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Articolo metodologico

Quantificazione di orofacciale fenotipi in Xenopus

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DOI:

10.3791/52062

⸱

6 novembre 2014

 , 
1Biology Department, Virginia Commonwealth University

In questo articolo

Sommario

È stato sviluppato un metodo per quantificare l'entità oro-facciale e la forma di Xenopus laevis embrioni. In questo protocollo, misurazioni tradizionali sono unite a morfometria geometrica per consentire analisi più sofisticate di sviluppo oro-facciale e difetti.

Abstract

Xenopus è diventato uno strumento importante per sezionare i meccanismi che regolano lo sviluppo cranio-facciale e difetti. Un metodo per quantificare lo sviluppo oro-facciale consentirà un'analisi più rigorosa dei fenotipi orofacciali su abrogazione con sostanze che possono geneticamente o molecolarmente manipolare l'espressione genica e la funzione delle proteine. Utilizzando due immagini tridimensionali delle teste embrionali, si misurano le dimensioni-come tradizionali dimensioni come larghezza oro-facciale, altezza e Area-. Inoltre, una misura rotondità della apertura della bocca embrionale è usato per descrivere la forma della bocca. Morfometria geometrica di queste due immagini tridimensionali viene eseguita anche per fornire una visione più sofisticata di cambiamenti nella forma della regione oro-facciale. Luoghi di interesse sono assegnati a punti specifici della regione oro-facciale e le coordinate vengono creati. Una analisi delle componenti principio viene utilizzato per ridurre le coordinate punto di riferimento ai componenti principali che poi discriminano il trattamentogruppi. Questi risultati sono visualizzati sotto forma di un diagramma a dispersione in cui gli individui con forme oro-facciali simili si raggruppano. E 'utile anche per eseguire un'analisi funzione discriminante, che mette a confronto statisticamente le posizioni dei punti di riferimento tra i due gruppi di trattamento. Questa analisi viene visualizzato su una griglia di trasformazione in cui i cambiamenti della posizione di riferimento sono visti come vettori. Una griglia viene sovrapposta questi vettori in modo che un modello di deformazione viene visualizzato per mostrare dove posizioni significative punto di riferimento sono cambiati. Cambia forma per l'analisi della funzione discriminante si basano su una misura statistica, e quindi possono essere valutati da un p-value. Questa analisi è semplice e accessibile, che richiede solo uno stereoscopio e software freeware, e quindi sarà una risorsa per la ricerca e l'insegnamento prezioso.

Introduzione

Tra i tipi più diffusi e devastanti di difetti alla nascita dell'uomo sono quelli che riguardano la bocca e la faccia, come la schisi orofacciali 1. I bambini con strutture orofacciali malformati sottoposti a interventi chirurgici multipli per tutta la vita e lottano con malformazioni del viso, discorso, dell'udito e problemi alimentari. Pertanto, facilitando nuove ricerche nello sviluppo cranio-oro-facciale ed è fondamentale per la prevenzione e il trattamento di questi tipi di difetti alla nascita negli esseri umani. Xenopus laevis è emerso come un nuovo strumento per sezionare i meccanismi che regolano lo sviluppo cranio-facciale (alcuni esempi includono 2,3,4 -11). Pertanto, un metodo quantitativo per analizzare dimensione e forma cambia durante lo sviluppo della testa e del viso di questa specie potrebbe essere molto potente 3.

Qui vi presentiamo un tale metodo; Combinando le misurazioni tradizionali dimensioni con morfometria geometrica adattati da uno studio di Xenopus 12 e un gran numero di studi che hanno analizzato forma del viso umano 13-15. L'obiettivo di questo protocollo è quello di permettere ai ricercatori di quantificare le dimensioni e le forme del viso per distinguere tra diversi fenotipi orofacciali durante lo sviluppo normale e anormale. Questa analisi consentirà una migliore differenziazione tra i difetti cranio-facciali sottili, come quelli derivanti da effetti sinergici di geni e / o fattori ambientali. Inoltre, questo metodo di quantificazione potrebbe anche rivelare anche lieve miglioramento o al salvataggio di un difetto oro-facciale. Questo rende quindi una guida utile per analizzare potenziali terapie.

