Un manuale Schermo piccole molecole si avvicina ad alta velocità Uso embrioni di zebrafish

Summary

Il pesce zebra è un ottimo organismo sperimentale per studiare vertebrati processi di sviluppo e malattie umane modello. Qui, descriviamo un protocollo su come eseguire uno schermo manuale di chimica ad alta velocità in embrioni di zebrafish con tutto il montaggio ibridazione in situ (WISH) Lettura.

Abstract

Zebrafish sono diventati un diffuso organismo modello per studiare i meccanismi che sono alla base della biologia dello sviluppo e di studiare la patologia malattia umana a causa della loro notevole grado di conservazione genetica con gli esseri umani. Genetica chimici trattasi, il testare l'effetto che le piccole molecole hanno su un processo biologico e sta diventando un metodo popolare di ricerca traslazionale per identificare i composti terapeutici. Zebrafish sono specificamente attraente per utilizzare per la genetica chimica a causa della loro capacità di produrre grandi frizioni di embrioni trasparenti, che vengono fecondate esternamente. Inoltre, zebrafish embrioni possono essere facilmente trattati con farmaci con la semplice aggiunta di un composto per il supporto embrioni. Usando tutto il montaggio ibridazione in situ (WISH), espressione di mRNA può essere chiaramente visualizzato all'interno di embrioni di zebrafish. Insieme, con la genetica chimici e WISH, il pesce zebra diventa un contesto organismo intero potente in cui per determinare il cellulare e fisiologicaeffetti di piccole molecole. Innovativi progressi sono stati fatti nel campo delle tecnologie che utilizzano procedure di screening basate sul computer, ma per molti laboratori tali opzioni non sono accessibili o rimangono un costo proibitivo. Il protocollo qui descritto spiega come eseguire uno screening genetico manuale di high-throughput chimico che richiede risorse di base e può essere realizzato da un singolo individuo o gruppo piccolo in un periodo efficiente del tempo. Così, questo protocollo fornisce una strategia praticabile che può essere implementato da gruppi di ricerca di eseguire la genetica chimici in zebrafish, che può essere utile per acquisire conoscenze fondamentali nei processi di sviluppo, meccanismi di malattia e di identificare nuovi composti e le vie di segnalazione che hanno applicazioni clinicamente rilevanti .

Introduction

L'identificazione di efficaci farmaci terapeutici per il trattamento di malattie umane è il finale di partita per molti ricercatori biomedici. Mentre l'identificazione e la caratterizzazione di potenziali agenti farmacologici per le applicazioni cliniche ha valore evidente per l'assistenza sanitaria, è rimasta una sfida significativa. In definitiva, lo sviluppo di molti composti terapeutici deriva dalla conoscenza di come specifici tipi cellulari o sviluppano o funzione. Il zebrafish, Danio rerio, è un teleostei d'acqua dolce della famiglia dei ciprinidi che è diventato un modello tradizionale organismo in biologia dello sviluppo ^1. Zebrafish sono geneticamente vertebrati trattabili che sono facili da mantenere e manipolare per gli studi scientifici ^2,3. L'embrione zebrafish è trasparente, fecondato esternamente, e può essere prodotto da centinaia da una singola coppia di accoppiamento adulto in una sola settimana ^2,3. Inoltre, i principali sistemi zebrafish organi di azioni e in possesso di un grande degree di somiglianza genetica con i mammiferi, compreso l'uomo ^4. Sorprendentemente, il 70% dei geni umani hanno un ortologo zebrafish ^4. A causa di questa somiglianza, zebrafish essere un sistema sperimentale di grande rilevanza per lo studio dei meccanismi di sviluppo dei vertebrati e fisiologia, e sono stati impiegati ricapitolare una moltitudine di malattie umane ^5-7. Queste ragioni, tra gli altri, hanno fatto il pesce zebra un candidato ideale per continuare gli interrogatori genetici e ha portato ad un apprezzamento sempre crescente per l'utilità di zebrafish nella ricerca biomedica ^6,7.

Nel corso degli ultimi decenni, una grande varietà di strumenti genetici sono stati sviluppati in zebrafish. Il genoma zebrafish è suscettibile di mutagenesi e transgenesi ^3. Fino ad oggi, una pletora di forward e reverse studi genetici sono stati effettuati, porta alla generazione di oltre 9.000 mutanti ^3. Inoltre, numerose linee transgeniche devono essereen creato, che hanno permesso l'etichettatura e l'isolamento di specifici tipi cellulari ^3. Ci sono stati notevoli sforzi in corso per centralizzare e distribuire queste risorse per la comunità di ricerca, che sono accessibili per i laboratori ad un piuttosto basso costo attraverso il Zebrafish Resource Center International (Zirc) ^8. Inoltre, un vasto archivio di informazioni biologiche e di strumenti molecolari, che vanno dai modelli di espressione genica di morfolino sequenze e protocolli, sono stati progressivamente annotato sul Network Information Zebrafish (ZFIN) ^9-11. Queste infrastrutture di ricerca di zebrafish sono stati resi possibili attraverso un significativo sostegno NIH e la promozione di questo modello animale ^8. Questa cache di mutanti di zebrafish, linee transgeniche, e le informazioni pertinenti continua ad essere di eccezionale valore per la comunità di ricerca biologica in generale. Tuttavia, mentre zebrafish sono ormai un organismo modello consolidato e preminente, che rappresentano a largely serbatoio inutilizzato per lo studio della biologia dello sviluppo e della malattia attraverso l'uso di schermi genetici chimici.

Genetica chimici è l'uso di piccole molecole, come farmaci o altri composti, ad incidere un processo biologico all'interno di un sistema vivente ^12. La genetica chimici possono essere implementate per comprendere i meccanismi molecolari della funzione del gene, in modo da identificare gli agenti che il salvataggio o esacerbare un difetto genetico specifico ^12. Inoltre, la genetica chimica rappresenta una importante via per condurre una ricerca traslazionale ^12. Mentre schermi genetici avanti tradizionali in modelli animali sono stati tremendamente potente nel collegare geni specifici per le malattie, non hanno una dimensione temporale, il che rende difficile o talvolta impossibile osservare fenotipi che deriverebbero dopo embriogenesi precoce. Inoltre, la ridondanza gene può rendere i risultati osservati dalla genetica a termine di difficile interpretazione. In alternativa, schermi genetici chimiciconsentire il controllo fine temporale e fornire allo stesso tempo un prezioso punto di partenza per la scoperta di farmaci ^12,13.

Genetica chimici possono essere eseguite utilizzando sistemi in vitro (ad esempio, linee cellulari, proteine) o mediante un sistema in vivo, come un intero organismo. Utilizzando un sistema in vitro per genetica chimica può essere vantaggioso perché è più semplice di un sistema organismo complesso, più facile da lavorare su larga scala, meno costosa e meno tempo ad alta intensità. Di conseguenza, i sistemi in vitro permettono sia ad elevata capacità di screening (HTS) e lo screening ad alto contenuto (HCS). Ci sono una serie di vantaggi di utilizzare un sistema in vitro da considerare quando si avvicina genetica chimica, ma anche significative limitazioni. Una limitazione importante da utilizzando una linea cellulare è che le piccole molecole possono essere efficaci e non tossici in una linea cellulare specifica, ancora diventato tossico quando introdotto in un intero organismo. Così, il punto crucialedel problema è che in vitro sistemi non catturano vasto contesto di un organismo e quindi non sempre sono in grado di imitare accuratamente ciò accade in un intero organismo. Durante il test composto negli organismi interi può aggirare questi problemi, l'utilizzo di modelli di organismi interi mammiferi pone una serie di limitazioni fisiche ed etiche. Ad esempio, screening di farmaci nel topo è logisticamente ostacolato dallo spazio e costi necessari per testare un campione di dimensioni adeguate. Inoltre, le domande di sviluppo possono essere difficili da studiare, a causa del fatto che i mammiferi sviluppano in utero. Infine, mentre la conduzione della ricerca biomedica ha un immenso valore sociale, ci sono comunque le esigenze sostanziali per la tutela del benessere degli animali, limitando studi intensi e alleviare il dolore e la sofferenza degli animali utilizzati per la ricerca. Zebrafish fornire un valido sostituto di lavorare con vertebrati superiori come i mammiferi, e, inoltre, molti argomenti possono essere studiate usando la genetica chimiche agli stadi embrionali e larvali in caso di trattamento neurologico è assente o operativa ad un basso livello di ^12,13.

