Articolo metodologico

Isolamento e analisi funzionale dei mitocondri da cellule in coltura e Tissue mouse

DOI:

10.3791/52076

⸱

23 marzo 2015

 ,  ,  ,  , 
1Chemistry Department, Elon University, 2Department of Neurobiology and Anatomy, Wake Forest School of Medicine, 3Neuroscience Graduate Program, Wake Forest School of Medicine, 4ALS Center Translational Science Unit, Wake Forest School of Medicine

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il confronto del potenziale di membrana mitocondriale tra i campioni fornisce informazioni preziose sullo stato cellulare. Vengono descritti i passaggi dettagliati per isolare i mitocondri e valutare la risposta agli inibitori e ai disaccoppiatori utilizzando la fluorescenza. Il metodo e l'utilità di questo protocollo sono illustrati dall'uso di una coltura cellulare e di un modello animale di stress cellulare.

Abstract

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Il confronto tra due o più gruppi distinti, come sano vs. malattia, è necessario per determinare lo stato cellulare. I mitocondri sono al centro della salute cellulare a causa del loro ruolo sia nel metabolismo cellulare che nella produzione di energia, nonché nel controllo dell'apoptosi. Pertanto, la valutazione diretta dei mitocondri isolati e della perturbazione mitocondriale offre la capacità di determinare se si verifica una (dis)funzione organella-specifica. I metodi descritti in questo protocollo includono l'isolamento di mitocondri intatti e funzionali da cellule in coltura HEK e fegato e midollo spinale di topo, ma possono essere facilmente adattati per l'uso con altre cellule in coltura o tessuti animali. La funzione mitocondriale valutata mediante TMRE e l'uso di comuni disaccoppiatori e inibitori mitocondriali in combinazione con un lettore di piastre fluorescenti consentono a questo protocollo non solo di essere versatile e accessibile alla maggior parte dei laboratori di ricerca, ma anche di offrire un'elevata produttività.

Introduzione

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Le cellule viventi Energy Bank metabolica sotto forma di grassi e carboidrati e utilizzare questa energia per biosintesi, trasporto di membrana e movimento. Alcuni energia viene ottenuta nel citosol attraverso la conversione di zuccheri alimentari direttamente in ATP durante glicolisi. Tuttavia, la principale fonte di produzione di ATP in una cella è sfruttata all'interno dei mitocondri attraverso la catena respiratoria mitocondriale 1. L'architettura dei mitocondri fornisce l'orientamento spaziale necessaria per la produzione di ATP efficace ed efficiente. I mitocondri possiedono una doppia membrana separati da uno spazio intermembrane e insieme con la matrice, il compartimento mitocondriale interna, Casa componenti e coordinare le reazioni chimiche coinvolte nella produzione di ATP. La membrana interna contiene una serie di complessi proteina di membrana che compongono la catena respiratoria, nonché la ATP sintasi, il complesso proteico che porta ADP e Pi insieme per la formazione di ATP. La locandaer membrana viene ripiegato creste e gli elettroni passano attraverso la complessi della catena respiratoria attraverso il citocromo c, un vettore di elettroni solubile che si muove tra complessi all'interno dello spazio intermembrane. Come gli elettroni si muovono, ossidazione di riduzione equivalenti verifica e ioni idrogeno vengono pompati dalla matrice allo spazio intermembrane. Come conseguenza della elevata concentrazione di ioni all'interno dello spazio intermembrane, un gradiente elettrochimico costruisce un conseguente potenziale di membrana attraverso la membrana mitocondriale interna (Δψ) 2. L'ossigeno è l'elettrone accettore finale della catena di trasporto degli elettroni e gli ioni idrogeno fluire attraverso i sintasi ATP dallo spazio intermembrana torna alla matrice, e così facendo direttamente provoca la formazione di ATP. Questo processo come descritto nella sua interezza è noto come fosforilazione ossidativa. Le pieghe creste aumentano la superficie della membrana interna, consentendo il trasporto di elettroni massima e la produzione di ATP all'internoogni mitocondrio. Le proteine, enzimi e altre molecole coinvolte nella fosforilazione ossidativa sono derivati ​​da entrambi i geni nucleari e mitocondriali. I mitocondri contengono un proprio DNA circolare, codifica per 13 proteine ​​e tRNA e mRNA necessari per la produzione di ATP 3. Tuttavia, molte più proteine ​​sono necessari e quindi sono codificati nucleare. La maggior parte di queste proteine ​​codificate dal nucleo sono mirati alla matrice mitocondriale mediante l'uso di presequenze al N-terminale della proteina precursore, e la loro importazione è guidato in parte da Δψ 4,5.

