Method Article

Generazione di pluripotenti indotte cellule staminali da distrofia muscolare di pazienti: Efficient Riprogrammazione senza integrazione di origine urinaria Cells

DOI:

10.3791/52032

⸱

January 28th, 2015

 , 
1Department of Medicine, Medical College of Wisconsin

In This Article

Summary

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Questo protocollo prevede procedure dettagliate per l'isolamento di cellule derivate dalle urine da pazienti con distrofia muscolare; la loro riprogrammazione efficiente e rapida attraverso la trasduzione del virus Sendai.

Abstract

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Cardiomiopatia distrofico è una conseguenza poco conosciuta di distrofia muscolare. Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) di pazienti con distrofia muscolare è una fonte preziosa per cellulari in vitro sistemi modello di malattia in e può essere utilizzato per gli studi di screening di stupefacenti. Cellule urina paziente derivate sono stati utilizzati in riprogrammazione successo in cellule staminali pluripotenti indotte per modellare cardiomiopatia distrofica 1. Affrontare i problemi di sicurezza di integrazione di sistemi vettoriali, vi presentiamo un protocollo con un non-integrazione di Sendai virus vettore per la trasduzione di Yamanaka fattori in cellule di urina raccolti da pazienti affetti da distrofia muscolare. Questo protocollo genera completamente riprogrammato cloni entro 2-3 settimane. Le cellule pluripotenti sono esenti da vettore per il passaggio-13. Questi iPSCs distrofiche possono essere differenziati in cardiomiociti e utilizzati sia per studiare i meccanismi di malattia o per lo screening di stupefacenti.

Introduction

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Cardiomiopatia è la seconda causa di morte nei pazienti con Duchenne e Becker distrofia muscolare (MD). Sebbene mutazioni nel gene della distrofina X-linked si verificano in 1: 3.500 nati maschi, si sa molto poco circa gli eventi molecolari e cellulari che portano alla progressiva danni muscolo cardiaco. Cellule staminali pluripotenti indotte umane derivate da pazienti distrofia muscolare sono emersi come un nuovo strumento per studiare i meccanismi della malattia sottostante e da utilizzare per lo screening di stupefacenti 1,2.

Il disagio anticipata di biopsie cutanee o campioni di sangue possono dissuadere i pazienti giovani ....

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Protocol

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NOTA: I pazienti e / oi loro tutori dovrebbero dare il consenso informato a partecipare a un Institutional Review Board ha approvato lo studio.

1. Tamponi e preparati media

  1. Tampone di lavaggio: Per preparare 100 ml di soluzione di lavaggio, aggiungere 1 ml di 100x penna / Soluzione strep (100 U / ml penicillina + 100 mg / ml di streptomicina) a 99 ml di soluzione fisiologica tampone fosfato (PBS).
  2. Urinario cellule progenitrici (UPC) Media: Per preparare UPC media, mescolare volumi uguali di cheratinociti siero libero (KSF) Medium + Progenitor cellulare Medium.
    1. KSF Medium: Per preparare media dei cheratinociti....

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Results

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La maggior parte delle cellule progenitrici isolate da urina umana sono positivi per uroepithelial progenitrici e periciti marcatori quali CD44, CD73 e CD146 (97.37%, 97.09% e 97,3% rispettivamente; la figura 1A e 1B). Queste cellule hanno espresso altri marcatori mesenchimali come alfa-actina del muscolo liscio e vimentina (Figura 1B). RT-PCR dà prova di una popolazione mista di cellule nelle culture che non è debole espressione di Cytokeratin-7 (CK-7) e Uroplakin (UP).......

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Discussion

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Modellazione malattie cardiovascolari utilizzando iPSCs sta diventando un approccio comune per capire il contributo genetico 4-6. Alcune difficoltà impreviste di ottenere campioni di cellule da pazienti, soprattutto bambini, possono essere evitati, offrendo la possibilità di un approccio non invasiva come una raccolta di urina. In questo giovane popolazione di pazienti, è spesso difficile raccogliere un volume di urina sufficiente per produrre cellule urina sufficiente per la riprogrammazione. Coaching i picc.......