Fino ad oggi, una miriade di schermi genetici chimiche sono state eseguite utilizzando zebrafish embrioni in particolare, come la consegna composto può essere realizzato immergendo embrioni in mezzi contenenti il farmaco di interesse ^12-15. Inoltre, ci sono stati numerosi progressi scientifici e tecnologici per rendere gli schermi genetici chimici possibile e gestibile ^16-20. Peterson e colleghi sono stati i primi ad utilizzare zebrafish in uno schermo genetica chimica nel 2000, e più tardi nel 2004 hanno identificato un composto che ha soppresso una mutazione coartazione aortica in zebrafish ^21,22. Schermi chimici allora sono stati implementati per studiare diversi tessuti in via di sviluppo (ad esempio, il cuore, i vasi sanguigni, ^23-25), funzioni fisiologiche (ad esempio, basi neurologiche del comportamento) ^26, la rigenerazione adulti ^27,28, e diseas modelli e (ad esempio, la distrofia muscolare e il cancro) ^29,30. Tra questi schermi chimici zebrafish, la scoperta che le prostaglandine regolano le cellule staminali ematopoietiche è stata presa per gli studi clinici sugli esseri umani, dimostrando il potere di spostare da "serbatoio al capezzale" ^23,31-33 (NIH, Clinica Trials.gov, NCT00890500; NCT01627314). Più di recente, promettenti terapie candidati sono emersi per gli organi complessi come il rene, che rimedio ai patologia cellulare nella malattia del rene policistico (PKD) ³⁴ e danno renale acuto ^27,35, anche se questi devono ancora passare alla sperimentazione clinica. Questi schermi genetici chimici ampiamente dimostrano l'utilità di testare piccoli composti in zebrafish sviluppo e la capacità di applicare la genetica chimici per interrogare funzione di tessuto adulto. Inoltre, vi è un crescente elenco di collezioni di farmacologia disponibili in commercio che sono disponibili per gli studi accademici ^19.

ove_content "> Negli ultimi anni, ci sono stati importanti progressi nella tecnologia chimica screening genetico, compreso l'uso di sistemi automatizzati di robot per l'erogazione e la gestione della droga, insieme a sistemi di imaging automatizzati ^36-38. Tali sistemi prevedono la possibilità di testare molte migliaia di composti per ottenere sia HTS e HCS ^36-38. Purtroppo, l'impresa di schermi genetici chimici con queste imprese innovative robotici in genere richiedono notevoli risorse. Questi tipi di risorse sono un ostacolo significativo per molte istituzioni che non hanno il capitale per l'acquisizione , operare e mantenere tale strumentazione. Pur stabilendo l'infrastruttura per la gestione robotizzata di librerie chimiche, compreso il trasferimento di embrioni schierati piatti, rimane il costo proibitivo per molti laboratori, imaging e analisi automatizzata è in genere più accessibile ^12. proiezione di immagini automatica permette di quantificare di fluorescenza re transgenicofacchini e facilita l'analisi fenotipica specifico ^12,15.

Anche se i sistemi automatizzati rappresentano utili progressi tecnologici, molte domande possono essere affrontate da schermi manuali più mirate, come ad esempio la query di diverse migliaia di composti biologicamente attivi in un processo di sviluppo di un intero-mount ibridazione in situ (WISH) lettura ^39. Inoltre, mentre un numero crescente di laboratori hanno invocato schermi chimici zebrafish per indagare su una domanda di ricerca, pochi saturazione (se presente) hanno raggiunto gli sforzi e molti argomenti non sono ancora stati violati con la genetica chimici. Schermi chimici possono essere eseguite con una piccola colonia zebrafish costituito da un solo tipo selvaggio pochi o serbatoi transgenici. Pertanto, questa forma di interrogatorio genetica deve essere raggiungibile dalla maggior parte dei gruppi di ricerca di zebrafish interessati ad ampliare / diversificare in questa arena. Librerie chimiche di varie dimensioni possono essere prelevati da un distributore commerciale e / o colboratori. Per questi motivi, la genetica chimici possono essere economicamente fattibile anche in dure climi finanziamento. Tuttavia, ci sono ostacoli ad iniziare una schermata genetica chimici, come il modo di pianificare gli aspetti logistici dello schermo: ad esempio, il numero di personale necessario per uno schermo di successo, l'assegnazione del tempo dedicato e mettere insieme un protocollo fisico di campioni elaborare manualmente che numero da centinaia a diverse migliaia. Qui, i dettagli di un protocollo di high-throughput manuale per effettuare la genetica chimici nell'embrione zebrafish con WISH come read-out. Questo metodo comporta il trattamento farmacologico di embrioni di zebrafish, seguita da rilevamento riboprobe di trascritti di mRNA. Usando questo protocollo, un piccolo team o anche di un solo individuo può ragionevolmente schermo e analizzare una biblioteca chimica modesto di circa 600 composti nell'arco di 9 settimane.

Protocol

Le procedure per l'utilizzo di zebrafish qui descritto sono stati approvati dalla cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale presso l'Università di Notre Dame. Una guida per il disegno di ricerca per questo manuale piccolo schermo molecola nella zebrafish è fornito (Figura 1). Una panoramica delle metodologie descritte in questo protocollo è fornito come un diagramma di flusso (Figura 2). Si prega di fare riferimento al sistema di etichettatura esempio (Figura 3) per programmare le fasi di lavorazione embrione descritti nelle parti 4-10. Per la messa in scena degli embrioni, si prega di fare riferimento alla serie messa in scena zebrafish ^40, e per la preparazione della volontà ribosonde antisenso utilizzati nelle parti 9-10, fare riferimento al metodo di recente pubblicazione ^41.

1. Preparazione di Zebrafish Camere di accoppiamento

1. Inserire un zebrafish adulto di sesso maschile e di un zebrafish adulto di sesso femminile in una camera di accoppiamento, separati dal divisore camera di O / N.
   NOTA: accoppiamenti di massa, tales quelli che utilizzano gruppi di 2-3 femmine e 2-3 maschi in grado di generare più embrioni rispetto al accoppiamenti singoli associati, e può essere eseguita con le camere di accoppiamento di dimensioni appropriate.
2. Ripetere il punto 1.1 in modo tale che un totale di 25 coppie di zebrafish sono set-up per ogni 96 pozzetti di piccole molecole che saranno testati.

2. Raccolta di embrioni di zebrafish

1. Il giorno seguente, rimuovere il divisorio che separa ogni coppia di pesce e dopo 1 ora, raccogliere embrioni di zebrafish con un colino a maglia fine e metterli in una capsula di Petri contenente il mezzo embrione E3 (vedi elenco dei materiali per la ricetta).
   NOTA: Raccolta embrioni dopo 1 ora fa sì che gli embrioni sono a stadi di sviluppo simili.
2. Utilizzare una pipetta di trasferimento in plastica per rimuovere i detriti (per esempio, cibo e rifiuti solidi). Successivamente, utilizzare uno stereomicroscopio per osservare ogni innesto di embrioni e rimuovere eventuali uova non fecondate.
3. Decantare i media embrione E3 e sostituirlo con fresco E3, quindi inserire ogni dish di embrioni in un incubatore a 28.5 °. Dopo 2 ore di osservare ogni innesto di embrioni utilizzando uno stereomicroscopio e rimuovere eventuali uova non fecondate.
   NOTA: le uova non fecondate possono avvelenare altri embrioni e vi sembrano essere in fase di singola cellula o opaco.
4. Continuare a monitorare lo stato di avanzamento dello sviluppo degli embrioni utilizzando uno stereomicroscopio fino a raggiungere il 40% Gastrulazione. Osservare la forma di sfera dell'embrione che sembra essere composto da due strati separati nella fase Gastrulazione 40% ^40.