Oltre contribuendo alle bioenergetica di una cella, mitocondri influenzano anche importanti processi metabolici come TCA e beta-ossidazione, segnalazione cellulare tramite regolazione del calcio, come pure un ruolo chiave nell'apoptosi 6. In particolare, durante i periodi di stress cellulare, proteine ​​BCL-2 familiari che risiedono o interagiscono a livello della membrana mitocondriale esterna può causare mitocondrialepermeabilità della membrana esterna (MOMP) 7,8. Durante MOMP, citocromo c e altre proteine ​​vengono rilasciati nel citoplasma, e insieme a diverse proteine ​​citosoliche formano un complesso chiamato apoptosoma 9,10. Il apoptosoma attiva caspasi che vanno a fendere proteine ​​e DNA cellulare durante la fase di esecuzione di apoptosi. Non appena si verifica MOMP, ΔΨ è crollato e la produzione di ATP si fermò. Funzione mitocondriale Così, come apoptosi è avviato viene compromessa e variazioni ΔΨ può essere correlato ad mitocondriale e cellule salute 12. Mentre l'apoptosi è un endpoint in molti modelli di malattia, la funzione mitocondriale e modifiche ΔΨ può anche fornire informazioni preziose sulla origine e / o la progressione della malattia. Per esempio, cambiamenti strutturali e funzionali mitocondriali sono state documentate nel corso di malattie neurodegenerative 13,14.

Nella prima parte del protocollo, isozione di mitocondri intatti che mantengono la loro ΔΨ è descritto. Cellule HEK-293T sono stati esposti a diverse concentrazioni e combinazioni di TNF-α ricombinante, IL1-β e IFN-γ di indurre apoptosi. Queste citochine sono stati scelti perché sono frequentemente segnalati per essere elevato in campioni settiche umani primari 15 e la via estrinseca di apoptosi può essere innescato da interazioni di legame al suo recettore TNF-α 6. Dato che ci sono sottili variazioni necessarie per isolare i mitocondri funzionale da tessuti primari rispetto alle cellule in coltura, e perché molte ricerche utilizza gli animali, il protocollo descrive anche come isolare i mitocondri dal fegato e midollo spinale di anteriore sclerosi laterale (ALS) modello di topo.

La seconda parte del protocollo è stato sviluppato per monitorare perturbazioni al potenziale di membrana mitocondriale utilizzando un colorante fluorescente potenziale sensibile con un lettore di piastre a fluorescenza. Differenzas tra lo stato cellulare (cioè, sano vs malsana) si differenziano per la forza di quantificazione ΔΨ di mitocondri isolati in combinazione con agenti di disaccoppiamento, inibitori della catena respiratoria, inibitori e ionofori complessi, i quali provocano dissipazione del potenziale di membrana mitocondriale. Il sano mitocondri, maggiore è la variazione ΔΨ seguito al trattamento con inibitori mitocondriali, quindi la risposta dei mitocondri può essere usata come indicatore di (dis) funzione mitocondriale.

