Articolo metodologico

Veloce fluorescente In Situ Protocollo di ibridazione per Xist RNA combinata con immunofluorescenza di istone modifica in cromosoma X inattivazione

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DOI:

10.3791/52053

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26 novembre 2014

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1Division of Reproductive Sciences, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2Department of Pediatrics, University of Cincinnati College of Medicine

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Abbiamo sviluppato un protocollo di ibridazione fluorescente in situ (FISH) facilmente personalizzabile e specifico per il filamento combinato con l'immunofluorescenza. Ciò consente un esame dettagliato della dinamica dell'RNA con una visione simultanea della struttura della cromatina, dell'organizzazione nucleare e della regolazione trascrizionale a livello di singola cellula.

Abstract

Combinando RNA ibridazione in situ fluorescente (FISH) con immunofluorescenza (immuno-FISH) crea una tecnica che può essere impiegata a livello di singola cellula per rilevare la dinamica spaziale della localizzazione RNA con visione simultanea nella localizzazione delle proteine, modificazioni epigenetiche e altri dettagli che può essere evidenziato mediante immunofluorescenza. Inattivazione del cromosoma X è un paradigma per lungo RNA non codificante (lncRNA) mediata silenziamento genico. Trascrizione specifico (Xist) accumulo lncRNA X-inattiva (chiamato nuvola Xist) su uno dei due cromosomi X nelle femmine di mammifero è un passo fondamentale per avviare l'inattivazione del cromosoma X. Xist RNA direttamente o indirettamente interagisce con vari enzimi che modificano la cromatina e introduce distinti paesaggi epigenetici alla inattiva cromosoma X (Xi). Una nota caratteristica epigenetica del Xi è l'istone H3 trimetil-lisina 27 (H3K27me3) modifica. Qui, descriviamo un immuno-FISH semplice e veloceprotocollo per la rilevazione Xist RNA utilizzando RNA FISH con sonde multiple oligonucleotide accoppiato con immunofluorescenza di H3K27me3 per esaminare la localizzazione di Xist RNA e modificazioni epigenetiche associate. Utilizzando sonde oligonucleotidiche risultati in un tempo di incubazione più breve e la rilevazione più sensibile di Xist RNA rispetto alle sonde di RNA trascritto in vitro (ribosonde). Questo protocollo fornisce un potente strumento per comprendere le dinamiche di lncRNAs e la sua modificazione epigenetica associato, la struttura della cromatina, l'organizzazione nucleare e regolazione trascrizionale.

Introduzione

Mammalian cromosoma X inattivazione (XCI) è una strategia per compensare lo squilibrio nel dosaggio del gene X-linked tra XX e XY, in cui uno dei due cromosomi X nelle femmine è trascrizionalmente inattivato 1. Inattivazione del cromosoma X è un ottimo sistema modello per lungo RNA non codificante (lncRNA) di ricerca. Inattivazione del cromosoma X è regolata da più lncRNAs, ed è stato ampiamente studiato negli ultimi decenni per scoprire i meccanismi di crosstalk tra lncRNAs, la trascrizione, la struttura della cromatina e l'organizzazione nucleare 2, 3.

Il centro X inattivazione (XIC) situato sul cromosoma X è un locus genetico complesso formato da un certo numero di geni che producono RNA non codificanti 4. X-inattiva trascrizione specifico (Xist) lncRNA nei mammiferi eutherian è uno di questi lncRNA che svolge un ruolo cruciale nel cromosoma X inattivazione 5,6. Trascrizioni Xist circondano la posizione del future Xi per avviare inattivazione del cromosoma X, e appaiono come una nuvola quando visualizzato utilizzando RNA FISH; questa formazione è denominato "Xist Cloud" 7. Dal Xist RNA interagisce con vari enzimi che modificano la cromatina, co-localizzazione delle nuvole Xist con diverse modificazioni epigenetiche per cromatina silente e trascrizione repressiva si osserva durante cromosoma X inattivazione 8. Ad esempio, Xist RNA interagisce con Polycomb complesso repressione 2 (PRC2) che è responsabile per H3K27me3 e induce uno stato cromatina repressione 9. Il verificarsi della nuvola Xist sul Xi e la sua co-localizzazione con la modifica intensiva H3K27me3 rappresenta un paesaggio eterocromatina facoltativa del Xi 10,11.