3. chimica di diluizione Preparazione

1. Rimuovere la piastra di biblioteca chimica di conservazione a -80 ° C, coprire con un foglio di alluminio e scongelare è a temperatura ambiente.
   NOTA: le biblioteche diverse saranno scongelare a ritmi diversi a seconda soprattutto dal solvente utilizzato. Tipicamente, una biblioteca chimica congelato a -80 ° C sarà completamente scongelato in circa 3 ore a temperatura ambiente. Piastra Conservare scongelamento (s) in un luogo sicuro con appropriata etichettatura di merci pericolose. Indossare unocchiali ppropriate, un camice da laboratorio, e due set di guanti durante la manipolazione di sostanze chimiche.
2. Utilizzare una pipetta multicanale a 8 canali per aggiungere 99 ml di E3 in colonne 2-12 di una piastra da 96 pozzetti.
   NOTA: Dalla nostra esperienza, una gamma di droga che inizia appropriata è compresa tra 10 micron - 50 micron, e anche come descritto nei protocolli attuali ^39. Qui mostriamo un trattamento di 10 micron se si utilizza una libreria chimica della piastra di 1 mm.
3. Utilizzare una pipetta multicanale a 8 canali per aggiungere 1 ml di ciascun composto al suo rispettivo bene con E3.
4. Utilizzare un P10 per pipettare 1 ml di DMSO (o il solvente appropriato) nella colonna di controllo (qui, colonna 12).
5. Coprire la piastra di diluizione chimica con un foglio di alluminio, come il foglio di alluminio protegge composti sensibili alla luce nella libreria, e restituire la piastra libreria Stock chimica al -80 ° C per la conservazione.

4. arraying embrioni di zebrafish

1. Selezionare una capsula di Petricontenenti embrioni di zebrafish allo stadio Gastrulazione 40%. Usando una pipetta di trasferimento, posizionare con cura circa 10 embrioni all'interno di ciascun pozzetto di una (1,1 ml) profondo 96 pozzetti. Dispensare embrioni in colonne 2-12 del profondo 96 pozzetti.
   NOTA: Il ricercatore deve scegliere il tempo di valutazione della tossicodipendenza che meglio si adatta al processo di sviluppo che vogliono interrogare. L'uso di una pipetta di plastica può ridurre al minimo i danni embrione. Dal momento che il trattamento farmacologico prima al 40% Gastrulazione può portare ad un aumento di mortalità embrionale, sviluppare gli embrioni più a lungo prima esposizione al farmaco, in particolare quando sono allo studio processi di sviluppo successive. Posizionamento di più di 15-20 embrioni in ogni pozzetto può portare a ritardo dello sviluppo a causa di affollamento e dovrebbe essere evitato. È importante notare che la profonda 96 pozzetti contenente gli embrioni è diversa dalla piastra di diluizione chimica ben 96.
2. Utilizzare una pipetta di trasferimento di vetro per rimuovere l'eccesso E3 da ogni pozzetto, e di espellere l'eccesso E3 inun contenitore di rifiuti liquidi.
   NOTA: Questo processo richiede in genere 30 minuti a 1 ora a seconda della velocità del ricercatore, per cui gli embrioni sono tra il 50% e il 60% Gastrulazione dal completamento, che è lo stadio di sviluppo obiettivo per aggiunta della diluizione chimica qui descritta. La piastra può essere inclinato ad un angolo di 45 ° a causare gli embrioni cadono sul fondo del pozzo in modo che la punta della pipetta può essere premuto contro il fondo del pozzo per disegnare l'eccesso E3.

5. Aggiunta di trattamenti chimici

1. Utilizzare una pipetta multicanale a 8 canali per il trasferimento dei 100 diluizioni chimiche microlitri ai rispettivi pozzi nel profondo 96 pozzetti contenenti embrioni di zebrafish disposte.
   NOTA: Assicurarsi che il percorso pozzo originale del composto corrisponde con la posizione pozzo nel corrispondente profondo 96 pozzetti (per esempio, la posizione B1 bene nella piastra di diluizione chimica è pipettati nella posizione B1 bene nel profondo96 pozzetti).
2. Bagnate un tovagliolo di carta e metterlo in un contenitore sensibile alla luce abbastanza grande da contenere una piastra da 96 pozzetti.
   NOTA: Il tovagliolo di carta bagnato aiuta a prevenire l'evaporazione della diluizione chimica.
3. Quindi, utilizzare un tappetino di tenuta per sigillare la piastra pozzo profondo 96, metterlo nel contenitore sensibile alla luce, e incubare a 28,5 ° C.
   NOTA: Lasciate che i zebrafish embrioni si sviluppano fino alla mattina successiva. In alternativa, lasciare che gli embrioni si sviluppano fino allo stadio di sviluppo appropriato per il processo in fase di analisi.

6. Rimozione delle sostanze chimiche

1. Utilizzare una pipetta multicanale a 8 canali per aggiungere 300 ml di E3 per ogni fila di pozzetti trattati con farmaci. Aspirare e scartare la diluizione / chimica E3 da ciascuna fila di pozzetti. Lavare gli embrioni 3 volte con 300 ml di E3.
   NOTA: Scartare farmaco rifiuti in un contenitore etichettato utilizzato solo per questo scopo. Per facilità di lavaggio, utilizzare un bacino di vetro pieno di E3 sufficientemente ampia per utilizzare il multIChannel pipetta.

7. Pronase e fissaggio embrioni di zebrafish

1. Trasferimento embrioni di zebrafish utilizzando una pipetta di trasferimento di plastica in quattro 24 pozzetti, quindi rimuovere eventuali embrioni morti. Etichettare i 24 pozzetti in modo che corrispondano alle posizioni e droga originali. Posizionare la pipetta davanti a uno sfondo scuro dopo ogni trasferimento ben per visualizzare embrioni nella pipetta e prevenire embrione ben crossover.
2. Utilizzare una pipetta di trasferimento in plastica con l'erogazione di E3 in modo che gli embrioni sono appena immersi in un liquido.
3. Utilizzare una pipetta di vetro di aggiungere 2 gocce di pronasi magazzino (50 mg / ml) in ciascun pozzetto. Lasciate che gli embrioni in incubazione in pronasi per 5 minuti e poi agitare i pozzi per causare il corion di rompere a parte. In alternativa, Pronase gli embrioni prima che siano allo stadio di sviluppo desiderato per l'analisi.
4. Utilizzare una pipetta di trasferimento in plastica per lavare gli embrioni due volte con E3.
5. Una volta che gli embrioni sono in fase di analisi desiderato, completely erogare e scartare il restante E3.
6. Utilizzare una pipetta di trasferimento in plastica per aggiungere fresco 4% PFA / PBS in ciascun pozzetto. Incubare gli embrioni a 4 ° CO / N per risolvere. Utilizzare appena scongelati PFA per fissare inizialmente embrioni.
   NOTA: Procedere per eseguire l'analisi dello schermo di interesse. Dettagliata qui nelle sezioni 8-10 è una procedura per elaborare piatti schermo con WISH. I metodi alternativi possono essere sostituiti come desiderato, quindi passare alla sezione 11 e valutare i risultati.