La combinazione di misurazioni facciali e morfometria geometrica che qui presentiamo consente un'analisi statistica più completa di dimensioni e la forma della regione orofacciale di protocolli attuali che in gran parte utilizzano solo uno o l'altro 15-18. Inoltre, presentiamo un modo semplice per valutare sia mediale e piani lateraliil volto senza bisogno di sofisticate apparecchiature di imaging tridimensionale utilizzata in studi attuali 13,19.

Dimostriamo questo protocollo su Xenopus laevis embrioni trattati con un inibitore del recettore dell'acido retinoico che induce lo sviluppo oro-facciale anormale e una mediana palatoschisi 2,3. La quantificazione delle dimensioni e la forma della regione oro-facciale in questi embrioni ha rivelato cambiamenti nella midface che è analogo per l'uomo con crepacci palatali simili e modelli murini 20,21. Tuttavia, questo protocollo può essere utilizzato per valutare gli effetti di altri composti sullo sviluppo oro-facciale, quali sostanze naturali, erbicidi, o proteine ​​come i fattori di crescita. Inoltre, le dimensioni e la forma cambia orofacciali derivanti dalla perturbazione di espressione genica tramite la perdita o il guadagno di esperimenti di funzione (utilizzando Morpholinos antisenso o Crispers / Talens) possono essere quantificati con questo protocollo. Infine, abbiamo sviluppato questo metodo SPECIFICHElly per valutare la morfologia Xenopus; tuttavia, è facilmente modificato per l'analisi di qualsiasi vertebrato. Altre applicazioni potrebbero anche includere l'uso di questo protocollo per il confronto di specie strettamente collegate agli studi evolutivi o ecologici. Mentre l'esempio forniamo qui utilizza questo protocollo per descrivere l'analisi della regione oro-facciale, potrebbe facilmente essere modificato per l'analisi di altre regioni, organi o strutture.

Questo protocollo quantificazione oro-facciale diventerà una risorsa preziosa per la comunità di ricerca, così come un eccellente strumento didattico per gli studenti universitari come un video dimostrativo.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti eseguiti utilizzando Xenopus laevis sono stati approvati dalla IACUC (protocollo # AD20261).

1. Preparazione Reagenti e materiali richiesti

  1. Reagenti:
    1. Fare 1 L di 10x MBS (Modified Saline di Barth) soluzione 22. Aggiungere NaCl (880 mM), KCl (10 mM), MgSO4 (10 mM), HEPES (50 mM, pH 7,8), e NaHCO3 (25 mM) a 1 L di acqua distillata. Regolare il pH a 7,8 con NaOH.
    2. Effettuare 1 L di 1x MBS diluendo 100 ml di soluzione di 10x MBS in 900 ml di acqua distillata. Aggiungere 0,7 ml di soluzione 1 M CaCl 2.
    3. Effettuare 1 L di 0.1x MBS diluendo 100 ml di soluzione 1x MBS in 900 ml di acqua distillata. Per 1 L di 0.1x soluzione MBS, aggiungere 1 ml di 10 mg / ml soluzione gentamicina per l'uso in coltura degli embrioni.
    4. Effettuare MBS di sali sciogliendo 4 ml di 5 M NaCl in 100 ml di 10x MBS. Quindi aggiungere acqua distillata fino a quando il volume totale è di 1 L.
    5. Fai etanolo al 70% diluendo 100% eTHANOL di etanolo al 70% con acqua distillata.
    6. Rendere BMS-543 preparando una soluzione madre 10 mM in dimetilsolfossido (DMSO).
    7. Effettuare 4% paraformaldeide (PFA) aggiungendo 4 g di paraformaldeide in polvere a 50 ml di acqua distillata. Calore su una piastra calda a circa 65 ° C, a questo punto aggiungere 5 M NaOH goccia a goccia la soluzione fino a quando scompare.
      1. Una volta che la soluzione cancella, togliere dal fuoco e aggiungere 50 ml 2x PBS e 100 ml di Tween-20. Lasciare raffreddare a RT su ghiaccio. Regolare il pH tra 7,2 e 7,5 utilizzando HCl.
    8. Fare una soluzione salina tampone fosfato con Tween (PBT) sciogliendo 8 g di NaCl, 0,2 g di KCl, 1,44 g di Na 2 HPO 4, e 0,24 g di KH 2 PO 4 in 800 ml di acqua distillata. Utilizzando HCl, regolare il pH a 7,4. Aggiungere 2 ml di Tween-20. Regolare il volume finale con acqua distillata alla parità di 1 L.
    9. Fare una soluzione cisteina sciogliendo 1 g di cisteina in 50 ml di acqua distillata o 0.1x MBS. Aggiungere 1,5 ml di NaOH 5 M unnd regolare il pH a 7,8.
    10. Fare una soluzione madre benzocaina 10% con l'aggiunta di 10 g di benzocaina polvere 100 ml 100% EtOH. Per l'eutanasia dei maschi adulti e degli embrioni pronti per il fissaggio, portare a una soluzione 0,05%.
    11. Fare una soluzione di storage testicoli con l'aggiunta di 1 ml di siero di vitello a 9 ml di tampone L15.
  2. Strumenti necessari e le attrezzature:
    1. Ottenere le attrezzature elencate nella tabella di materiali ed attrezzature, mostrato nella Figura 1.
    2. Modificare uno strumento pipetta. Inserire la punta di una pipetta Pasteur di vetro in una fiamma di un becco Bunsen. Ruotare la punta della pipetta fino a quando non si scioglie e forma una fine sigillato arrotondata.
    3. Appiattire plastilina sul fondo di una capsula di Petri in plastica, smussando a coprire l'intera piastra (qualsiasi formato può essere utilizzato) (Figura 1Aiv).
      1. Premere leggermente una presa in giro l'ago direttamente nel recipiente di terracotta rivestita di un angolo di 45 °. Tenere l'ago lì, e spostare lentamente Petriservire in orizzontale per creare una linea depressa (Figura 1BI). Ripetere per il numero desiderato di righe.
      2. Utilizzare l'estremità di uno strumento pipetta di vetro per fare poco profonde, depressioni circolari in ogni riga del recipiente di terracotta rivestita di inserire il teste embrione (Figura 1Bii) e gli aiuti per l'organizzazione degli embrioni durante fotografare.
      3. Per la fotografia, riempire piatto con PBT (Figura 1Biii). Tra un uso, lavare il piatto e la superficie di argilla con acqua sterile, seguito da etanolo al 70%.

