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Articolo metodologico

Saggi tossicologici per gli effetti di prova di un epigenetica droga sullo sviluppo, Fecondità e Sopravvivenza di malaria zanzare

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DOI:

10.3791/52041

⸱

16 gennaio 2015

 ,  , 
1Department of Entomology, Virginia Tech

In questo articolo

Sommario

Viene sviluppato un protocollo per esaminare gli effetti di un farmaco epigenetico DZNep sullo sviluppo, la fecondità e la sopravvivenza delle zanzare. Qui descriviamo le procedure per l'esposizione acquosa di DZNep a zanzare immature e un'esposizione ematica di DZNep a zanzare adulte, oltre a misurare l'inibizione dell'idrolasi SAH.

Abstract

Resistenza insetticida pone un grave problema per i programmi di controllo della malaria. Le zanzare si adattano a una vasta gamma di cambiamenti nell'ambiente rapidamente, rendendo il controllo della malaria un problema onnipresente nei paesi tropicali. L'emergere di popolazioni resistenti agli insetticidi garantisce l'esplorazione di nuovi percorsi di destinazione della droga e composti per il controllo del vettore zanzara. Farmaci epigenetici sono ben stabiliti nella ricerca sul cancro, tuttavia, non si sa molto circa i loro effetti sugli insetti. Questo studio fornisce un semplice protocollo per esaminare gli effetti tossicologici di 3 Deazaneplanocin A (DZNep), un farmaco epigenetico sperimentale per la terapia del cancro, sul vettore della malaria, Anopheles gambiae. Un aumento di concentrazione-dipendente della mortalità e riduzione delle dimensioni è stata osservata in zanzare immaturi esposti a DZNep, mentre il composto ha ridotto la fecondità delle zanzare adulte rispetto a controllare i trattamenti. Inoltre, c'è stata una diminuzione tossicodipendenti in S -adenosilomocisteina (SAH) attività di idrolasi in zanzare in seguito all'esposizione a DZNep rispetto per controllare i trattamenti. Questi protocolli forniscono il ricercatore con una semplice procedura, step-by-step per valutare più endpoint tossicologici per un farmaco sperimentale e, a sua volta, dimostrano un approccio multi-polo unico per esplorare gli effetti tossicologici di farmaci o composti di epigenetici idrosolubili interessi contro le zanzare vettore e altri insetti.

Introduzione

La malaria è responsabile per il maggior numero di decessi insetti correlati al mondo. Si stima che circa 219 milioni di casi si verificano ogni anno in tutto il mondo, causando circa 660.000 morti, soprattutto in Africa 1. Nonostante gli sforzi concertati, la malaria programmi devono affrontare diverse sfide. Mentre insetticide trattati zanzariere e coperte componenti chiave forma irrorazione residue del programma, la resistenza agli insetticidi in popolazioni locali ostacolano questi sforzi 2. Il rapido aumento delle popolazioni di zanzare resistenti agli insetticidi è in gran parte attribuibile alla capacità delle zanzare di malaria di adattarsi rapidamente ai cambiamenti nel loro ambiente e sfruttare diverse nicchie 3,4,5. Per superare gli attuali meccanismi di resistenza agli insetticidi, l'esplorazione di nuovi obiettivi insetticida e composti di nuova generazione è garantito. Un protocollo semplice, step-by-step per determinare l'efficacia di insetticidi sperimentali sulle diverse fasi di vita della malaria mosquitoes avrebbero migliorare significativamente questi sforzi.