8. Embrione Permeabilization

1. Utilizzare una pipetta di trasferimento in plastica per disegnare-off del 4% PFA / PBS dagli embrioni e lavare gli embrioni due volte con 1x (PBS con Tween) PBST. Trasferire gli embrioni in 48 pozzetti, quindi disegnare fuori 1x PBST dagli embrioni. Etichettare i 48 pozzetti per abbinare le posizioni e originali del profondo 96 pozzetti.
2. Lavare con l'aggiunta di metanolo al 100% ai pozzetti usando una pipetta di trasferimento in plastica quindi disegnare fuori e aggiungere 100% metanol nuovo per gli embrioni.
3. Mettere gli embrioni a -20 ° C, e incubare per almeno 20 min. In alternativa, tenere gli embrioni in 100% di metanolo a -20 ° C per la conservazione a lungo termine.
4. Rimuovere il metanolo 100% e lavare gli embrioni con il 50% MeOH / 1x PBST, quindi il 30% MeOH / 1x PBST, e infine due volte con 1x PBST.
   NOTA: Embrioni di età superiore a 24 ore dopo la fecondazione (HPF) può essere sbiancato, a questo punto per rimuovere la pigmentazione ^39.
5. Aggiungere 15 ml di proteinasi K scongelato magazzino (10 mg / ml) a 50 ml di 1x PBST per preparare una proteinasi K (5 mg / ml) soluzione di lavoro.
6. Rimuovere la 1x PBST dagli embrioni e aggiungere la soluzione di lavoro proteinasi K. Rimuovere la proteinasi K dopo 4 min.
   NOTA: Lo sperimentatore deve lavorare velocemente durante questa fase per evitare il degrado degli embrioni. Concentrazione proteinasi K e periodo di incubazione devono essere variato a seconda dell'età degli embrioni in trattamento ^41. I parametri qui descritti si riferiscono agli embrioniche sono 24 HPF.
7. Lavare gli embrioni con 1x PBST, quindi aggiungere ghiacciata 4% PFA / PBS. Lasciate che gli embrioni incubare in 4% PFA / PBS per 20 minuti a temperatura ambiente.

9. ibridazione e sonda di rimozione

1. Utilizzando un trasferimento pipetta di vetro rimuovere il 4% PFA / PBS e lavare gli embrioni due volte con 1x PBST. Sostituire la 1x PBST con 500 ml di HYB ⁺ e incubare gli embrioni per 4 ore a 70 ° C.
   NOTA: pre-ibridazione può essere eseguita a partire da un minimo di 2 ore, 4 ore, ma è ideale. Inoltre, diverse temperature di ibridazione e di lavaggio può essere ideale per alcune sonde, come ad esempio 65 ° C, ma dovrebbe essere testato su base individuale.
2. Generare riboprobes digossigenina marcato corrispondenti al gene (s) di interesse ^41.
3. Aggiungere 16 mg di riboprobe a 16 ml di HYB ^+. Pre-riscaldare il riboprobe / HYB ⁺ soluzione a 70 ° C per almeno 20 minuti prima di utilizzare. Se si utilizzano più sonde, aggiungere 16 mg di ogni sonda allo stesso HVolume YB ⁺ (16 ml).
4. Usando una pipetta di vetro, rimuovere la HYB ⁺ e utilizzare un P1000 da aggiungere 200 microlitri della riboprobe / HYB ⁺ miscela. Invertire l'riboprobe / HYB ⁺ cocktail appena prima dell'uso e pipettare su e giù una volta prima di aggiungere il composto in ciascun pozzetto. Utilizzare puntali per pipette per aggiungere il riboprobe / HYB ⁺ soluzione, questo impedisce il vapore della miscela di entrare nella pipetta.
5. Incubare gli embrioni nel riboprobe / HYB ⁺ cocktail a 70 ° CO / N. Utilizzare una pellicola adesiva per coprire i pozzetti della piastra per l'O / N sonda incubazione e tutte le seguenti lavaggi a caldo.
6. Preparare 50% formammide / 2x SSCT, 2x SSCT, e 0.2x SSCT e pre-calda a 70 ° CO / N.
7. Utilizzando un P1000, rimuovere il riboprobe / HYB ⁺ e conservare la miscela a -20 ° C. Facoltativamente, ri-utilizzare il riboprobe / HYB ⁺ miscela fino a tre volte. Prima di ogni riutilizzo, aggiungere 3 g di riboprobe al ribopr originaleobe / HYB ⁺ miscela.
8. Usando una pipetta di vetro, lavare embrioni due volte con 50% formammide / 2x SSCT per 30 min a 70 ° C. Lavare gli embrioni una volta con 2x SSCT per 15 minuti a 70 ° C. Lavare gli embrioni due volte con 0.2x SSCT per 30 minuti a 70 ° C. Rimuovere il SSCT 0.2x e lavare gli embrioni con MABT due volte a temperatura ambiente.

10. Anti-digossigenina incubazione e di rilevamento

1. Utilizzare una pipetta di trasferimento di vetro per rimuovere il MABT da ogni pozzetto. Usando una pipetta di trasferimento di plastica, aggiungere la soluzione di blocco fresco in ogni pozzetto. Lasciate che gli embrioni incubare in blocco per 4 ore a temperatura ambiente. Aggiungere 8 ml di anticorpo anti-digossigenina a 40 ml di soluzione di blocco (5,000 volte diluizione).
2. Usando una pipetta di trasferimento in plastica, sostituire la soluzione di blocco con la soluzione di anticorpi / blocco. Aggiungere la soluzione di anticorpi / blocco sufficiente a coprire completamente gli embrioni.
3. Coprire la piastra ben 48 con un foglio di alluminio, in modo che la luce non può penetrare attraverso le embrioni. IncUbate gli embrioni O / N a 4 ° C. Usando una pipetta di vetro, rimuovere la soluzione di anticorpi / blocco e lavare gli embrioni 10 volte con MABT per 5-10 minuti ciascuno.
   NOTA: I lavaggi MABT possono essere eseguite in continuo, in quanto ci vorrà il ricercatore 5-10 minuti per rimuovere MABT da ciascuna piastra e dispensare MABT fresca nei pozzetti.
4. Genera due tubi da 40 ml (80 ml totali) di tampone di pre-colorazione. Aggiungere 180 ml di NBT (50 mg / ml) e 140 ml di BCIP (50 mg / ml) ad uno dei tubi preparati dei buffer di pre-colorazione per creare la soluzione colorante.
   NOTA: Questa soluzione colorante genererà un substrato di colore viola.
5. Sostituire il MABT con buffer di pre-colorazione e lasciare che gli embrioni incubare a temperatura ambiente per 5 min.
6. Sostituire il buffer di pre-colorazione con la soluzione colorante e lasciare a temperatura ambiente. Monitorare la reazione colorimetrica ogni 15 minuti utilizzando uno stereomicroscopio.
   NOTA: Le reazioni di colorazione possono prendere da pochi minuti a molte ore a seconda della sonda.
7. Rappresentantemerletti la soluzione colorante con 1x PBST dopo la reazione di colorazione è completa e poi lavare gli embrioni due volte con 1x PBST per 5 minuti.
8. Rimuovere la 1x PBST e aggiungere 4% PFA / PBS per fissare gli embrioni.
   NOTA: In alternativa, eseguire un doppio desiderio di rilevare ribosonde etichettati con un anticorpo anti-fluoresceina. Se si esegue una doppia in situ, saltare aggiungendo 4% PFA / PBS (punto 10.9) dopo la 1x PBST lavaggio (passo 10,8) e lavare gli embrioni due volte per 15 minuti con 0,1 M glicerolo, due volte per 15 minuti con lavaggi MABT, e poi incubare gli embrioni per 30 min in blocco. Poi aggiungere l'anticorpo corretta O / N e eseguire i passaggi da 10,3-10,9 utilizzando la soluzione colorante corretta. Per rilevare il riboprobe fluoroscein marcato, preparare una soluzione di colorazione con BCIP e INT di osservare un substrato rosso (fare riferimento al punto 10.1).

