In questo protocollo, verrà illustrata la derivazione di cellule progenitrici cardiache da cellule staminali embrionali sia di topo che umane. Una delle principali strategie di questo protocollo consiste nell'arricchire le cellule progenitrici cardiache con la citometria a flusso utilizzando reporter fluorescenti ingegnerizzati nelle linee di cellule staminali embrionali.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Derivazione di cellule cardiache progenitrici di cellule staminali embrionali
In questo articolo
Avviso di errata corrige
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Sommario
Abstract
Le cellule progenitrici cardiache (CPC) hanno la capacità di differenziarsi in cardiomiociti, cellule muscolari lisce (SMC) e cellule endoteliali e sono molto promettenti nella terapia cellulare contro le malattie cardiache. Tra i vari metodi per isolare le CPC, la differenziazione delle cellule staminali embrionali (ESC) in CPC attira grande attenzione nel campo poiché le ESC possono fornire una fonte cellulare illimitata. Di conseguenza, sono state sviluppate numerose strategie per derivare le CPC dalle ESC. In questo protocollo, viene descritta la differenziazione e la purificazione delle CPC embrionali sia da ESC di topo che da quelle umane. A causa della difficoltà di utilizzare marcatori di superficie cellulare per isolare le CPC embrionali, le ESC sono ingegnerizzate con reporter fluorescenti attivati dall'espressione della cre ricombinasi specifica per CPC. Pertanto, le CPC possono essere arricchite mediante smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS). Questo protocollo illustra le procedure per formare corpi embrioidi (EB) da ESC per la specificazione e l'arricchimento della CPC. Le CPC isolate possono essere successivamente coltivate per la differenziazione del lignaggio cardiaco e altri saggi biologici. Questo protocollo è ottimizzato per una derivazione robusta ed efficiente di CPC da ESC sia di topo che umano.
Introduzione
Le malattie cardiache rimane la causa nel mondo leader di oggi e il tasso di mortalità sono rimasti pressoché invariati negli ultimi due decenni (American Heart Association). Vi è una necessità critica per lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche per prevenire o invertire l'insufficienza cardiaca in modo efficace. Una strategia promettente è terapia cellulare a seguito del rapido sviluppo della biologia delle cellule staminali 1. A questo proposito, CPC multipotenti potrebbero essere una fonte eccellente cellule per la terapia a causa della loro capacità di proliferare ma impegnata solo differenziazione lineage cardiaca. Pertanto, il metodo efficien....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
1. Derivazione embrionali di topo CPC da mouse CES
- Preparare il mouse fibroblasti embrionali (MEF) feeder layer.
- Medio MEF caldo (10% FBS in DMEM) a 37 ° C.
- Preparare piatti gelatina rivestito.
- Aggiungere 1 ml di 0,1% di gelatina in acqua in un pozzetto della piastra da 6 pozzetti o 5 ml in un piatto 10 cm.
- Lasciare piatti o piatti a 37 ° C oa temperatura ambiente per almeno 30 min. Aspirare la gelatina prima dell'uso.
- Scongelare irradiato MEF rapidamente in un bagno d'acqua a 37 ° C, agitando delicatamente.
- Trasferire le cellule delicatamente per un tubo da 15 ml o 50 ml. Aggiunge....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Il protocollo mostra derivazione del CPC da diverse linee di cellule ES. CES sono aggregati per formare EB di differenziarsi in CPC. CES sono regolarmente mantenuti su alimentatori MEF (Figura 1A, F) e alimentatori vengono rimossi prima di differenziazione. Su aggregazione dei CES in EBs in terreno di differenziamento (Figura 1B, G), il secondo EBs formati vengono trattati con Bmp4 e Activin A per migliorare la differenziazione mesoderma in linee cellulari di topo (Figura 1C).
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Questo protocollo combina un metodo che utilizza fattori di crescita per guidare la differenziazione delle mESC e la differenziazione spontanea delle ESC umane in CPC. Il lignaggio delle CPC marcato con reporter fluorescente viene utilizzato per identificare e isolare in modo efficiente le CPC mediante FACS. Le CPC purificate con FACS mantengono la capacità di differenziarsi in cardiomiociti, muscolatura liscia e cellule endoteliali e hanno un profilo di espressione paragonabile alle cellule in vivo. Pertanto, questi CPC.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Ringraziamo il Dr. Leonid Gnatovskiy per la sua lettura attenta e critica dell'articolo. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni del National Institutes of Health (HL109054) e del Samuel and Jean Frankel Cardiovascular Center, University of Michigan (Inaugural Fund) a WZ e dalla Leon H Charney Division of Cardiology, New York University School of Medicine a BL.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| FBS | Thermo scentific | SH30070.03E | |
| Knockout SR | Life tecnologia | 10828028 | |
| Knockout DMEM | Life 10829018 | ||
| DMEM | Life 11965118 | ||
| NEAA | Life 11140050 | ||
| GlutaMAX | Life 35050061 | ||
| Tecnologia N2 | Life | 17502048 | |
| B27 | Life | 12587010 | |
| Ham' s Tecnologia F12 | Life | 11765062 | |
| Tecnologia IMDM | Life | 12440061 | |
| Pen/Strep | Life Tecnologia | 15140122 | |
| Piruvato | Life 11360070 | ||
| Dispase | Life | 17105041 | |
| Stempro-34 | Life Technology | 10639011 | |
| DMEM/ Tecnologia F12 | Life | 11330032 | |
| BSA | Tecnologia della vita | 15260037 | |
| tripsina | Tecnologia di vita | 25200056 | |
| acido ascobico | Sigma | A5960 | |
| 1-Tioglicerina | Sigma | M1753 | |
| 2-Mercaptoetanolo | Sigma | M3148 | |
| VEGF | R& D | 293-VE | |
| Bmp4 | R& D | 314-BP | |
| ActivinA | R& D | 338-AC | |
| bFgf | R& D | 233-FB | |
| Fgf10 | R& D | 345-FG | |
| mTeSR | Tecnologie delle cellule staminali | 5850 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 |
Riferimenti
- Garbern, J. C., Lee, R. T. Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration. Cell Stem Cell. 12 (6), 689-698 (2013).
- Passier, R., van Laake, L. W., Mummery, C. L. Stem-cell-based therapy and lessons from the heart. Nature. 453 (7193), 322-329 (2008).
- Bon....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
Errata corrige
Formal Correction: Erratum: Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells
Posted by JoVE Editors on 8/10/2016. Citeable Link.
A correction to the author list was made to: Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells.
The following author is now listed as a co-corresponding author:
Lei Bu
