Abbiamo sviluppato un protocollo di ibridazione fluorescente in situ (FISH) facilmente personalizzabile e specifico per il filamento combinato con l'immunofluorescenza. Ciò consente un esame dettagliato della dinamica dell'RNA con una visione simultanea della struttura della cromatina, dell'organizzazione nucleare e della regolazione trascrizionale a livello di singola cellula.
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Articolo metodologico
Veloce fluorescente In Situ Protocollo di ibridazione per Xist RNA combinata con immunofluorescenza di istone modifica in cromosoma X inattivazione
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Combinando RNA ibridazione in situ fluorescente (FISH) con immunofluorescenza (immuno-FISH) crea una tecnica che può essere impiegata a livello di singola cellula per rilevare la dinamica spaziale della localizzazione RNA con visione simultanea nella localizzazione delle proteine, modificazioni epigenetiche e altri dettagli che può essere evidenziato mediante immunofluorescenza. Inattivazione del cromosoma X è un paradigma per lungo RNA non codificante (lncRNA) mediata silenziamento genico. Trascrizione specifico (Xist) accumulo lncRNA X-inattiva (chiamato nuvola Xist) su uno dei due cromosomi X nelle femmine di mammifero è un passo fondamentale per avviare l'inattivazione del cromosoma X. Xist RNA direttamente o indirettamente interagisce con vari enzimi che modificano la cromatina e introduce distinti paesaggi epigenetici alla inattiva cromosoma X (Xi). Una nota caratteristica epigenetica del Xi è l'istone H3 trimetil-lisina 27 (H3K27me3) modifica. Qui, descriviamo un immuno-FISH semplice e veloceprotocollo per la rilevazione Xist RNA utilizzando RNA FISH con sonde multiple oligonucleotide accoppiato con immunofluorescenza di H3K27me3 per esaminare la localizzazione di Xist RNA e modificazioni epigenetiche associate. Utilizzando sonde oligonucleotidiche risultati in un tempo di incubazione più breve e la rilevazione più sensibile di Xist RNA rispetto alle sonde di RNA trascritto in vitro (ribosonde). Questo protocollo fornisce un potente strumento per comprendere le dinamiche di lncRNAs e la sua modificazione epigenetica associato, la struttura della cromatina, l'organizzazione nucleare e regolazione trascrizionale.
Introduzione
Mammalian cromosoma X inattivazione (XCI) è una strategia per compensare lo squilibrio nel dosaggio del gene X-linked tra XX e XY, in cui uno dei due cromosomi X nelle femmine è trascrizionalmente inattivato 1. Inattivazione del cromosoma X è un ottimo sistema modello per lungo RNA non codificante (lncRNA) di ricerca. Inattivazione del cromosoma X è regolata da più lncRNAs, ed è stato ampiamente studiato negli ultimi decenni per scoprire i meccanismi di crosstalk tra lncRNAs, la trascrizione, la struttura della cromatina e l'organizzazione nucleare 2, 3.
Il centro X inattivazione (XIC) situato sul cromosoma X è u....
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Protocollo
1. Sonda Preparazione
- Ottenere più oligonucleotidi unici in Xist (oligonucleotidi 20-30 nucleotidi di lunghezza, 63-65 temperatura di fusione ºC, tabella 1), con una modifica 5'-amino e sospendere in acqua.
- Pool quantità equimolari di oligonucleotidi con 5'-amino modifica (totale 4,5 mg) e l'etichetta con colorante fluorescente ammina reattiva seguendo le istruzioni del produttore.
- Sciogliere gli oligonucleotidi pool in finale 5 ml di acqua priva di nucleasi e aggiungere 3 ml di 1 M bicarbonato di sodio alla soluzione oligonucleotide.
- Aggiungere 2 microlitri DMSO al flaconcino di ammina reattiva tin....
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Risultati
Immagini rappresentative della rapida immuno-FISH sono mostrati nella Figura 1A. Co-localizzazione del segnale Xist RNA nuvola e H3K27me3 sul Xi è stato rilevato nel differenziare cellule femminili. Al giorno 12 sulla differenziazione, più del 90% delle cellule EB aveva una nuvola Xist (Figura 1B). Sonde oligonucleotidiche Breve efficientemente penetrati nei nuclei, portando ad una visualizzazione di quasi tutti H3K27me3 segnali co-localizzato con Xist RNA (Figura 1C; 9.......
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Discussione
In questo lavoro, abbiamo presentato una rapida protocollo immuno-FISH, che richiede meno di 5 ore per completare la preparazione vetrino, Xist RNA FISH, e immunofluorescenza per H3K27me3. In confronto con l'approccio generale immuno-FISH per Xist RNA rilevazione, che di solito ha bisogno di incubazione durante la notte per l'RNA FISH, questo protocollo non solo riduce significativamente il tempo trascorso, ma migliora anche la sensibilità di immuno-FISH con sonde oligonucleotidi.
Po.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarato.
Ringraziamenti
Ringraziamo Hongjae Sunwoo per gli utili consigli per la progettazione di oligonucleotidi nell'RNA FISH. Ringraziamo anche Serenity Curtis per aver curato il manoscritto. N.Y. è stata supportata da una borsa di studio post-dottorato per la ricerca all'estero della Japan Society for the Promotion of Science (JSPS). Questo lavoro è stato sostenuto dal NIH (RO1-GM102184), dalla March of Dimes Research Foundation (#6-FY12-337) e dal Developmental Fund and Trustee Grant presso il Cincinnati Children's Hospital Medical Center to Y.O.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| oligonucleotidi con modificazione 5'-ammino | IDT | ||
| Alexa Fluor 488 Colorante reattivo | Life Technologies | A32750 | |
| Colonne MicroSpin G-25 | GE Healthcare | 27-5325-01 | |
| Cytospin 2 | Shandon | 59900102 | |
| Albumina sierica bovina, grado di biologia molecolare (per tampone di ibridazione) | Roche | ||
| Histone H3K27me3 anticorpo | Active Motif | 61017 | |
| Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse, altamente adsorbito in modo incrociato | Life Technologies | A21424 | |
| Reagente antidissolvenza ProLong Gold | Life Technologies | P36931 |
Riferimenti
- Payer, B., Lee, J. T. X chromosome dosage compensation: how mammals keep the balance. Annu Rev Genet. 42, 733-772 (2008).
- Lee, J. T. Gracefully ageing at 50, X-chromosome inactivation becomes a paradigm for RNA and chromatin control.
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Ristampe e permessi