11. Segnare le piastre Embryo schermo Chemical

1. Eseguire punteggio visiva dei risultati usando uno stereomicroscopio per valutare la sampl dell'embrionees nel test fenotipo.
2. Usando una pipetta di trasferimento in plastica, trasferire gli embrioni dai 48 pozzetti di piastre da 12 pozzetti per la visualizzazione ottimale. Etichettare le piastre da 12 pozzetti in modo che corrispondano alle posizioni e dal profondo 96 pozzetti originale. Quando il trasferimento è completo, visualizzare con lo stereomicroscopio.
   NOTA: gli embrioni rappresentativi possono essere selezionati da 12 pozzetti e ripreso su vetrini sotto un vetrino ^41.

Results

L'approccio manuale qui descritto consente per un singolo ricercatore di condurre in modo efficiente e con successo ad alta velocità di piccole molecole chimiche genetica schermo utilizzando il modello di zebrafish (Figura 1). Utilizzando questo metodo, è pratico per una sola persona per eseguire una schermata genetica chimica, in modo tale che nel corso 9 settimane di una persona (impegnato in una settimana lavorativa di 40 ore) può effettuare un rilevamento di ~ 600 composti (Figura 1) . In questo modo, il tempo di panchina di una persona in grado di bypassare la necessità di attrezzature che richiedono alta di risorse, sistemi automatizzati come. Il trade-off è che uno schermo manuale richiede diverse settimane di sforzo dedicato. Al contrario, l'utilizzo di sistemi automatici può comprimere il tempo coinvolta in 1-2 settimane di tempo robotico, e può comportare relativamente minimo sforzo ricercatore complessiva. Un modo per aumentare l'efficienza e / o la portata di uno schermo manuale è arruolare 2-3 ricercatori in totale, che consenta proiezione di mcomposti minerale, variando concentrazione del composto, e / o di screening per un periodo di tempo più breve.

Le fasi principali coinvolti nel protocollo di completare uno schermo genetica chimica in embrioni di zebrafish con un augurio di lettura sono illustrati in un diagramma di flusso (Figura 2). I compiti sperimentali possono essere divisi in due tipi di settimane di lavoro: (1) esposizione chimica ed etichettatura embrioni, e (2) analisi e di imaging. Nella settimana di lavoro di agenti chimici, questi passaggi comprendono l'istituzione di adulti di zebrafish (Giorno 1), di raccolta di embrioni, embrioni arraying e trattamento farmacologico (giorno 2), la preparazione di embrioni per l'ibridazione in situ (3 ° giorno), e l'ibridazione in situ (4 ° giorno -6). Nella settimana di analisi / immagini, il ricercatore analizza l'espressione di mRNA di segnare embrioni e colpi di immagine (giorno 7-11).

Una parte importante di eseguire uno schermo genetica chimici è quello di sempre e con precisione etichettare bene posizioni. Come lo schermo genetica chimica process dettagliato qui coinvolge trasferire gruppi di embrioni da un pozzo in un piatto per un pozzetto in una piastra diversa più volte, la necessità di etichettatura precisa e chiara è fondamentale, in modo che quando un colpo chimico è ottenuto può essere lineare e facilmente risalire alla sua identità all'interno della libreria chimica (Figura 3). Un modo semplice per garantire questo è per etichettare le piastre in modo tale che in qualsiasi momento la posizione bene per un insieme di embrioni trattati con un composto corrisponde direttamente alla piastra farmaco libreria posizione ben chimica del composto utilizzato per trattare tali embrioni (Figura 3). Qui, un doppio sistema di codifica a colori e le etichette numeriche viene utilizzato per organizzare i campioni, che sono stati aggiunti alle piastre di schermo utilizzando pennarelli indelebili (Figura 3).

Analizzando i risultati di uno schermo ad alta velocità, vi è una necessità critica per sviluppare un metodo per organizzare correttamente, annotare e analizzare i potenziali piccola molecolacolpi. Pertanto, uno schermo genetica chimica deve disporre di un sistema di classificazione completa e chiara che è stata attentamente progettata e rigorosamente rispettato. Un tale sistema dovrebbe facilmente e completamente convogliare le dinamiche importanti di un composto e fornire un modo conciso per presentare i risultati della schermata finito. Un modo per costruire un tale sistema è di embrioni grado utilizzano un sistema di classe, che spiegherebbe gravità morfologica complessiva e la fiducia di un colpo. Inoltre, le categorie di classe potrebbero essere accoppiati con ⁽⁺⁾ o ^(-) per descrivere sia un effetto espansivo o riduttivo sulla regione (s) di interesse. Qui, embrioni di zebrafish sono stati sottoposti a singoli composti da una libreria bioattivo (Enzo Chemicals) dal 50% al 24 Gastrulazione HPF, e quindi dosati con WISH utilizzando un cocktail di tre ribosonde di individuare i segmenti del nefrone (Figura 4A). Come un sistema di classificazione esempio, un pozzo che contiene un gruppo di embrioni che hanno avuto un convolu prossimale notevolmente ampliatata tubulo (PCT) delle pronephros, il rene embrionale zebrafish, causerebbe il composto utilizzato per trattare che oltre alla qualifica di (Classe I), che in questo caso rappresenterebbe classe associata con il difetto più grave e il più alto livello di fiducia nel fenotipo osservato (Figura 4B). Il composto sarebbe poi annotato con (PCT) e ^(+), la notazione completa essendo (Classe I - PCT ⁺⁾ (Figura 4B). Questo concetto di classificazione fornisce un modo semplice e veloce per descrivere un tesoro di informazioni riguardanti una piccola molecola di interesse, compresa la gravità dell'effetto composti sull'organismo, la regione che è influenzata dal farmaco e il modo in cui la regione è interessato (Figura 4B).

Figura 1. & #160;. Manuale strategia zebrafish schermo embrione chimica Un ricercatore può tenerne testare una piastra da 96 pozzetti di sostanze chimiche sugli embrioni di zebrafish ed eseguire la successiva elaborazione WISH nel corso di una sola settimana. Esecuzione di due settimane di test chimici (Settimana 1 (giorno 1-6) e Settimana 2 (giorno 7-12)) può essere accoppiato con una terza settimana dedicata al campione di analisi. Circa due piastre da 96 vale la pena di campioni dello schermo possono essere segnati e ripreso Settimana 3 (giorni 13-17). Questo scenario corrisponde alla proiezione di circa 200 composti in un periodo di tempo di 3 settimana, pari ad una piccola libreria di circa 600 composti completamente schermati da 9 settimane. Questa strategia manuale può essere modificato a seconda delle risorse disponibili. Per esempio, tre ricercatori possono ridurre il tempo per completare uno schermo di circa 600 composti a 3 settimane rispetto ai 9 settimane prenderebbe con un ricercatore. Strategie di screening possono essere adattati assegnando ricercatori ad aspetti specifici dello schermo, come trattamento di drogamento e ibridazione in situ o dirigere ricercatori di effettuare autonomamente l'intero processo di screening su parti separate della biblioteca chimica.

Figura 2. Diagramma di flusso:. Composizione di workflow schermo 6 giorni Il processo di screening chimico può essere discretamente suddiviso in 6 giorni. Giorno 1 consiste di creare coppie di zebrafish di accoppiamento (= /> 25) per la fornitura di embrioni per ogni 96 pozzetti per essere sottoposti a screening. Giorno 2 prevede la raccolta di embrioni dalle camere di accoppiamento e arraying in una profonda 96 pozzetti, seguito da trattamento farmacologico. Il giorno 3, gli embrioni sono pronti per volontà, tra cui dechorionation, la fissazione dei tessuti, e la disidratazione dell'embrione. Infine, WISH viene effettuata su embrioni attraverso Day 4-6. Si prega di notare che le procedure di colorazione alternative su campioni fissati può essere facilmente substituted per volontà.