2. Xenopus laevis embrio Cultura e inibitore Trattamenti

  1. Fecondazione in vitro e la cultura di uova di Xenopus:
    1. Ottenere e la cultura Xenopus laevis embrioni utilizzando normali pubblicato metodi 22,23.
    2. In breve, l'eutanasia un maschio adulto mediante immersione in una soluzione di benzocaina 0,05%. Sezionare testicoli e conservare in buffer di stoccaggio testicoli. Iniettarefemmine adulte con gonadotropina corionica umana (HCG), raccogliere le uova in MBS alto sale, e fertilizzare in vitro con testicoli sezionati (Figura 2A, B).
    3. Embrioni Cultura a 0.1x MBS a 15 ° C fino a quando la fase desiderata viene raggiunta (embrioni stadio secondo la tabella Normale di Xenopus laevis da Nieuwkoop e Faber 24,25).
      1. Qui, cultura embrioni fino allo stadio 22 (24 ore dopo la fecondazione (HPF)), e rimuovere la membrana vitellina allo stereomicroscopio con due paia di pinze appuntite. Embrioni di trasferimento con uno standard, usa e getta pipetta di trasferimento per un piatto pulito Petri (100 mm di diametro) contenente 30-40 ml di 0.1x MBS.
  2. Inibitore trattamenti di embrioni di Xenopus (illustrato nella figura 2):
    1. Riempire i pozzetti necessari di un piatto di coltura da 24 pozzetti con 1 ml di 0.1x MBS con una pipetta-uomo calibrata. Delimitare la parte esterna del pozzo con un segno di punta fineer (Figura 2D, nel riquadro). Utilizza l'indicatore di etichettare anche il contenuto da aggiungere a ciascun pozzetto sul 24 pozzetti coperchio piatto di coltura. Copiare queste informazioni in una pagina 24-ben set-up nel quaderno di laboratorio.
    2. Trasferimento 5-10 embrioni in ciascun pozzetto utilizzando uno standard, usa e getta trasferimento pipetta (Figura 2C). Inserire lo stesso numero di embrioni in ciascun pozzetto.
    3. Rabboccare o rimuovere le MBS 0.1x in modo che sia a livello con la 1 ml marcata linea (Figura 2D). Aggiungere il volume appropriato di DMSO (in modo che il volume finale di DMSO è 1%) e miscelare delicatamente. Fare attenzione a non aggiungere DMSO troppo vicino alle embrioni, ed evitare il contatto degli embrioni con la superficie del buffer.
    4. Aggiungere il volume appropriato di chimica nei pozzetti designati e miscelare delicatamente di nuovo. Qui, aggiungere 1 ml di 10 mM BMS-453 (un antagonista del recettore dell'acido retinoico) e 9 ml di DMSO a 1 ml di 0.1x MBS.
    5. Se la sostanza chimica è sensibile alla luce, vagamente avvolgere il culpiatto tura in un foglio di alluminio. Embrioni cultura in un incubatore a 15 ° C fino allo stadio desiderato. In questo esempio, il trattamento di embrioni per 16-18 ore.
  3. Lavare gli embrioni fuori del trattamento e allevamento fino girino fasi:
    1. Rimuovere la metà a tre quarti della soluzione con una pipetta di trasferimento monouso. Fare attenzione a non disturbare gli embrioni. Usando una nuova pipetta di trasferimento, riempire il pozzo con 0.1x MBS. Ripetere questa operazione 3-6 volte.
    2. Trasferimento degli embrioni in larga capsula Petri (150 mm di diametro) contenente 100 ml di 0.1x MBS con gentamicina (1 ml / l). Incubare gli embrioni a 15 ° C fino a raggiungere la fase 42-45 (82-100 HPF).
    3. Modificare il MBS 0.1x soluzione contenente gentamicina quotidiana, e rimuovere l'embrione è morto immediatamente per evitare la contaminazione o la morte di altri embrioni. Registrare il numero di embrioni morti nel quaderno di laboratorio.
