici nel determinare la qualità delle registrazioni capacità della cella collegata. Pertanto, è fondamentale per procurare un coltura cellulare efficace ed efficiente prima di registrazioni elettrofisiologiche, e le cellule vitali tipiche sono illustrate nella figura 1. Practice e il tempo sarà utile nel raggiungimento di un sigillo gigaohm con alta qualità. Se si può vedere chiaramente deformazione cella quando la pipetta di patch sta avv.......
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Discussione
Misure di capacità cellulari iscritti richiedono diversi passaggi critici al fine di ottenere con successo le registrazioni di alta qualità: 1) cellule vitali e sane preparate dalle ghiandole surrenali; 2) il rivestimento PDL dei coprioggetto; 3) formazione sigillo gigaohm; 4) livello di rumore del sistema; e 5) correzione di fase.
Per la chirurgia animali, le modifiche si può potenzialmente fare è quello di regolare l'approccio chirurgico al meglio destrezza vestito e per evitare danni .......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Ringraziamenti
Questo lavoro è supportato da un premio della National Science Foundation (1145581) a LWG.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Poly-D-Lysine | Sigma | P0899 | |
| DMEM | 15066024 | Tenere lontano dai raggi UV | |
| Dulbecco' s Modified Eagle Medium | Life Technologies | ||
| Copertura in vetro | Carolina Biological | 633029 | 12 mm |
| Penicillina Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | 100 ml |
| di Insulin-Trans-Sel-X | Life Technologies | 51500056 | scongelare solo su ghiaccio! |
| Papain | Worthington | 39S11614 | |
| EPC-7 plus amplificatore di patch | HEKA | ||
| BNC-2090 scheda di acquisizione dati | |||
| Software di acquisizione dati Igor | Wavemetrics | ||
| P-97 estrattore di pipette | Sutter Instruments | ||
| Microforge | Scientific Instruments | ||
| Capillari in vetro borosilicato | Sutter Instruments | B150-110-10 | Diametro esterno: 1,5 mm Diametro interno: 1,10 mm Lunghezza: 10 cm |
Riferimenti
- Rettig, J., Neher, E. Emerging roles of presynaptic proteins in Ca++-triggered exocytosis. Science. 298, 781-785 (2002).
- Gong, L. W., et al. Phosphatidylinositol phosphate....
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Ristampe e permessi