L'utilizzo di mitocondri isolati piuttosto che nella valutazione situ della funzione offre la prova definitiva che una patologia o trattamento modula direttamente modifiche alla organello 16-18. Mentre ci sono metodi in letteratura per isolare mitocondri da cellule in coltura, sono vaghi 17 e / o di utilizzare attrezzature specializzate 16. Questo protocollo descrive in dettaglio il metodo di isolamento ed èfacilmente adattabile ad altre linee cellulari, incluse tessuto primario e culture 13,14,19,20. Molti studi mitocondri isolati utilizzano gli stessi uncouplers mitocondriali e inibitori utilizzati in questo protocollo, ma con un elettrodo di Clark (21 è un esempio rappresentativo di numerose pubblicazioni in letteratura), che è ancora un pezzo molto specifico e specializzato di apparecchiature. Inoltre, questo metodo tradizionale ha limitazioni come la bassa velocità e di elevata complessità 22,23 e richiede una notevole quantità di mitocondri (~ 500 ug / reazione). In questo protocollo, la fluorescenza membrana sensing potenziale TMRE sonda viene usata in combinazione con un lettore di piastre a fluorescenza, che è una macchina standard in molti laboratori. TMRE è considerato poiché entra rapidamente cellule e mitocondri isolati e può essere utilizzato a basse concentrazioni 24. Le reazioni multiple possono rapidamente essere impostati in tandem e lotti analizzati con questo protocollo. Inoltre, la reaziones richiedono un gran piccola quantità di mitocondri isolati (~ 10 ug / reazione). Richiedendo meno materiale, campioni di tessuto o di colture cellulari più piccole possono essere utilizzate come punto di partenza per l'isolamento mitocondri, più repliche o reazioni possono essere impostati e materiale potenzialmente sufficiente per altri esperimenti mitocondri isolati come la produzione di ATP, consumo di ossigeno, o l'importazione saggi sono possibili.

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Protocollo

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Tutti gli esperimenti sugli animali conformi alle linee guida del National Institutes of Salute e sono state approvate dalla Wake Forest University Animal Care and Use Committee. Coppie nidificanti di SOD1G93A [B6SJL-TGN (SOD1-G93A) 1Gur] modello di topo sono stati ottenuti da The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Wild-type (WT) femmine e maschi SOD1G93A nontransgenic [B6SJL-TGN (SOD1-G93A) 1Gur] sono stati allevati per generare topi SOD1G93A e nontransgenic fratellini WT che sono stati utilizzati negli esperimenti.