  4. Embrioni di fissaggio in paraformaldeide (PFA):
    1. Fissare gli embrioni tra fasi 42 e 45 (82 e 100HPF, rispettivamente) trasferendoli in un nuovo piatto di coltura da 24 pozzetti contenente 1-2 ml di MBS 0.1x. Etichettare il coperchio con le stesse informazioni come il trattamento di set-up sopra descritto (punto 2.2.1).
    2. Rimuovere MBS 0.1x tanto da ogni pozzetto il più possibile, pur lasciando agli embrioni di cui e garantire un minimo contatto per evitare lesioni. Aggiungere 1-2 ml di soluzione 0,05% benzocaina in 0.1x MBS e incubare fino a che gli embrioni non sono più reattivo agli stimoli.
    3. Aggiungere 1-2 ml di 4% PFA. In alternativa, posizionare gli embrioni in provette da microcentrifuga etichettati per la fissazione, se si preferisce.
    4. Incubare embrioni in PFA per 24 ore a 4 ° C su un agitatore rotante. Rimuovere PFA eseguendo 3-4 lavaggi con PBT per un periodo di 3-5 ore.

3. Fotografare la Regione Orofacial di Xenopus Girini

  1. Pre-fotografia di preparazione (ciò è illustrato nella figura 3):
    1. Mettere gli embrioni fisse in un grande piatto di Petri (150mm di diametro) contenente circa 100 ml di PBT.
    2. Fare due incisioni per separare la testa dal corpo (Figura 3A, solide linee nere). In primo luogo, tenere l'embrione con un paio di pinze ed effettuare un'incisione sul lato posteriore del budello con un bisturi sterile (Figura 3B). Effettuare una seconda incisione sul lato anteriore del budello, vicino al cuore, per rimuovere completamente la testa (Figura 3C).
    3. Pipetta tagliato le teste di embrioni in un recipiente di terracotta rivestita (parte 1.2.2) utilizzando uno standard, usa e getta pipetta di trasferimento.
      1. Per le viste frontali, utilizzare due paia di pinze per posizionare le teste embrione lato posteriore verso il basso all'interno delle depressioni circolari. Utilizzando le pinze per manipolare sia la testa dell'embrione e l'argilla circostante, embrioni di posizione in modo tale che essi si trovano ad affrontare la fotocamera e non sono inclinati all'indietro o lateralmente (Figura 3D). Spingere delicatamente l'argilla che circonda intorno alla testa con una pinza e / o il vetrostrumento pipetta per fissare il testa a posto.
      2. Per le viste laterali, utilizzare pinze per posizionare le teste embrione all'interno delle depressioni circolari in modo che siano dalla loro parte, di fronte alla stessa direzione, e sono piatte contro l'argilla. Manipolazione testa dell'embrione e l'argilla circostante in modo che le ghiandole cemento di tutti gli embrioni sono posizionati in basso allo stesso angolo (Figura 3E). Utilizzare le righe disegnate con l'ago di presa in giro come una guida per assicurare l'accuratezza quando le misurazioni laterali.
  2. Catturare le immagini della testa girino:
    1. Fotografare il capo del girino utilizzando qualsiasi microscopio da dissezione con una fotocamera digitale collegata e il software della telecamera corrispondente. Usate il massimo ingrandimento che può essere mantenuta costante per tutti gli embrioni.
    2. Centrare gli embrioni e li faccia nella stessa direzione. Cattura le immagini utilizzando le migliori condizioni di illuminazione che consentono l'immagine più accurata della regione oro-facciale. Posizioneluci per evitare ombre eccessive. Salvare le immagini come file .tiff con la massima risoluzione possibile.