Figura 3. Piastra etichettatura trasferimento schematica. Embrioni di zebrafish sono disposte e droga trattati in una piastra ben 96 per poi trasferirsi a una piastra ben 24 per la rimozione dei detriti e l'esposizione pronasi. Gli embrioni vengono poi spostati a 48 pozzetti per la preparazione embrione, WISH, e la fissazione dei tessuti. Successivamente, gli embrioni vengono trasferiti in piastre da 12 pozzetti per il punteggio, l'imaging, e lo stoccaggio. Arraying precisa degli embrioni si ottiene con l'uso di un sistema di codifica a colori che consente al ricercatore di tenere traccia della sostanza chimica di origine per ogni campione di prova. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4. Esempio Sistema di classificazione:. Rene test segmentazione Un esperimento WISH consente al ricercatore di macchiare tipi di cellule specifiche basate sull'identità delle sonde che vengono selezionati, consentendo la valutazione delle variazioni di fenotipi embrioni in base ai cambiamenti di posizione mRNA di trascrizione e / o livelli. A titolo di esempio, tre segmenti del rene embrionale zebrafish, le pronephros, sono stati etichettati utilizzando Mix schermo 1. Schermata Mix 1 è un cocktail di sonde costituite da wt1b, che localizza in particolare nei podociti (P), slc20a1a che segna il contorto prossimale tubulo (PCT), e SLC12A1 che etichetta il segmento distale primi ⁴⁷ (DE). Un simbolo ⁽⁺⁾ accanto a un'etichetta regione è utilizzato per annotare l'espansione o spostamento positivo di tale regione, mentre una ^(-) simbolo è utilizzato per dettare la diminuzione di una regione. Qui, embryos droga trattati con 13-cis RA hanno un contorto tubulo prossimale allargata e una perdita completa del segmento precoce distale senza alcun effetto apparente sulla podociti. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussion

Genetica chimici nel zebrafish può avere un impatto critico sulla progressione della scoperta di nuovi farmaci. Questo protocollo fornisce un metodo high-throughput manuale per eseguire la genetica chimiche in embrioni di zebrafish con un desiderio di lettura, che consente in modo efficace un team individuo o piccolo per condurre un piccolo schermo molecola. Questo metodo minimal-risorsa estende la fattibilità della genetica chimici per molti gruppi di ricerca. In particolare, questa strategia schermata fornisce un'importante alternativa all'uso di strumentazione robotica, in cui tali sistemi non sono ampiamente accessibili attraverso dipartimenti di ricerca. Questa schermata manuale permette un singolo individuo per testare una piastra da 96 pozzetti di composti con una lettura WISH in una settimana lavorativa di 6 giorni. Dal momento che zebrafish sono ovipari, con gli embrioni in via di sviluppo al di fuori del genitore, e gli embrioni sono abbastanza grandi da vedere ad occhio nudo (tra 1-3 mm), sono suscettibili per la movimentazione manuale con strumenti semplici e il ricercatore può campioni di matrice inpiastre multi-pozzetto senza l'uso di un microscopio. Inoltre, poiché zebrafish sviluppano rapidamente, piccola esposizione molecola può essere efficace con un singolo trattamento di un composto, invece di dosi ripetute, che minimizza l'ulteriore elaborazione manuale. Zebrafish embrioni sono facilmente coltivate perché la loro tuorlo fornisce una fonte di alimentazione fino a 5-6 giorni dopo la fecondazione, che elimina la complicazione di avannotti alimentazione. Inoltre, la maggior parte degli organi larvali hanno sviluppato e diventare funzionale durante questo periodo, che prevede la possibilità di studiare una vasta gamma di domande di ricerca. La semplice aggiunta di piccole molecole ai media embrione di incubazione non è invasivo e permette al ricercatore (s) per selezionare per la dose di droga, il tempo di più, e la durata di esposizione fornendo così uno stretto controllo su molte variabili e consentendo processi di sviluppo specifici di interesse da interrogare. Come descritto qui, significativa la produttività della ricerca può essere raggiunto in un breve timeframe utilizzando questa metodologia schermo manuale. Nella nostra esperienza, vi è un elevato ritorno sullo sforzo investito, che può essere accentuata utilizzando una libreria chimica bioattivo noto per analizzare un processo di interesse, quali la segmentazione nefrone durante lo sviluppo renale (Figura 4; Poureetezadi e Wingert, non pubblicato).

Lo schermo chimico manuale a qui descritto è eccezionalmente versatile perché si tratta di un test su campioni di zebrafish fisse. Ad esempio, questa strategia può essere modificato per testare diversi piatti di composti in una settimana e poi a segnare embrioni settimana successiva. Test alternativi su campioni di zebrafish fissi, come immunoistochimica o altro di colorazione dei tessuti preparati, potrebbero anche essere sostituita da un WISH di lettura. Strategie sperimentali per eseguire test cellulari in zebrafish sono adattabili a causa della chiarezza ottica e la trasparenza delle fasi precoci dello sviluppo. Inoltre, i ricercatori in grado di inibire la pigmentazione in seguito staGES uso di prodotti chimici o evitare la complicazione di sviluppo del pigmento del tutto attraverso l'uso di linee genetiche pigmento-meno come Casper o pura zebrafish ^13. E 'fattibile per gestire manualmente piccole molecole, elaborare la macchia (s) di interesse, e di segnare manualmente embrioni utilizzando un semplice stereomicroscopio. Tuttavia, è importante tenere presente che l'analisi automatica delle immagini può essere eseguita, e può infatti essere necessaria per l'analisi fenotipica alta risoluzione. Ad esempio, può essere preferibile partner di un sistema di analisi delle immagini automatizzata con un saggio diretta, come reporter transgenico, in quanto ciò semplifica il trattamento manuale dei campioni, quantifica le differenze non facilmente distinguibili ad occhio nudo, ed elimina ricercatore polarizzazione ^15. Fortunatamente, alcuni sistemi di imaging automatizzati sono sia facile da usare ed economico in termini di costi del software ^15. L'uso e le capacità di altri sistemi automatizzati sono rapidamente evoluti e in grado diessere utilizzata per gli organismi orientare, gestire trattamenti farmacologici, e persino di trasferirsi organismi ^12,15. Questi sistemi automatizzati hanno annunciato una nuova era tecnologica della ricerca e hanno fornito soluzioni innovative di manipolare grandi quantità di soggetti di prova ed eseguire HTS quindi e HCS approcci negli organismi interi ^12,15. Anche se tali macchine sono innegabilmente strumenti utili, ma sono anche molto costosi e sono fuori dalla portata di molti laboratori di ricerca di base. Senza l'accesso a queste funzionalità automatizzate può sembrare che gli schermi chimici non sono possibili. Tuttavia, questo protocollo delinea una guida per come condurre uno schermo manuale che può essere utilizzato per completare una schermata genetica chimica in modo pratico per un periodo di tempo ragionevole.