Studi farmacologici di effetti dei farmaci sulle linee cellulari e modelli animali hanno stabilito l'uso di farmaci epigenetici come un utile strumento per modulare la genetica e la fisiologia delle cellule e degli organismi. Metilazione del DNA e modificazione degli istoni sono due meccanismi epigenetici che influenzano l'espressione genica in organismi pluricellulari senza cambiare la sequenza del DNA sottostante 6. Modificazioni post traduzionali quali metilazione svolgono un ruolo cruciale nel mantenimento dell'integrità cellulare e l'espressione genica, e possono influenzare alcuni processi fondamentali 7,8,9. La ricerca in alcune specie di insetti hanno evidenziato l'importanza di epigenetica in processi che coinvolgono oogenesi e staminali manutenzione cella 10, così come compensazione del dosaggio 11. Tuttavia, sono ancora da esplorare questi aspetti in vettori di malattie. Utilizzo di un composto a modulare questo sistema in zanzare potrebbe fornirci inluoghi nel romanzo percorsi di destinazione insetticida. 3-Deazaneplanocin A (DZNep) è un inibitore della metilazione dell'istone noto, che hanno un impatto su vari tipi di tumori sono stati studiati 12,13,14,15,16. DZNep è un farmaco stabile idrosolubile epigenetica che inibisce indirettamente istone lisina N -methyltransferase (EZH2), un componente del complesso Polycomb repressione 2 (PRC2) in cellule di mammifero. PRC2 svolge un ruolo importante nel regolare la crescita delle cellule staminali in organismi pluricellulari, e metilazione è un aspetto fondamentale della PRC2 mediato silenziamento genico. Nei topi immunocompromessi, cellule pre-trattati con DZNep hanno dimostrato di essere meno cancerogeno 17. Questo farmaco sta diventando utilizzato per lo studio di altre malattie, come la malattia del fegato grasso non-alcolica, in cui è implicato EZH2 18. DZNep è un consolidato S -adenosylhomocysteine ​​(SAH) inibitore idrolasi 19, 20. L'inibizione dei risultati idrolasi SAH in unaccumulo di SAH e, a sua volta, porta alla inibizione dell'attività metiltransferasi limitando gruppi donatori di metile disponibili. SAH è un derivato aminoacido utilizzato da molti organismi, inclusi gli insetti, nelle loro vie metaboliche. Un recente studio ha dimostrato che DZNep in basse dosi possono influenzare diapausa e ritardare lo sviluppo negli insetti 21.

Qui, un protocollo robusto per studiare gli effetti di un composto solubile in acqua su diverse fasi di vita di zanzare si sviluppa. Le tre parti di questo protocollo sono le istruzioni per esaminare gli effetti di un composto idrosolubile sulle zanzare immaturi, adulti femmine si nutrono di sangue, e l'attività enzimatica di maschio adulto e zanzare femmina. Innanzitutto, DZNep viene sciolto in acqua per studiare lo sviluppo zanzara immaturo e sopravvivenza. Questa operazione viene eseguita in due concentrazioni di confrontare le differenze derivanti da aumento di 10 volte in esposizione al farmaco. Per esplorare l'effetto del farmaco sulla adulti zanzare femmina, DZNepsi aggiunge al sangue di pecora defibrillato e alimentato artificialmente il sangue alle femmine. Successivamente, il risultato del farmaco sulla fecondità viene esaminato. Infine, un saggio di attività enzimatica viene eseguita utilizzando 5,5'-dithiobis- (acido 2-nitrobenzoico) (DTNB) come indicatore per determinare l'effetto di DZNep sulla SAH idrolasi inibizione maschio adulto e zanzare femmina. Mentre questo protocollo è sviluppato con una zanzara malaria, Anopheles gambiae, può essere facilmente adattato per studiare gli effetti dei composti di interesse in qualsiasi specie di zanzara o altri insetti. Le tecniche descritti in questo protocollo non possono essere applicate in modo efficiente per un farmaco con limitata o nessuna solubilità in acqua o mezzi acquosi.

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Protocollo

NOTA: Le tre parti del protocollo descrivono l'esposizione acquosa del farmaco DZNep alle zanzare larvali, un'esposizione a base di sangue di DZNep per femmine adulte di studiare l'effetto della fecondità, e SAH idrolasi inibizione da DZNep misurati utilizzando una semplice tecnica colorimetrica. Una rappresentazione schematica di questi test è mostrato in figura 1.

1. immaturi Mosquito sviluppo e la sopravvivenza saggi

NOTA: Questa sezione spiega l'uso di un farmaco solubile in acqua che colpisce lo sviluppo larve di zanzara e la sopravvivenza.