4. misurare ed analizzare viso Dimensioni Dimensioni in Xenopus Girini

  1. Misurare le dimensioni orofacciali (riassunti nella Figura 4):
    1. Determinare la larghezza del viso. Identificare i punti in cui la parte ventrale di ogni occhio incontra le periferie del volto (Figura 4A, frecce), e misurare la distanza tra i punti (Figura 4A, linea rossa).
    2. Determinare l'altezza viso. In primo luogo, determinare la linea mediana misurando la distanza tra ciascun occhio e calcolando la metà del percorso. Avanti, disegnare linee orizzontali che segnano le dorsali maggior parte dei bordi degli occhi e il punto più dorsale della ghiandola cemento (Figura 4B, linee bianche). Alla linea mediana, misurare la distanza tra le linee orizzontali (Figura 4B, linea rossa).
    3. Determinare tegli zona oro-facciale. Utilizzare le stesse linee orizzontali che segnano i bordi dorsali degli occhi e la ghiandola del cemento per guidare la misurazione dell'area (Figura 4C, linee bianche). Inizia nel punto in cui la marcatura all'inizio della ghiandola cemento linea orizzontale incontra la periferia del lato sinistro del volto (Figura 4CA).
      1. Tracciare lungo il bordo della faccia comprendente l'occhio fino al punto in cui la marcatura all'inizio degli occhi linea orizzontale incontra la periferia della faccia (Figura 4CB). Continuare a tracciare lungo questa dorsale più linea orizzontale fino al punto in cui incontra la periferia del lato destro della faccia (Figura 4 cc).
      2. Tracciare verso il basso lungo il bordo della faccia comprendente l'occhio fino al punto in cui la marcatura all'inizio della ghiandola cemento ventrale linea più orizzontale incontra la periferia del lato destro della faccia (Figura 4CD). Continuate a tracciare lungo questa linea orizzontale in basso untIl incontra il punto in cui tracciato è iniziato. Utilizzare software di editing fotografico per calcolare l'area all'interno del tracciato.
    4. Determinare la lunghezza del muso. Nelle immagini laterali, fare una linea verticale che segna l'anteriore dell'occhio. Quindi, misurare la distanza orizzontale tra il punto più anteriore dove la faccia incontra il bordo dorsale della ghiandola cemento alla marcatura anteriore dell'occhio (Figura 4D) linea verticale.
    5. Determinare la larghezza della bocca. Misurare la distanza orizzontale tra i punti a destra ea sinistra, dove le superiore e inferiore "labbra" della bocca di apertura si incontrano (Figura 4E). Questi possono essere considerati l'equivalente rana delle commissure labiali.
    6. Determinare la rotondità bocca. Calcolare bocca rotondità come un rapporto inverso in cui (4   ×   [Area]) / (π   ×   [Asse principale] 2 >).
      1. Utilizzare lo strumento lazo in una foto-editor per tracciare i bordi dell'apertura della bocca, come mostrato nella figura 4F. Selezionare Analizza nella barra degli strumenti principale e scegliere Misura. In alternativa, calcolare morbidezza dalla misurazione della superficie e il diametro dell'apertura della bocca.
  2. L'analisi dei dati di dimensioni del viso:
    1. Ingresso misurazioni di dimensioni facciali in un programma di analisi dei dati per confrontare il gruppo di trattamento con il controllo. Determinare la media di ogni misura per entrambi i gruppi sperimentali e di controllo per la creazione di grafici a barre. Determinare la deviazione standard, al fine di creare barre di errore. Eseguire test t di Student per confrontare statisticamente gruppi.
      NOTA: Questi dati possono essere molto variabili a causa dei un po 'diversi tassi di sviluppo tra gli embrioni.

