Isolamento e quantitativa immunocitochimica caratterizzazione di cellule miogeniche primarie e fibroblasti da muscolo scheletrico umano

Summary

I principali tipi di cellule aderenti derivati dal muscolo umano sono le cellule miogeniche e i fibroblasti. Qui, le popolazioni cellulari vengono arricchite utilizzando lo smistamento cellulare attivato magneticamente basato sull'antigene CD56. La successiva immunomarcatura con anticorpi specifici e l'uso di tecniche di analisi delle immagini consentono la quantificazione delle caratteristiche citoplasmatiche e nucleari nelle singole cellule.

Abstract

La riparazione e rigenerazione del muscolo scheletrico richiede l'azione di cellule satelliti, che sono le cellule staminali muscolari residente. Questi possono essere isolati da campioni di biopsia muscolare umana utilizzando la digestione enzimatica e le loro proprietà miogenici studiate in cultura. Quantitativamente, i due principali tipi di cellule aderenti ottenuti dalla digestione enzimatica sono: (i) le cellule satellite (chiamate cellule miogeniche o cellule precursori del muscolo), identificato inizialmente come CD56 ⁺ e poi come ⁺ desmina ⁺ cellule CD56 / e (ii) muscolo- fibroblasti derivati, identificati come CD56 ^- e TE-7 ^+. I fibroblasti proliferano molto efficiente in cultura e in popolazioni di cellule miste queste cellule possono invadere le cellule miogeniche a dominare la cultura. L'isolamento e purificazione di diversi tipi di cellule di muscolo umano è quindi un importante considerazione metodologica quando si cerca di studiare il comportamento innata di entrambi i tipi di cellule in coltura. Qui DESCRIBE un sistema di ordinamento basata sulla digestione enzimatica delicata delle cellule usando collagenasi e dispasi seguita da magnetico cellule attivate classificare (MACS) che fornisce sia una purezza elevata (> cellule miogeniche 95%) e buona resa (~ 2,8 x 10 ⁶ ± 8.87 x 10 ⁵ cellule / g di tessuto dopo 7 giorni in vitro) per esperimenti in coltura. Questo approccio si basa sul incubando la popolazione mista di cellule derivate muscolare con microsfere magnetiche microsfere coniugate ad un anticorpo contro CD56 e poi passando cellule se un campo magnetico. CD56 ⁺ cellule legate a microsfere sono conservati dal campo, mentre CD56 ^- le cellule passano senza impedimenti attraverso la colonna. Le sospensioni cellulari da qualsiasi fase del processo di selezione possono essere placcati e colto. Dopo un determinato intervento, morfologia cellulare, e l'espressione e la localizzazione delle proteine ​​compresi fattori di trascrizione nucleare può essere quantificato utilizzando etichettatura immunofluorescenza con anticorpi specifici e un'immagine processing e pacchetto di analisi.

Introduction

La riparazione e la rigenerazione del muscolo scheletrico richiede l'azione delle cellule satelliti ^1, le cellule staminali miogeniche ^2,3. In vivo esistono queste cellule in uno stato di quiescenza reversibilmente situato tra il sarcolemma e la lamina basale di ogni myofibre, ma si attivano a proliferare, fusibile e differenziare in tessuto muscolare è danneggiato, riparati e rigenerati ^3. Le cellule satelliti possono essere isolate da biopsie muscolari umane giovani e anziani con la digestione enzimatica ⁴ e le loro proprietà miogenici può essere successivamente studiato in colture primarie ^5. L....

Protocol

NOTA: Per gli studi condotti nel nostro laboratorio tutti i soggetti hanno dato il loro scritto, il consenso informato a partecipare e tutti gli esperimenti sono stati eseguiti con l'approvazione UK National Health Service Comitato Etico (London Research Comitato Etico; riferimento: 10 / H0718 / 10), e in conformità con la legge Human Tissue e Dichiarazione di Helsinki.

1. Preparazione iniziale prima della Biopsia muscolare (15 min)

1. Fai terreno di crescita del muscolo scheletrico umano. Per una sterile tubo da 50 ml graduato aggiungere 2,5 ml della miscela integratore, 10 ml di siero fetale di vitello, antibiotici (penicill....

Results

Cellule miogeniche depurato e fibroblasti possono essere coltivate in terreno di differenziamento adipogenico per tre giorni, seguiti da medie nutrizione adipogenico ovunque tra 7-30 giorni per valutare il loro potenziale di adipogenesi. Utilizzando le popolazioni cellulari purificate, Oil Red O colorazione in combinazione con immunocolorazione per i marcatori lignaggio adipogenico e miogeniche mostrato che solo la frazione fibroblasti era capace di differenziazione adipogenico (Figura 2). L'accumulo di.......

Discussion

Abbiamo descritto un procedimento di ordinamento immunomagentic per l'arricchimento selettivo di precursori derivato muscolari umani da piccoli campioni di materiale biopsia muscolare. Questa tecnica è stato prezioso nel nostro laboratorio per superare la perdita di colture derivate muscolari fibroblasti umani, ma anche per comprendere il comportamento unica di distinte popolazioni di progenitori derivato muscolari. Cellule miogeniche Una volta purificate possono essere indagati per le modifiche delle proteine ​​e /.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenasi  D	Roche
Dispase II	Sigma	D4693-1G	Deve essere sterilizzato con filtro prima dell'uso
Tripsina/EDTA	(Gibco) Invitrogen	15400-054
100 μ filtro cellulare	m BD Biosciences	352360
Soluzione di collagene (3 mg/ml in acido acetico allo 0,1%)	Sigma, Dorset, Regno Unito	C8919
Filtro per siringa Minisart SRP15 (0,2 μ m)	Sartorius	17573ACK	Membrana in politetrafluoroetilene (PTFE)
CD56 Microsfere umane	Miltenyi Biotech	130-050-401	Essere consapevoli della durata di conservazione limitata delle microsfere
Anti-fibroblasti Microsfere, umane	Miltenyi Biotech	130-050-601
40 μ m Filtri di pre-separazione	Miltenyi Biotech	130-041-407
Colonne a celle grandi	Miltenyi Biotech	130-042-202	Queste colonne sono dotate di una resistenza di flusso. L'uso del resistore di flusso non è necessario per ottenere le elevate purezze miogeniche qui descritte.
Colonne LS	Separatore Miltenyi Biotech	130-042-401
MiniMacs	Miltenyi Biotech	130-042-102	Questo separatore si adatta alla colonna di celle grandi ma non alla colonna LS.
MidiMACS	Miltenyi Biotech	130-042-302
MACS multistand	Miltenyi Biotech	130-042-303
BSA	Sigma		Deve essere sterilizzato con filtro prima dell'uso
Olio Rosso O	Sigma	O0625
Fosfato trietilico	Sigma	538728
Whatman Paper	Sigma	Z241121-1PAK	N. 42, Senza cenere. Per preparare il filtro, piegare la carta da filtro circolare per formare un semicerchio, quindi piegare nuovamente il semicerchio a metà per formare una forma conica. Inserire il cono in un imbuto per il filtraggio.
Sonde molecolari	con reagente antisbiadimento ProLong Gold	P36930	Può essere acquistato con o senza DAPI e non spegne la fluorescenza iniziale.
AxioVision	Carl Zeiss	Contatta Zeiss
Adobe Photoshop CS5 Extended	Adobe (acquistato da Pugh Computers)	ADPH16982*