  1. Hatch A. uova gambiae a 28 ° C in acqua distillata (dH 2 O) e posteriore loro di 2 ° instar larve.
  2. Prendete un DNAse sei bene, RNAse gratuito piastra di coltura cellulare e versare 10 ml dH 2 O per ogni bene.
  3. Selezionare le larve di zanzara al 2 ° instar e aggiungere 15 larve per bene. Prima di aggiungere 2 ° instar larve alla piastra, pli ut su un tovagliolo di carta per 2-3 secondi per eliminare l'acqua in eccesso.
  4. Pozzi Label con nastri colorati di randomizzare esperimento. Etichetta 2 pozzetti per concentrazione di prova su ciascuna piastra (Figura 2).
  5. Preparare una cloridrato 1 DZNep mm (MW = 298,73) stock soluzione sciogliendo 0,3 mg DZNep in 1 ml di dH 2 O. Aggiungere soluzione madre di DZNep.HCl ai pozzi etichettati per ottenere una concentrazione finale di 0,5 micron e 5,0 micron.
    NOTA: La soluzione madre può essere conservato a 4 ° C per il breve termine (1 giorno a un mese) o -20 ° C per un lungo periodo (più di un mese).
    NOTA: aggiunta della soluzione stock con concentrazioni suddetti non cambierà il volume di acqua nei pozzi significativamente. Tuttavia nel caso di concentrazioni molto più elevate, si consiglia di sciogliere il composto nel mezzo larvale per evitare qualsiasi diluizione inutili del composto.
  6. Aggiungere la stessa quantità di cibo per pesci fiocco di ogni bene. Coprire la piastras e incubare a 28 ° C in un incubatore.
  7. Registrare la mortalità per le zanzare larve DZNep-trattati e non trattati, dopo un periodo di esposizione di 24 ore. Rimuovere e scartare qualsiasi larve morte. Ripetere questa registrazione ogni giorno fino a quando tutti muoiono larve o pupate ed emergere come gli adulti. Registrare le dimensioni delle larve ogni due giorni, ossia, il giorno 0, 2, 4, 6, 8, fino pupate.
  8. Analizzare lo sviluppo e mortalità larvale dati mediante un adeguato software di analisi statistica.
    NOTA: Un grafico a barre può essere utilizzato per rappresentare i dati di mortalità in Microsoft Excel. Analisi multivariata della varianza (MANOVA) eseguita con un software come JMP o SPSS rivelerà se diverse dosi del farmaco determinano sopravvivenza significativamente differente di larve di zanzara.

2. Fecondità Assay somministrando Drug Attraverso alimentatore artificiale a Female zanzare

NOTA: Questa sezione descrive l'aggiunta del farmaco al sangue unnd alimentandola a zanzare femmina adulti utilizzando un sistema di alimentazione artificiale.

  1. Impostare gabbie zanzara adulta, con uguale numero di zanzare maschio e femmina per il controllo e la gabbia di prova. Fornire una soluzione di zucchero del 10% imbevuto di batuffoli di cotone per entrambe le gabbie fino le femmine sono pronte per l'alimentazione (3-5 giorni è ottimale per la Anopheles gambiae).
  2. 2 ore prima della somministrazione di sangue, rimuovere le palline di cotone per assicurare le femmine sono affamati.
  3. Assemblare due alimentatori sanguigni artificiali che consistono di un ampio imbuto rovesciato fondo di vetro (diametro = 50 mm, lunghezza = 70 mm) e una plastica circostante sigillato con colla industriale. Montare tubi di plastica (diametro = 7 mm) a due uscite alimentatori "(diametro 10 mm) tramite connettori per afflusso e il deflusso delle acque. Etichettare i due alimentatori come "controllo" e "5 micron DZNep."
  4. Utilizzando un elemento riscaldante disponibile in commercio, impostare il programma per l'alimentazione. In "Menu" andare su "Impostazioni"e selezionare "Valori di riferimento"; appariranno programmi precaricati. Selezionare "SP1" e impostare la temperatura per 37 ° C.
    NOTA: La resistenza assicura che il sangue somministrata viene mantenuto ad una temperatura costante. Impostazioni del programma aggiuntive possono essere utilizzate per diverse specie di zanzare o di insetti.
  5. Riempire un secchio con acqua e immergere l'elemento riscaldante in acqua.
  6. Tagliare un pezzo quadrato di Parafilm (50 mm x 50 mm) e si estendono per fare un film sottile membranosa. Coprire il fondo delle mangiatoie artificiali con il Parafilm. Tagliare un altro pezzo di Parafilm (50 mm x 10 mm), allungare e sigillare i bordi degli alimentatori.
  7. Assemblare il sistema, collegando gli alimentatori e resistenza dai tubi. Una volta completato, accendere il sistema e selezionare "SP1". Premere "Enter" per avviare il sistema.
    NOTA: L'acqua avrà riscaldata a 37 ° C e mantenuta a tale temperatura.
  8. Monitor the la temperatura dell'acqua con un termometro nel secchio d'acqua.
    NOTA: I connettori e tubi aiutano a mantenere una costante circolazione di acqua attraverso il sistema in modo che la temperatura del sangue rimane a 37 ° C.
  9. Riempire un vassoio fondo piatto con una soluzione di candeggina al 10% che verrà utilizzata per decontaminare eventuali sversamenti di sangue.
  10. Aggiungere 2 ml di sangue di pecora defibrillato in una provetta. Etichettare questo come "Control". Ripetere il processo per il tubo sperimentale etichettato come "5 micron DZNep" Add 6 ml di soluzione di riserva DZNep (vedi punto 1.5) al tubo sperimentale con l'etichetta "5 micron DZNep" mescolare delicatamente il sangue e droga invertendo più volte. Incubare il tubo 10 minuti a temperatura ambiente.
  11. Utilizzando una pipetta, aggiungere 2 ml di controllo e di sangue di prova per la parte superiore di alimentatori corrispondentemente etichettati. Gettare la pipetta nella soluzione di candeggina. Coprire la gabbia con un sacchetto scuro e respirare l'aria sulla gabbia periodicamente per incoraggiare females per l'alimentazione.
  12. Lasciate che le zanzare si nutrono per circa 30 min. Una volta che l'alimentazione è completata, spegnere la resistenza, prendere le mangiatoie fuori e striscia la Parafilm. Mettere a bagno l'alimentatore in soluzione di candeggina per circa 5 minuti e risciacquare bene con acqua deionizzata.
  13. Rimuovere gli alimentatori e mettere batuffoli di cotone con acqua e zucchero sulle gabbie per 48 ore. Inserire un piatto di uova contenente acqua e carta da filtro nelle gabbie durante la notte per facilitare la deposizione delle uova. Etichettare ogni piatto di uova con la rispettiva concentrazione di prova o di controllo.
  14. Rimuovere il piatto di uova giorno successivo ed esaminare il numero e la struttura di uova al microscopio stereo. Ottenere immagini utilizzando il software Q-colors5. Contare il numero di uova. Analizzare differenza nel numero di uova provenienti da test e di controllo gabbie.
    NOTA: Un t-test non appaiati può essere utilizzato per determinare se il numero di uova sono significativamente differenti (p ≤0.05).