Esistono svantaggi per entrambi di screening e chimiche genetica manuali in genere, e dovrebbero essere tenuti a mente quando si considera uno schermo chimico. In particolare, il metodo illustrato qui richiede un grado moderatodi destrezza fisica. Questa preoccupazione è ridotta o del tutto ovviato attraverso la ripetizione, come destrezza migliorerà con la pratica. Inoltre, c'è spazio per il minimo errore grossolano, in quanto ci sono solo 10 embrioni per bene per l'analisi. Le molecole piccole possono variare nel penetranza del fenotipo che è indotta, in modo da un regime di punteggio ragionevole per identificare i composti di interesse devono essere rispettate. E 'fondamentale che i ricercatori utilizzano questo protocollo elaborare criteri sufficientemente rigorosi per quello che prenderà in considerazione un successo. E 'anche importante tenere presente che la natura di questa forma di uno schermo molto probabilmente produrrà una certa porzione di falsi positivi, che possono essere delineate attraverso un ulteriore chimica work-up. Inoltre, è fondamentale mettere in scena gli embrioni con precisione e di raccogliere frizioni per lo screening poco dopo la fecondazione, lo sviluppo asincrono può portare a complicazioni nel valutare con precisione l'effetto dei trattamenti farmacologici. Inoltre, per quanto riguarda lo screening chimico come un exstrategia sperimentale, ci sono una serie di limitazioni. Solubilità e tossicità di molecole carrier composto (ad esempio, dimetil solfossido (DMSO)) possono anche presentare un problema e possono essere proibitivi per testare molte molecole. Il corion può anche fungere da barriera alla esposizione al farmaco. Infine, anche se zebrafish sono un modello potente e traslazionale per genetica chimica, si deve sempre essere presa nel determinare se una strategia alternativa schermata chimica, ad esempio, utilizzando un sistema in vitro come ad esempio una linea cellulare, può essere sostituito per l'uso di tutta animali. Tuttavia, trattamento chimico nell'intero sistema zebrafish è considerato preferibile condurre approcci simili nei mammiferi, in quanto fornisce il vantaggio di raccogliere gli effetti sistemici dei composti e può permettere ai ricercatori di triage l'elenco dei composti da testare in un modello di mammifero.

Fino ad oggi, gli schermi chimici zebrafish hanno fornito un potente strumento sperimentale to delineare i meccanismi di sviluppo e per accertare candidati agenti farmacologici per uso in medicina, come l'identificazione di molecole capaci di prevenire patologie malattia. Ad esempio, uno studio di Burns e colleghi hanno sviluppato un test di micro-e automatizzato per la frequenza cardiaca utilizzando embrioni di zebrafish transgenici che esprimono GFP nel miocardio ^42. Hanno usato questa linea transgenica di analizzare la frequenza cardiaca in fase di sviluppo e come è stato influenzato in seguito al trattamento di droga ^42. Un altro studio, testando la densità di popolazione di cellule staminali ematopoietiche in embrione zebrafish, ha rilevato che prostaglandina E2 regola la nicchia HSC ^23. Questo risultato è stato convalidato nel topo, e successivamente è stato implementato per la sperimentazione clinica nel trapianto di cordone ombelicale umano ^23,31-33 (NIH, Clinica Trials.gov, NCT00890500; NCT01627314). Attraverso diversi studi recenti, la genetica chimica ha dimostrato di essere utile per lo studio delle malattie renali con il pesce zebra ^{43. Il rene zebrafish fornisce un eccellente paradigma per lo studio nefrogenesi o la rigenerazione del nefrone, l'unità funzionale che comprende il rene durante lo sviluppo e renale acuta lesioni 43. Struttura del nefrone è altamente conservata tra il rene embrionale zebrafish e il rene dei mammiferi adulti 44-50. Diversi studi che esaminano il rene embrionale zebrafish illustrano chiaramente la sua intrinseca potenzialità di traslazione quando accoppiato con la genetica chimici. Uno schermo genetica chimica è stata effettuata su due mutanti di zebrafish che sono stati associati al PKD2 e ift172 geni, che sono noti per essere protagonisti di malattia del rene policistico (PKD) 34. Lo schermo ha portato a identificare la deacetilasi pan-istoniche (HDAC) inibitori tricostatina A (TSA) come una piccola molecola in grado di annullare i difetti morfologici normalmente visto negli embrioni mutanti. Un approccio diverso presa da de Groh e colleghi screening per composti che INDUCed edema in wild-type embrioni di zebrafish, che indicherebbe una perturbazione della funzione renale 35. Dopo aver identificato PTBA come un colpo, hanno osservato che oltre a causare l'edema, PTBA anche aumentato l'espressione di pax2a, un marker per progenitori renali. È importante sottolineare che un derivato ottimizzata di PTBA è stato poi dimostrato di diminuire la percentuale di mortalità di zebrafish adulto che ha subito danni ai reni gentamicina-indotta e, inoltre, ha accelerato il recupero di topi che soffrivano di danno renale 27. Nel loro insieme, questi contributi dalla genetica chimici zebrafish vetrina i tipi di scoperte che possono essere fatte con il metodo descritto in questo protocollo.}

Mentre la ricerca genetica chimici porta il merito sostanziale, non è senza alcuni problemi. Unicamente utilizzando un approccio genetica chimica può rendere complicato per determinare il gene oi geni specifici che vengono colpiti da un composto. Anche se viene trovata una destinazione (s), un SIgap gnificant può rimanere tra l'identificazione del composto e la comprensione del meccanismo (s) di azione in cui la piccola molecola si comporta. Ad esempio, può essere difficile determinare il meccanismo in cui una piccola molecola agisce poiché un singolo composto è in grado di avere una serie di effetti diversi all'interno di un organismo. Tuttavia, con l'avvento di nuove tecnologie e schermi genetiche più chimiche in fase di completamento in zebrafish, il problema di determinare un meccanismo sta diminuendo. Un metodo per determinare gli effetti molecolari dei composti identificati è quello di selezionare una libreria di droga bioattivi noti per lo screening, in cui meccanismi possono essere potenzialmente dedotte da dati precedentemente annotati. Inoltre, gli algoritmi chemoinformatic, come cancello Discovery, sono disponibili per l'uso che si possa paragonare somiglianze strutturali di un composto con un database di composti con meccanismi attribuiti ^14. Un altro modo per chiarire il meccanismo di un composto sarebbe quello di generare un microarray profilo dopo il trattamento e quindi interrogare questo profilo in una raccolta di profili di droga microarray, come ad esempio la connettività mappa, la ricerca per i composti meccanicamente definiti che provocano un effetto simile ^14. Questo approccio può essere utilizzato per identificare mutanti genetici che hanno un effetto simile a quello del composto di interesse. Trovare una connessione tra un composto e un mutante potrebbe suggerire che il composto funziona molecolarmente monte oa valle del relativo gene, che potrebbe essere delineato trattando i mutanti con il composto e Morpholinos. Un'altra opzione sarebbe quella di spettrometria di massa, che continua a diventare più ottimizzato per zebrafish. Questo metodo può essere utilizzato per delineare cambiamenti proteici specifici o modificazioni post-traduzionali dopo il trattamento farmacologico. Infine, piccole molecole o anche intere biblioteche sono a volte in grado di essere etichettato per la discesa di partner vincolanti. E 'anche interessante notare che, mentre il meccanismo di come una piccola molecola funzioni is di notevole importazione, ci sono farmaci approvati dalla FDA per il quale i meccanismi rimangono sconosciute.

Anche se zebrafish presentano molte somiglianze con i mammiferi sia geneticamente e fisiologicamente, vi è ancora un problema di attraversamento di droga ^14. Uno studio ha valutato la capacità di crossover dei colpi da uno schermo per gli inibitori del ciclo cellulare in embrioni di zebrafish ^50. Lo schermo ha portato all'identificazione di 14 risultati che erano precedentemente sconosciute di possedere un'attività ciclo cellulare. Di questi 14 composti, 6 sono stati trovati ad avere attività del ciclo cellulare in entrambi i saggi di colture cellulari umane e zebrafish, 3 sono stati dimostrato di essere siero inattivato in saggi di coltura cellulare, 1 era attivo solo nelle cellule zebrafish, e 4 avevano alcuna attività in entrambe le zebrafish o test di coltura cellulare umana, ma solo in tutto l'organismo zebrafish. In particolare, i 4 composti che avevano solo l'attività nel zebrafish dimostrano che non vi sono differenze tra zebrafish e mammiferi che possono prohibit il potenziale traslazionale di alcuni composti. Questa è una considerazione importante essere consapevoli di, tuttavia ci sono esempi di piccole molecole, come PGE ₂ che amplifica la capacità delle cellule staminali emopoietiche di attecchire nei soggetti umani e PTBA derivati ​​che consentono di migliorare il tasso di recupero renale nei mammiferi, fornendo così la prova di principio che di crossover è possibile ^23,31-33.