1. Modelli per Investigation

  1. Colture cellulari
    1. Mantenere cellule renali di embrioni umani (HEK-T293) cellule in DMEM supplementato con 10% di calore inattivato siero fetale bovino, 1% di penicillina-streptomicina e 1% L-glutammina, a 37 ° C in 5% di CO 2.
    2. Crescere cellule in fiasche T75 e consentire loro di raggiungere il 90% di confluenza.
    3. Effettuare splitting cellulare tramite tripsinizzazione (0,25% tripsina-EDTA) per 3-5 minuti a 37 ° C in 5% CO 2 , Inattivazione di tripsina con uguale volume del supporto cellulare, e centrifugazione delle cellule per 5 minuti a 700 xg in 4 ° C.
    4. Aspirare i media e risospendere il pellet cellulare in coltura.
    5. Cellule seme nel pallone o sulla piastra 7 x 10 4 cellule in un T75 boccetta 48 ore prima del trattamento con citochine. Questo dovrebbe dare ~ 70% di densità al momento del trattamento.
    6. Cellule priveranno siero 24 ore dopo aspirando media e sostituendolo con lo stesso volume di mezzi privi di siero (DMEM, sterile).
    7. Preparare TNF-α, β-IL1, e IFN-γ, dalla polvere liofilizzata con acqua ultra-pura a concentrazioni di lavoro di 5 pg / ml, 10 ng / ml, e 10 ng / ml, rispettivamente, e aggiungerli ai pozzetti / fiaschi.
    8. Siero Treat cellule fame mediante aggiunta di citochine solubilizzate direttamente al mezzo di coltura cellulare di flaconi appropriati. Trattamenti consisteva di singoli citochine, un cocktail di tutti e 3 (denominato "* 3"), o steracqua ile come controllo (denominato "0").
    9. Incubare cellule trattate per 24, 48 o 72 ore prima della valutazione e la raccolta.
  2. Valutazione vitalità cellulare
    1. Fare una soluzione 5 mg / ml di 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT) in PBS 1x.
    2. Per piastre da 12 pozzetti, aggiungere 100 ml di soluzione MTT ad ogni pozzetto e mescolare delicatamente per assicurare una distribuzione uniforme.
    3. Incubare le piastre per 15 min-1 ora a 37 ° C in 5% CO 2, e controllare al microscopio per la presenza di una colorazione viola. Se non è un viola presente, agitare di nuovo e consentono alle cellule di incubare in intervalli di 5 min fino viola si osserva. La quantità di tempo necessario deve essere determinato da ciascun ricercatore.
    4. Utilizzando un pipettatore a ripetizione, aggiungere 700 ml di solvente MTT (HCl 4 mM e 0,1% NP40 in isopropanolo) a ciascun pozzetto e la piastra di roccia (s) a temperatura ambiente per 5-10 minuti, o fino a quando tutto il colore viola aveva lasciato le cellule . Se violacolore non esce di cellule, aggiungere altri 200 ml di solvente e continuare a turbinare.
    5. Per l'analisi, prendere 100 ml di ogni bene e mettere in una piastra a 96 pozzetti e leggere su un lettore di piastre con 570 nm e una lunghezza d'onda di riferimento di 630 nm, ma 595 nm è accettabile a condizione che le letture sono prese a impostazioni coerenti.
  3. Modello animale di SLA
    1. Tutti gli esperimenti sugli animali conformi alle linee guida del National Institutes of Salute e sono state approvate dalla Wake Forest University Animal Care and Use Committee. Coppie nidificanti di SOD1G93A [B6SJL-TGN (SOD1-G93A) 1Gur] modello di topo sono stati ottenuti da The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Wild-type (WT) femmine e maschi SOD1G93A nontransgenic [B6SJL-TGN (SOD1-G93A) 1Gur] sono stati allevati per generare topi SOD1G93A e nontransgenic fratellini WT che sono stati utilizzati negli esperimenti.
    2. Eseguire genotipizzazione con primer standard, contro SOD1 mutante 25.

2. Isolamento dei mitocondri

NOTA: E 'importante lavorare velocemente e tenere tutto in ghiaccio durante tutta la procedura.