3. biochimica Assay di Mosquito Enzyme Inhibitionby Drug

NOTA: Questa sezione descrive un saggio di attività enzimatica utilizzando DTNB come indicatore per determinare l'effetto di DZNep su SAH idrolasi inibizione in maschio adulto e zanzare femmina.

  1. Preparare una soluzione 0,1 M Na 2 HPO 4 (sodio fosfato bibasico) aggiungendo 14,19 g di Na 2 HPO 4 a 1 L di dH 2 O. Quindi, preparare una soluzione 0,1 M NaH 2 PO 4 (sodio fosfato monobasico) aggiungendo 13,79 g di NaH 2 PO 4 a 1 L di dH 2 O.
  2. Titolare il M Na 2 HPO 4 soluzione 0.1 con la soluzione 4 0.1 M NaH 2 PO a pH 8,5.
    NOTA: Questa sarà la soluzione madre di lavoro di 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5).
  3. Preparare una soluzione di omogeneizzazione 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5) aggiungendo 0,3% Triton X-100.
    NOTA: La soluzione di omogeneizzazione può essere conservato a 4 ° C.
  4. Prepare una soluzione 1.6 mM SAH (MW = 384,4) sciogliendo 6,15 mg di SAH in 10 ml di 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5).
  5. Preparare una soluzione 1.6 mM DTNB (MW = 396.4) sciogliendo 6,3 mg di DTNB in 10 ml di 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5). Mantenere la soluzione DTNB fresco sul ghiaccio fino al momento dell'uso.
  6. Preparare una DZNep.HCl 1 mM (MW = 298,73) soluzione sciogliendo 0,3 mg di DZNep in 1 ml dH 2 O. Successivamente, diluire la soluzione 1 mM DZNep in una serie di concentrazioni da 1,000 a 0,002 mM mM in dH 2 O.
  7. Per misurare la SAH idrolasi inibizione da DZNep, preparare un estratto enzimatico crudo di zanzare: Omogeneizzare 10 zanzare adulte non sangue-fed in 1 ml di ghiacciata 0,1 M NaH 2 PO 4 (pH 8,5), contenente 0,3% Triton X- 100, utilizzando un omogeneizzatore fibra di vetro. Trasferire l'omogeneizzato in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga.
  8. Centrifugare l'omogeneizzato per 5 minuti a 10.000 xg a 4 ° C. Trasferire il surnatante in un ambiente pulito1,5 ml provetta. Utilizzare il surnatante come fonte dell'enzima per il saggio biochimico SAH.
  9. Per il trattamento vuota (cioè non DZNep, senza enzimi), aggiungere 50 microlitri 1.6 SAH mM, 50 microlitri 1.6 DTNB mM, e 100 microlitri 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5) per i singoli pozzetti di una 96 pozzetti, micropiastra fondo piatto.
  10. Per il controllo (cioè non DZNep), aggiungere 50 microlitri 1.6 SAH mM, 50 microlitri 1.6 DTNB mM, 50 microlitri 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5) e 50 microlitri enzima (SAH idrolasi ottenuto da estratto grezzo) all'individuo pozzi.
  11. Per i trattamenti DZNep, aggiungere 50 ml 1.6 SAH mm, 50 ml 1.6 DTNB mm, 50 microlitri di enzimi e 50 ml concentrazione DZNep selezionato singoli pozzi. Preparare 4 repliche per il trattamento e il controllo.
  12. Leggere la densità ottica (OD) dei campioni enzimatici SAH a 405 nm per 5 minuti a intervalli di 20 sec utilizzando un lettore di micropiastre a 96 pozzetti.
  13. Sottrarre la DO vuoto dal controllo di unnd trattamento OD ottenuto da ciascun pozzetto. Calcolare la percentuale rimanente attività di idrolasi SAH utilizzando la seguente equazione:% residuo attività = (Trattamento OD / controllo OD) x 100.