Indipendentemente da queste insidie, la genetica chimici e questo approccio minimal-risorsa ha molto da offrire alla comunità di ricerca. Genetica chimica è particolarmente utile nel pesce zebra e continueranno a svolgere un ruolo fondamentale nel interrogatori percorso molecolare e scoperta di nuovi farmaci. Schermi chimici a base di bersagli molecolari discreti sono storicamente soggetti ad un alto tasso di fallimento a causa di ciò che è noto come la costellazione di assorbimento, distribuzione, metabolismo, escrezione, e tossicologici (ADMET) ⁵¹ proprietà. Schermi chimici che utilizzano zebrafish perconcentrarsi su un processo, piuttosto che un obiettivo discreta, può aggirare diversi problemi ADMET e identificare composti che sono efficaci nel contesto dell'intero organismo. Con la crescente pool di risorse disponibili per la ricerca zebrafish, tra cui attuali ceppi mutanti e la possibilità di utilizzare la modifica del genoma per creare mutanti genetici mirati e transgenici, ci sono praticamente un numero illimitato di potenziali schermi genetici chimici utilizzando zebrafish. Molte biblioteche chimiche sono state curate, e le collezioni di span con bioattivi noti, nuovi composti, strutturalmente diverse e di struttura simile. Questi reagenti forniscono una vasta gamma di interessanti opportunità per le combinazioni di schermate che sono attualmente disponibili e che sono destinata a crescere ulteriormente nei prossimi anni. Con queste possibilità in mano, questo protocollo manuale e high-throughput fornisce un modo pratico e user-friendly per aumentare la capacità dei gruppi di ricerca di intraprendere schermi genetici chimici utilizzando zebrafish.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,1 - 10 μ l puntali per pipette naturali	USA Scientific	1111-3800
1x E3			Generare utilizzando 50x E3 e acqua deionizzata.
1x PBST			Genera 0,1% Tween-20 in 1x PBS.
10x PBS	American Bioanalytical	AB11072
piastra di colorazione a 12 pozzetti	BD-Falcon	35-3225
20x SSC	American Bioanalytical	AB13156
piastra a 24 pozzetti	BD-Falcon	35-3226
4% PFA/1x PBS			Genera il 4% di PFA (p/v) in 1x PBS - far bollire, quindi congelare e conservare a -20 °C.
La piastra a 48 pozzetti	CytoOne	CC7672-7548
50x E3			genera 16,5 mM di CaCl2, 16,5 mM di MgSO4, 250 mM di NaCl e 8,5 mM di KCl in acqua deionizzata.
Piastra a 96 pozzetti	VWR	100-11-940
Tappetino sigillante per piastre a 96 pozzetti	VWR	10011-946
anticorpo anti-digossigenina	Roche	11-093-274-910	Mantenere a -20 °C.
Azioni BCIP	Sigma	B8503	Generare 50 mg/ml utilizzando il 100% di DMF - congelare e conservare a -20 °C.
soluzione			Generare 50 ml utilizzando 10 ml di BSA (10%), 5 ml di FCS e 35 ml di MABT. (Disgelo BSA e FCS a 37 °C.)
Stock BSA (albumina sierica bovina) American	Bioanalytical	AB00448	Genera il 10% di BSA mescolando i fiocchi di BSA in MAB a temperatura ambiente, quindi congelali e conservali a -20 °C. (Conservare i fiocchi di BSA inutilizzati a 4 °C.)
Reagenti per reazioni di trascrizione in vitro con ribosonda marcata DIG/FLU	Roche	11175025910; 11685619910	Consultare la procedura del produttore.
DMF (dimetilformaldeide)	American Bioanalytical	AB00450
inibitore della DNasi 1, 10x tampone DNasi 1	Roche	4716728001
piatto di incubazione degli embrioni	Falcon	35-1005
epT.I.P.S 20-300 μ l	Eppendorf	22492284
Etanolo (EtOH)	Sigma	E7023	Generare 50 ml di EtOH al 70% con grado molecolare H2O e 100% EtOH, quindi conservare a -20 °C.
FCS (siero fetale di vitello) stock	Invitrogen	16140089	Mantenere a -20 °C.
unità di sterilizzazione con filtro	Corning	430516	0,45 μ m CA / 1 L di volume
pinze fini	Roboz	RS-1050
provetta per microcentrifuga a fondo piatto	VWR	87003-300; 87003-298
Formamide	American Bioanalytical	AB00600	Mantenere a -20 °C.
bacinella in vetro 90 x 50	Kimax Kimble	23000
pipetta in vetro	VWR	14673-010
fiala in vetro	Wheaton	225012
glicerolo	Sigma	G7893
glicina	Sigma	G8898
glicogeno	Roche	10901393001
HYB+			Genera il 50% di formammide, lo 0,1% di Tween-20, 5x SSC, 5 mg/ml di RNA di torula di lievito e 50 μ l/μ l eparina
INT stock	Sigma	I8377	Generare 55 mg/ml utilizzando il 70% di DMF e il 30% di H2O - congelare e conservare a -20 °C.
MAB			Generare aggiungendo 55,0 g di base Trisma, 8 ml di 1 M di Tric-HCl pH 9,5, 23,2 g di acido maleico e 17,5 g di NaCl a 1,5 L di H2O deionizzato. Quindi riempire con H2O deionizzato a 2 L e autoclave.
MABT			Genera 0,1% Tween-20 in MAB
MeOH	Sigma	34860-4L
da tè a rete	English Tea Store	SKU #ASTR_KEN, MPN#1705
acqua distillata di grado molecolare	Mediatech	25-055-CM
pipetta multi 8 canali 0,5 - 10 μ l	Eppendorf	3122000.019
pipetta multi 8 canali 30 - 300 μ l	Eppendorf	3122000.051
nanodrop	Thermo	ND-2000c
NBT stock	Sigma	N6876	Genera 50 mg/ml utilizzando il 70% di DMF e il 20% di H2O - congelare, quindi conservare a -20 °C.
di microscopia elettronica	per paraformaldeide	19210
Adesivo per pellicola PCR	Eppendorf	30127.48
contenitore per piastre (scatola per matite)	Sterilizzare	1722
tampone			Generare 0,1% Tween-20, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl e 100 mM Tris pH 9,5. (Prepara fresco per l'uso ogni volta.)
Pronase	Roche	11459643001	Generare 50 mg/ml utilizzando E3, congelare e conservare a -20 °C.
Proteinasi K	Roche	03-115-879-001	Generare 10 mg/ml in acqua deionizzata quindi congelare e conservare a -20 °C.
Inibitore della RNasi 1	Roche	3335399001
bulbo di gomma	Fisherbrand Fisher Scientific	03-448-22
soluzione colorante-viola	N/A	N/A	Generare utilizzando 45 μ l di NBT e 35 μ l di BCIP per ogni 10 ml necessari nel tampone di precolorazione.
soluzione colorante-rosso			Genera utilizzando 31.5 μ l di INT e 35 μ l di BCIP per ogni 10 ml necessari nel tampone di precolorazione.
stereomicroscopio	Nikon	SMZ645, SMZ1000
T3 RNA polimerasi	Roche	11031171001
T7 RNA polimerasi	Roche	10881775001
pipetta di trasferimento	Samco	202, 204
Tween-20 stock	American Bioanalytical	AB02038
bagnomaria	Thermo	51221073	( Modello # 2831)