Tecniche di citogenetica, come il DNA / RNA FISH hanno percorso una lunga strada dal metodo tradizionale utilizzando sonde radiomarcate 12 alle tecniche più recenti e avanzate con maggiore sensibilità eimmagini fluorescenti utilizzando più sonde oligonucleotidiche 13,14. DNA / RNA FISH accoppiato con immunofluorescenza è stato regolarmente utilizzato come strumento citologico per comprendere l'organizzazione spazio-temporale nucleare, localizzazione RNA, la struttura della cromatina e modifiche. La preparazione sonda più standard per RNA FISH implica l'uso di plasmide o cromosomiche artificiale (BAC) cloni batterici e la loro successiva etichettatura o con traduzione nick o adescamento casuali 15. Tuttavia, quasi il 70% dei geni nei topi e il 40% dei geni nell'uomo mostrano una sovrapposizione di senso e antisenso trascrizioni 16, quindi richiede un metodo FISH specifico strand per distinguere senso e antisenso trascrizioni. In vitro sonde RNA trascritti (riboprobe ) sono spesso utilizzati per specifici filamento di RNA FISH 17,18; Tuttavia, ciò comporta la preparazione di un clone plasmidico o prodotti di PCR con T7, SP6, T3 o promotore e riboprobes sintetizzare. Inoltre, ribosonde derivato da genomic DNA o cDNA contengono spesso regioni non-specifici e gli elementi ripetitivi, che si traducono in alto rumore di fondo. Un altro problema è che riboprobes, che sono a poche centinaia di nucleotidi di lunghezza e contengono più fluorofori, non possono penetrare efficacemente nel nucleo. Per aggirare questo, più sonde oligonucleotidiche marcate con brevi un unico fluoroforo alla fine sono stati sviluppati che hanno una buona sensibilità, potenza del segnale uniforme, e la facilità di purificazione e movimentazione 14. Inoltre, gli oligonucleotidi di DNA sono generalmente più stabile di RNA. Abbiamo applicato una simile strategia di utilizzo di oligonucleotidi in Xist RNA FISH 19 con immunofluorescenza per comprendere le dinamiche epigenetici del Xi indotte da Xist lncRNA durante il processo di inattivazione del cromosoma X. Questo protocollo descrive la creazione di sonde oligonucleotidiche e corretta preparazione di cellule, così come l'utilizzo di immunofluorescenza e RNA FISH. Xist RNA FISH utilizzando oligonucle multiplaotides è economicamente efficiente nel lungo termine se Xist RNA FISH viene eseguita di routine nel proprio laboratorio. Questa tecnica può essere utilizzata per identificare lncRNAs nelle cellule e contemporaneamente mappatura sua co-localizzazione con modificazioni epigenetiche o fattori. Uno dei principali vantaggi del protocollo è la capacità di modificare facilmente per soddisfare i propri interessi di ricerca.

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Protocollo

1. Sonda Preparazione

  1. Ottenere più oligonucleotidi unici in Xist (oligonucleotidi 20-30 nucleotidi di lunghezza, 63-65 temperatura di fusione ºC, tabella 1), con una modifica 5'-amino e sospendere in acqua.
  2. Pool quantità equimolari di oligonucleotidi con 5'-amino modifica (totale 4,5 mg) e l'etichetta con colorante fluorescente ammina reattiva seguendo le istruzioni del produttore.
    1. Sciogliere gli oligonucleotidi pool in finale 5 ml di acqua priva di nucleasi e aggiungere 3 ml di 1 M bicarbonato di sodio alla soluzione oligonucleotide.
    2. Aggiungere 2 microlitri DMSO al flaconcino di ammina reattiva tintura e vortex brevemente.
    3. Miscelare la soluzione di oligonucleotide con il colorante reattivo in DMSO e incubare la miscela a temperatura ambiente per 1 ora al buio.
  3. Purificare le sonde oligonucleotidiche fluorescente di G-25 colonna seguita da precipitazione in etanolo.
    1. Centrifuga G-25 colonne a 750 g per 1 minuto per rimuovere buffer di stoccaggio in eccesso.
    2. Aggiungere l'acqua priva di nucleasi 40 microlitri alla miscela etichettatura prodotta nel passaggio 1.2.3 e applicare alla colonna G-25. Centrifugare a 750 g per 2 minuti.
    3. Aggiungere 50 ml di acqua priva di nucleasi, 10 microlitri 3 M di acetato di sodio (pH 5.2) e 250 ml di etanolo per la sonda purificato dal punto 1.3.2. Conservare a -80 ° C per 30 minuti e centrifugare a 21.000 xg per 15 min a 4 ° C.
    4. Lavare gli oligonucleotidi precipitati una volta con 1 ml di etanolo al 70%.
    5. Risospendere in 50 microlitri di acqua priva di nucleasi o TE (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA) per una concentrazione finale di circa 10 pM.
  4. Diluire le sonde oligonucleotidiche fluorescente ad una concentrazione finale di 250 nM con tampone di ibridazione (10% formammide, 2X SSC [NaCl 300 mM; citrato di sodio 30 mM]; 2 mg / ml BSA, 10% destrano solfato).
    NOTA: Con questo protocollo FISH veloce, oligonucleotide paccappatoi in Xist stati progettati ed utilizzati ad una concentrazione superiore al normale protocollo FISH con sonde oligonucleotidiche per abbreviare il tempo di incubazione per l'ibridazione.