5. Analisi quantitativa di Shape orofacciale e Morfometria

  1. Luogo punti di riferimento e create file di riferimento di coordinate (illustrata nella Figura 5A).
    1. Scegliere Limiti tali che catturano la forma dell'immagine di destinazione, e possono essere ripetutamente collocati nella stessa posizione relativa in tutti i campioni da analizzare. Se una struttura non esiste in tutti i campioni, non posizionare un punto di riferimento su questa struttura.
      1. Qui, mettere 24 punti di riferimento per rappresentare il midface con segni distintivi, come gli occhi, le narici e la bocca. Per coerenza, punti di riferimento posto a metà strada tra punti di riferimento precedentemente immessi (ad esempio, punti di riferimento della bocca, Figura 5Ai).
    2. Cattura coordinate punto di riferimento e creare "punto di riferimento di file di coordinate". Aprire la prima immagine di un volto girino (per esempio, il primo embrione di controllo).
      1. Selezionare la scheda Plugin sulla barra degli strumenti principale e scegliere Pointpicker dal menu a discesa. Selezionare la scheda aggiungere punti e luogo luoghi di interesse a posizioni desiderate come punti di riferimento verranno visualizzati come croci multicolore ( Figura 5Ai).
      2. Spostare location punto di riferimento dopo il posizionamento selezionando lo strumento Sposta croci. Quando tutti i punti di riferimento sono stati collocati sopra l'immagine, selezionare la scheda Visualizza risultati sulla barra degli strumenti principale e selezionare Mostra (Figura 5Aii) per visualizzare le coordinate punto di riferimento e copiare in un programma di foglio di calcolo (Figura 5Aiii).
      3. Quando si incolla queste coordinate di questo primo embrione in un programma di foglio di calcolo, lasciare una riga vuota sopra i dati. Nella colonna B del presente riga vuota (riga 1), digitare "LM =" con il numero di punti di riferimento nel campione. Qui, immettere "LM = 24" da 24 punti di riferimento sono stati creati (Figura 5Aiii, scatola rossa).
      4. Nella riga sotto il punti di dati, digitare "ID =" con un nome che identifica il campione. Qui in figura 5Aiii, inserire "ID = CON1" dal momento che si tratta di dati del primo embrione di controllo (Figura 5Aiii, freccia rossa) la coordinata punto di riferimento.
      5. Ripetere questo processo con le facce di ogni embrione nell'esperimento (sperimentale e di controllo) fino a quando tutte le coordinate punto di riferimento sono stati inseriti nel foglio di calcolo.
        NOTA: E 'importante che ogni embrione viene assegnato un nome univoco nel "ID =" riga. Qui per esempio, la prossima serie di coordinate punto di riferimento è dato l'ID di "CON2", in quanto era la seconda embrione nel gruppo di controllo.
      6. Copiare l'intero seconda e terza colonna in un documento di testo e salvarlo come un file .txt.
  2. Impostare il programma morfometrica software per l'analisi dei dati (illustrato nella Figura 5B).
    1. Qui, selezionare Crea nuovo set di dati nel menu principale del programma software morfometrica. Nome al file e il set di dati nelle caselle appropriate (ad esempio, "Acido retinoico inibizione" e "punti di riferimento del viso", rispettivamente) nella schermata pop up (Figura 5BI). Importare il file come TPS, e select il file di testo di coordinate per creare il set di dati (Figura 5BI, freccia rossa).
    2. Allineamento dei dati e Procuste in forma:
      1. Eseguire una misura Procuste e l'allineamento. Evidenziare i dati indicati nella scheda Progetto Albero, scegliere Preliminari sulla barra degli strumenti principale, e New Procuste Fit nel menu a discesa.
      2. Scegli Allinea asse principale e selezionare Effettuare Procuste Fit nella parte inferiore della scatola (Figura 5Bii, freccia rossa). Ritorno alle Preliminari menu a discesa, selezionare Genera covarianza Matrix (Figura 5Biii), e selezionare Esegui.
      3. Guarda le correlazioni della covarianza Matrix nella scheda Risultati.
    3. Creare un "file di classificatore" assegnando ogni campione nel set di dati per la variabile di classificazione appropriato per distinguere se si appartiene al gruppo sperimentale o al gruppo di controllo.
      1. Etichettare due colonne in un foglio di calcolo. Etichettare l'intestazione del primo Column con "ID" e l'ingresso dello stesso ID determinato per ciascun campione (per esempio, CON1, RARINHIB1, e così via; Figura 5Biv). Etichettare l'intestazione della seconda colonna con "TRATTAMENTO" e l'ingresso in ogni cella il gruppo di trattamento che corrisponde al campione elencato nella cella ID adiacente.