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Disclosures

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Acknowledgements

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Lo sviluppo di questo protocollo è stato supportato da Advancing a Healthier Wisconsin e dal National Center for Advancing Translational Sciences, National Institutes of Health, attraverso il numero di sovvenzione 8UL1TR000055. I suoi contenuti sono di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente le opinioni ufficiali del NIH.

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Materials

Antibodies

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Materials
4 Oz. Tazza per campioni con coperchioSTL Medical SupplyM9AMSAS340per la raccolta di campioni di urina
Provette BD-Falcon da 15 mlFisher Scientific352097
Provette BD-Falcon da 50 mlFisher Scientific352098
Vetrini coprioggetti rotondiFisher Scientific12-545-81
Kit di riprogrammazione CytoTune-iPS SendaiLife TechnologiesA1378-001
PBS, pH 7.4Life Technologies10010-023
Pen-Strep senza glutammina Life Technologies15140-122Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso
RPMI Medium 1640Life Technologies11875-093Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso
Supplemento di B-27 con insulina (50x)Life Technologies17504-044Caldo in 37 gradi; C bagnomaria prima dell'uso
Integratore B-27 senza insulina (50x)Life Technologies0050129SACaldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso
DMEM/F12 (1:1)Life Technologies11330-032Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso
Versene, 1:5.000Life Technologies15040066Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso
bFGF (10 µ g)Life Technologies13256-029Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso
Cartucce contacelluleLife TechnologiesC10228
Knockout Serum (500  Tecnologie divita10828-028Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso
Congelamento di colture cellulari di recupero MediumLife Technologies12648-010
Cheratinocita-SFM (1x), LiquidLife Technologies17005-042Caldo in 37 gradi; C bagnomaria prima dell'uso
DMEM, glucosio alto, GlutamaxLife Technologies10566-016Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima
dell'uso Ham's F-12 Nutrient Mix Life Technologies11765-054Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso
EGF proteina umana ricombinante, forma liquidaLife TechnologiesPHG0311Lcaldo in 37 gradi C bagno d'acqua prima dell'uso
Insulina, ricombinante umano, zinco SolnLife Technologies12585-014Caldo in 37 ° C bagnomaria prima dell'uso
TeSR-E8Stem Cell Technologies5940Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso
ROCK Inhibitor (Y-27632)SelleckS1049Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso
MatrigelBD Biosciences354277qualificata hESC, LVED
Free RNeasy Mini Kit Qiagen74104
Kit di sintesi iScript cDNABio-Rad170-8890
DreamTaq Green PCR Master Mix (2x)Thermo-ScientificK1081
FBS-QualificatoSigma AldrichF6178Caldo in 37 gradi ... C bagnomaria prima dell'uso
Bioreagente AdeninaSigma AldrichA2786-5GCaldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso
Tossina del colera da Vibrio choleraeSigma AldrichC8052-.5MGCaldo in 37 ° C bagnomaria prima dell'uso
IdrocortisoneSigma AldrichH0888-1GCaldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso
Olo-transferrina da SigmaAldrichT0665-50MGumano caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso
3,3',5-Triiodo-L-tironina sale sodicoSigma AldrichT6397-100MGCaldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso
DAPI Santa Cruz BiotechnologySC-3598
Fluoromount Aquous mount mediumSigma AldrichF4680
16% ParaformaldeideAlfa-Aesar43368<
Mouse anti CD44 - marcato con FITC BD Biosciences560977
Topo anti CD146 - marcato con PEBD Biosciences561013
Topo anti CD73 - marcato con PEBD Biosciences561014
Topo anti-alfa;-actina muscolare lisciaSigma AldrichA2547
Topo anti-VimentinaAbcamab8978-100
Topo Anti - TRA-1-81Life Technologies411100
Coniglio anti 3/4 ottobreSanta Cruz BiotechnologySC-9081
Topo anti distrofinaLeica BiosystemsNCL-DYSB
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References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Guan, X., et al. Dystrophin-deficient cardiomyocytes derived from human urine: New biologic reagents for drug discovery. Stem Cell Research. 12 (2), 467-480 (2014).
  2. Dick, E., et al.

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Induced Pluripotent Stem CellsMuscular Dystrophy PatientsUrine Derived CellsSendai Virus ReprogrammingIntegration Free MethodYamanaka Factors TransductionPluripotency ConfirmationFlow Cytometric AnalysisReverse Transcriptase PCRCardiomyocyte Differentiation

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