2. Far scorrere Preparazione

NOTA: Le diapositive possono essere preparati per immuno-FISH utilizzando il mouse staminali embrionali (ES) o il corpo embrioide (EB) differenziando cellule 20, 21 da una loro crescita direttamente su un vetrino da poli-lisina-trattati o con cytospin con sospensione cellulare. Qui, viene mostrata la preparazione diapositiva Cytospin.

  1. Aspirare il mezzo di coltura in un piatto da 6 pozzetti. Lavare con PBS (temperatura ambiente), e aspirare a fondo.
  2. Aggiungere 0,5 ml di tripsina al piatto 6 pozzetti, incubare per 5-10 minuti a 37 ° C.
  3. Aggiungere 5 ml di terreno e disperdere le cellule pipettando gentilmente su e giù parecchie volte.
  4. Trasferire le cellule in una provetta da 15 ml, centrifugare per 5 min a 200 xg a temperatura ambiente.
  5. Eliminare il supporto did delicatamente sospendere le cellule in 2 ml di PBS.
  6. Contare le cellule utilizzando emocitometro, e diluire sospensione cellulare a 4 x 10 5 cellule / ml di PBS.
  7. Assemblare una diapositiva, una carta filtro e una camera con una clip e metterli nelle apposite fessure del rotore del cytospin. Aggiungere 250 ml di ogni campione preparato al punto 2.6 in ciascuna camera dei gruppi assemblati in cytospin. Centrifugare a 1500 rpm per 10 min a temperatura ambiente.
  8. (10 TUBI mM, pH 6,8; NaCl 100 mm; 300 mM saccarosio; 3 mM MgCl 2) Fill 3 Coplin sul ​​ghiaccio con 40 ml ciascuna di tampone PBS, CSK ghiacciata, e tampone CSKT (tampone CSK con 0,5% Triton X-100), rispettivamente.
  9. Dopo l'cytospin è finito, trasferire rapidamente il vetrino in PBS freddo e incubare per 5 min.
  10. Trasferire il vetrino nel buffer CSK ghiacciato e incubare per 1 min.
  11. Trasferire il vetrino nel buffer CSKT ghiacciato e incubare per 5 min.
  12. Trasferire il vetrino di nuovo in ghiacciata CSK buffer e incubare per 1 min.
  13. Trasferire il vetrino in 4% paraformaldeide in PBS e incubare per 10 min a temperatura ambiente.

3. immunofluorescenza

  1. Porre i vetrini in una vaschetta Coplin con PBST (1x PBS con 0.1% Tween-20) per diversi secondi.
  2. Porre i vetrini in un taglio che permette di buffer residuo a scorrere giù la diapositiva. Pulire con cura il liquido in eccesso dal vetrino e metterlo in una scatola pipetta punta vuota con acqua. Sovrapporre la slitta con 40 ml di soluzione bloccante (1x PBS, 1% BSA, 0,1% Tween-20), inserire delicatamente un coprioggetto e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
  3. Rimuovere il vetrino, rimuovere la soluzione di blocco, e aggiungere 40 ml di anticorpo primario Histone H3K27me3 diluito ad una concentrazione di 1: 500 in soluzione bloccante. Posizionare il coprioggetto posteriore della diapositiva e incubare per 30 min a temperatura ambiente.
    NOTA: Un inibitore RNase nella soluzione di blocco potrebbe essere utile per preservare RNA in questo RNA FISProtocollo H quando si utilizzano anticorpi policlonali.
  4. Lavare il vetrino 2 volte in vasi pieni di Coplin PBST, per 5 minuti ciascuna, scuotendo delicatamente durante il lavaggio.
  5. Porre i vetrini in un taglio che permette di buffer residuo a scorrere giù la diapositiva. Pulire con cura il liquido in eccesso e posizionare il vetrino nella scatola punta. Overlay con 40 ml di anticorpo secondario (1: 500) diluito in soluzione bloccante, posizionare un coprioggetto e incubare per 15 minuti al buio. Per le seguenti operazioni, mantenere la slitta al buio in ogni momento.
  6. Lavare 2 volte in Coplin vasi con PBST come al punto 3.4.