      2. Qui, utilizzare "Controllo e RAR inibitore" etichette come classificatori (Figura 5Biv). Copiare in un file di testo e salvarlo come un file .txt. Variabili Import Classificatore nel programma software morfometrica. Scegli Partita da Identifier, e aprire il file di testo (Figura 5Bv).
  3. Creare una analisi delle componenti principali (PCA) diagramma a dispersione selezionando il menu a discesa Variation e scegliendo Analisi delle Componenti Principali (Figura 6AI). Quindi, selezionare la scheda Grafica per visualizzare tre schede: modifiche di forma PC, autovalori, e le colonne sonore per PC (Figura 6Aii). La scheda punteggi PC visualizza il bivariate principale componente grafico a dispersione dei dati punto di riferimento in forma Procuste (Figura 6Aii).
    1. Per cambiare quali sono tracciati delle componenti principali, il menu a comparsa nello spazio grafico e selezionare l'asse desiderato di cambiare (Figura 6Aiii, freccia rossa).
    2. Selezionate lo strumento Punti dati a colori (Figura 6Aiii). Selezionare classificatori precedentemente importati (Sezione 5.2.2) nel secondo menu a comparsa che appare per determinare il colore di ogni categoria (Figura 6Aiv).
    3. Visualizzazione della quantità di varianza catturata da ciascun componente principale nella scheda Risultati (Figura 6AV). Grafico Esporta come file .bmp.
  4. Creare una analisi funzione discriminante (DFA) della griglia trasformazione nel programma software morfometrica scegliendo Funzione Analisi Discriminante nella scheda di confronto (Figura 6BI). Nel menu a comparsa, assicurarsi che il set di dati appropriato è selette e il tipo di dati è coordinate Procuste-fit.
    1. Evidenziare le coppie di gruppi da confrontare, ed eseguiti 1000 test di permutazione (Figura 6Bii).
    2. In Grafica, visualizzare la mappa vettore delle coordinate nella scheda Forma differenza (Figura 6Biii). Se l'immagine è invertita, il menu a comparsa nello spazio complotto per capovolgere lo schema con l'orientamento corretto (Figura 6Biii).
    3. La direzione dei vettori riflette la differenza di forma del primo gruppo rispetto al secondo, che viene visualizzato nel menu delle funzioni Discriminante prima di eseguire l'analisi (Figura 6Bii). Per invertire la direzione dei vettori, il menu a tendina nello spazio trama e cambiare il segno del fattore di scala in modo che sia negativo (Figura 6Biii, iv). Il valore del valore di scala è impostato su un fattore dieci che meglio rappresenta le differenze statistiche in posizione di punto di riferimento between i due gruppi, senza distorsioni, e di solito è lasciato al default (Figura 6Biv).
    4. Anche nel menu a comparsa, modificare il grafico di una griglia di trasformazione per sovrapporre i vettori su una griglia (Figura 6Biii, v).
    5. Specificare il numero di linee orizzontali e verticali della griglia nel menu di scelta rapida (Figura 6Biii, v).
    6. Esportare il grafico come file .bmp.
    7. Guarda le distanze Procuste e Mahalinobis e p-value nella scheda dei risultati (Figura 6Bvi).
  5. Ulteriori analisi morfometriche che sono utili per la valutazione di più di un gruppo di trattamento
    1. Creare una griglia di trasformazione analisi delle componenti principali. La Forma PC Cambia scheda visualizza la mappa vettoriale di cambiamenti di forma che rappresentano la varianza all'interno di ciascun gruppo di campioni. Utilizzare il menu a comparsa nell'area del tracciato per orientare correttamente l'immagine e sovrapporre i vettori su una griglia di trasformazione. Imposta il fattore di scalaal valore delle ascisse del grafico punteggi PC che corrisponde al centro approssimativo del gruppo di controllo. Esportare l'immagine come file .bmp.
    2. Creare un grafico a dispersione CVA. Nella scheda di confronto sulla barra degli strumenti principale, selezionare Canonical Variate Analysis, ed evidenziare la variabile di classificazione che è stato precedentemente importato (si veda la Sezione 5.2.3). Seleziona 1.000 iterazioni di test di permutazione, quindi selezionare Esegui. Selezionare la scheda punteggi CV per visualizzare il CVA grafico a dispersione bivariato. Questo è un codice colore in base ai classificatori caricati. Modificare la combinazione di colori portando il menu pop-up nello spazio grafico (si veda la Sezione 5.3.3). Esporta come file .bmp.
    3. Creare una griglia di trasformazione CVA. Una griglia trasformazione dei risultati CVA può essere generato quando si confrontano più di due gruppi. Nella scheda Graphics, scegliere CV cambia forma per visualizzare la griglia di trasformazione delle coordinate punto di riferimento. Richiamare il menu pop-up nello spazio complotto per cambiarela direzione del vettore, sovrapporre i risultati su una griglia di trasformazione, e specificare il numero di linee della griglia. Esportare il grafico come file .bmp.