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Risultati

La figura 1 è una rappresentazione schematica dei saggi; descrive le varie fasi della procedura descritta in questo articolo. Poiché il protocollo si basa su diversi cicli di vita zanzare, non vi è alcuna particolare sequenza da seguire per gli esperimenti qui descritti. L'utente può scegliere di effettuare uno o più test contemporaneamente, a seconda della disponibilità di esempio.

Figura 2 mostra la piastra impostato per lo sviluppo e la sopravviven...

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Discussione

Ci sono diversi passaggi vitali per l'efficace applicazione di questo protocollo. Per il saggio larvale, occorre prestare attenzione a etichettare e replicare ogni concentrazione correttamente. Randomizzazione campioni di prova e aggiungendo la quantità di farmaco designato a rispettivi pozzetti di test è una parte importante di questo set up sperimentale. Prima di aggiungere 2 ° instar larve di zanzara ad una micropiastra a 96 pozzetti, ogni larva può essere messo su un tovagliolo di carta per 2-3 second...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo Victor Marquez per aver fornito DZNep.HCl e Scotty Bolling per la produzione degli alimentatori di sangue. I ceppi Mopti e SUA2La di An. gambiae sono stati ottenuti dal Malaria Research and Reference Reagent Resource Center (MR4). Questo lavoro è stato sostenuto dal Fralin Life Science Institute e dalla sovvenzione del National Institutes of Health 1R21AI094289 a Igor V. Sharakhov.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
micropiastra a 96 pozzettiFisher Scientific12565561
Piastra per colture cellulariCytoOneCC7682-7506
CentrifugaSorvall Fresco76003758È possibile utilizzare una centrifuga diversa
Rotoli di nastro adesivo coloratiFisherS68134
Microscopio di dissezioneOlympusSZ
DTNBSigma AldrichD8130
DZNep.HClSigma AldrichSMLO305
per piatti per uova
Carte da filtroFisher09-795E
Alimentatori in vetroVirginia Tech
Omogeneizzatore
Elemento riscaldanteFisherScientific NC0520091
IncubatricePercival scientificI36VLC8È possibile utilizzare un'incubatrice diversa
Provetta per microcentrifuga, 2  mlAxygen22-283
Provetta per microcentrifuga, 1,5  mlAxygenMCT-150-C
MicropipettaEppendorf4910 000.069
Na2HPO4Fisher ScientificM-3154
NaH2PO4Fisher ScientificM-8643
Misuratore di pH Mettler Toledo 7easyS20
Lettore di lastreSpectramaxM2
SAHSigma AldrichA9384negozio a -20 ° C
Triton X-100Sigma AldrichT8787
Tazze per tessuti in vetro

Riferimenti

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