4. RNA FISH con sonde oligonucleotidi

  1. Pre-riscaldare una scatola pipetta punta vuota con acqua sul fondo per evitare che scivoli di essiccazione a 37 ° C per l'RNA FISH al punto 4.3.
  2. Porre i vetrini in un taglio che permette di buffer residuo a scorrere giù la diapositiva. Pulire con cura il liquido in eccesso dal vetrino dal punto 3.6 e posizionare il vetrino nella casella pipetta-tip con water in basso. Aggiungere 500 pl di tampone di lavaggio FISH (10% formammide in 2x SSC) della diapositiva e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
  3. Rimuovere la soluzione di lavaggio FISH, aggiungere 8 ml di oligonucleotidi sul vetrino, inserire un vetrino, e trasferire la diapositiva di una scatola pipetta punta preriscaldata con acqua sul fondo; incubare a 37 ° C per 1-2 ore.
  4. Mettere 3 vasetti pre-riscaldato Coplin in un bagno d'acqua a 37 ° C con il tampone di lavaggio FISH, FISH tampone di lavaggio con DAPI, e 2x SSC.
  5. Dopo 1-2 ore di incubazione per l'RNA FISH, mettere il vetrino nel buffer di lavaggio FISH pre-riscaldato.
  6. Incubare il vetrino per alcuni minuti fino a quando il vetrino cade della diapositiva.
  7. Posizionare il vetrino nuovo nel tampone di lavaggio, e continuare incubazione per 5 min.
  8. Trasferire i vetrini in un'altra vaschetta Coplin con tampone di lavaggio FISH preriscaldata con 0,5 ng / ml DAPI e incubare per 5 min.
  9. Trasferire i vetrini in un'altra vaschetta Coplin con pre-riscaldato 2x SSC e incubare per 5 kmn.
  10. Porre i vetrini in un taglio che permette di buffer residuo a scorrere giù la diapositiva. Pulire con cura il liquido in eccesso e posizionare il vetrino di nuovo in una scatola di punta secca. Aggiungere 4 ml di antifade con DAPI sul vetrino e mettere un coprioggetto.
  11. Sigillare il coprioggetto con smalto e osservare al microscopio. La slitta può essere conservato a 4 ° C al buio per alcuni mesi.

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Risultati

Immagini rappresentative della rapida immuno-FISH sono mostrati nella Figura 1A. Co-localizzazione del segnale Xist RNA nuvola e H3K27me3 sul Xi è stato rilevato nel differenziare cellule femminili. Al giorno 12 sulla differenziazione, più del 90% delle cellule EB aveva una nuvola Xist (Figura 1B). Sonde oligonucleotidiche Breve efficientemente penetrati nei nuclei, portando ad una visualizzazione di quasi tutti H3K27me3 segnali co-localizzato con Xist RNA (Figura 1C; 9...

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Discussione

In questo lavoro, abbiamo presentato una rapida protocollo immuno-FISH, che richiede meno di 5 ore per completare la preparazione vetrino, Xist RNA FISH, e immunofluorescenza per H3K27me3. In confronto con l'approccio generale immuno-FISH per Xist RNA rilevazione, che di solito ha bisogno di incubazione durante la notte per l'RNA FISH, questo protocollo non solo riduce significativamente il tempo trascorso, ma migliora anche la sensibilità di immuno-FISH con sonde oligonucleotidi.

Po...

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Dichiarazioni

Nessun conflitto di interessi dichiarato.

Ringraziamenti

Ringraziamo Hongjae Sunwoo per gli utili consigli per la progettazione di oligonucleotidi nell'RNA FISH. Ringraziamo anche Serenity Curtis per aver curato il manoscritto. N.Y. è stata supportata da una borsa di studio post-dottorato per la ricerca all'estero della Japan Society for the Promotion of Science (JSPS). Questo lavoro è stato sostenuto dal NIH (RO1-GM102184), dalla March of Dimes Research Foundation (#6-FY12-337) e dal Developmental Fund and Trustee Grant presso il Cincinnati Children's Hospital Medical Center to Y.O.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
oligonucleotidi con modificazione 5'-amminoIDT
Alexa Fluor 488 Colorante reattivoLife TechnologiesA32750
Colonne MicroSpin G-25GE Healthcare27-5325-01
Cytospin 2Shandon59900102
Albumina sierica bovina, grado di biologia molecolare (per tampone di ibridazione)Roche
Histone H3K27me3 anticorpoActive Motif61017
Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse, altamente adsorbito in modo incrociatoLife TechnologiesA21424
Reagente antidissolvenza ProLong GoldLife TechnologiesP36931
10715859103

Riferimenti

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