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Risultati

Qui, un'analisi quantitativa di dimensioni oro-facciale e la forma è stata dimostrata per confrontare embrioni trattati con un inibitore del recettore dell'acido retinoico (RAR inibitore) per controlli non trattati. Gli embrioni sono stati trattati con una concentrazione 1 mM di questo inibitore della sostanza chimica da fase 24 a 30 (26-35 HPF), sbiaditi, e fissati allo stadio 42 (82 HPF). Sono stati poi elaborati ed analizzati come descritto nel protocollo. I risultati sono dati originali, ma in linea con le osservazi...

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Discussione

Xenopus laevis è diventato uno strumento utile per sezionare i meccanismi di sviluppo di sviluppo oro-facciale sottostante; tuttavia, attualmente non esistono protocolli che descrivono dimensioni e la forma cambiamenti di questa regione in rane. Il metodo qui descritto contribuirà in modo significativo al settore dello sviluppo oro-facciale, consentendo per la più rigorosa quantificazione dei fenotipi orofacciali in Xenopus e altri vertebrati.

Il primo aspetto, più critico ...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Fondi di start-up di A. Dickinson da VCU sostenuto questo lavoro.

Gli autori desiderano ringraziare Dan Nacu per il suo talento artistico nel creare la rappresentazione schematica.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Microscopio da dissezioneZeiss dotato ditelecamera AxioCamICC1
Pinze Dumont #5 InoxFine Science Tools11251-10
Bisturi sterile monousoSklar06-2015
Piastra a 24 pozzettiFisher Scientific087721
Standard Pipette di trasferimento monousoFisher Scientific13-711-7M
Piastre di Petri da 150 mm x 15 mmFalcon351058
IncubatoriEctotermicoimpostato su 15 ° C o 20 gradi C
Argilla da modellarePremo, o altra argillain bianco o nero
Ago da taglio drittoThermo Scientific19010
Tubo capillare (per aghi)FHC30-30-1Borosil 1,0 mm OD x 0,5 mm ID/Fibra, 100 mm ciascuno
Estrattore per aghi, Modello P-97Sutter Instrument Co.Estrattore per ago: P-97 Flaming/ Bown estrattore per micropipette Filamento: FB300BPer i filamenti, utilizzare filamenti Sutter da 3,00 mm quadrati a scatola, larghi 3,0 mm.
PipettemenGilsonF144802, F123600, F123602
BMS-453Tocris3409
DMSOAmerican BioanalyticalAB00435-01000
CisteinaSigma-Aldrich52-90-4
Polvere di paraformaldeideSigma-Aldrich158127
piastre di PetriFalcom353003, 351058100 mm di diametro e 150 mm di diametro
100% etanoloVWR89125-170
da modellare non tossica

Riferimenti

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