  1. Preparazione del tampone di isolamento mitocondriale (MIB), midollo spinale buffer di isolamento (SC MIB) e tampone sperimentale (EB)
    1. Preparare le seguenti soluzioni madre prima del tempo per MIB e EB.
    2. Fare 1 M Tris / MOPS sciogliendo 12,1 g di base di Tris in 70 ml di H 2 O. Aggiungi MOPS secco per arrivare a pH 7,4. Regolare il volume a 100 ml finale. Filtro sterilizzare e conservare a 4 ° C.
    3. Fare 1 M Kphos mescolando 80,2 ml di K 2 HPO 4 e 19,8 ml di KH 2 PO 4. Conservare a temperatura ambiente.
    4. Rendere 0,2 M EGTA / Tris aggiungendo 3,8 g di EGTA a 10 ml di H 2 O. Aggiungere 1 M Tris / MOPS fino disciolti, ~ 30-40 ml. Regolare a 50 ml, filtro sterile e conservare a temperatura ambiente. Si noti che il pH sarà ~ 6,7.
    5. Fare 1 M glutammato facendo 10 ml diSoluzione 1 M di acido glutammico. Filtro sterilizzare e conservare a 4 ° C.
    6. Fare 1 M Malate facendo 10 ml di soluzione 1 M di acido malico. Aggiungi Tris / MOPS a 50 mm. Filtro sterilizzare e conservare a 4 ° C.
    7. Effettuare MIB ad una concentrazione di saccarosio 200 mM, Tris 10 mM / MOPS, pH 7,4, e 1 mM EGTA / Tris. Filtro sterilizzare e conservare a 4 ° C.
    8. Rendere SC MIB ad una concentrazione di saccarosio 250 mM, 20 mM HEPES-KOH pH 7,5, KCl 10 mM, 1,5 mM MgCl 2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, e cocktail inibitore di proteasi.
    9. Effettuare EB ad una concentrazione di 125 mM KCl, 10 mM Tris / MOPS, pH 7,4, 5 mM glutammato, malato 2,5 mM, 1 K mM fosfato, pH 7,4, e 10 mM EGTA / Tris. Filtro sterilizzare e conservare a 4 ° C.
  2. Preparazione apparecchiature prima raccolta delle cellule.
    1. Risciacquare un piccolo recipiente di vetro e omogeneizzazione pestello tre volte con acqua sterile e disporli sul ghiaccio.
    2. Raccogliere gli elementi necessari, ad esempio drill standard, SCRA cellularepers, 1,5 ml, 15 ml e 50 ml provette e soluzioni.
  3. I mitocondri Isolation
    1. Cellule in coltura
      1. Per ogni tipo di campione, utilizzare due palloni T175 di cellule.
      2. Assicurarsi che le cellule sono ~ 90% confluenti e utilizzare in esperimenti di controllo, o piastra e trattare come descritto nel passaggio 1.2.
      3. Sulla parte superiore del banco, i media aspirare e lavare le cellule aderenti due volte con 15 ml di 1x PBS ogni volta.
      4. Aspirare il tampone e raschiare flaconi per rimuovere le cellule aderenti dal fondo del pallone.
      5. Aggiungere 15 ml di PBS 1x per ogni pallone, turbine, e trasferire ai singoli 15 ml provette coniche e posto sul ghiaccio.
      6. Una volta raschiatura è fatto, centrifugare le provette per 5 minuti a 700 xg, a 4 ° C utilizzando una centrifuga da tavolo utilizzando un rotore oscillante secchio.
      7. Supernatanti Aspirare e risospendere ogni pellet in 1 ml di MIB.
      8. Combinare entrambe le sospensioni e il trasferimento di un piccolo recipiente di vetro per omogeneizzazione.
      9. Aggiungi MIBal recipiente fino buffer raggiunge la prima riga. Omogeneizzare cellule con il pestello collegati ad un trapano a velocità media per tre passaggi. Assicurarsi che la nave è in ghiaccio durante questa fase, non rimuovere il pestello sopra il liquido e di utilizzare una velocità costante con continui passaggi.
      10. Trasferire la soluzione omogeneizzato in una provetta conica da 50 ml.
      11. Aspirare la soluzione in una siringa da 3 ml con un calibro 18 1 ½ pollice ago e di espellere di nuovo nel tubo conico sul ghiaccio con una calibro 27 ½ ago pollici. Fare attenzione per espellere la soluzione contro la parete interna del tubo da utilizzare quella forza di sconvolgimento membrana cellulare.
      12. Ripetere le fasi siringa per un totale di cinque volte.
      13. Trasferire la soluzione in un tubo da 15 ml e centrifugare per 5 min a 600 xg, a 4 ° C in una centrifuga da tavolo utilizzando un rotore oscillante secchio.
      14. Rimuovere con attenzione il surnatante e distribuire tra tre 1,5 ml provette.
        NOTA: Mitochondria sono nel supernatante dopo questo primo, rotazione a bassa velocità, mentre le membrane cellulari e cellule intatte sono pellettizzati.
      15. Provette per centrifuga in un rotore ad angolo fisso a 10.000 xg, a 4 ° C per 5 min.
      16. Surnatanti Aspirare e combinano il pellet in 100 ml MIB e mettono immediatamente in ghiaccio.
        NOTA: mitocondri sono nel pellet dopo questa rotazione ad alta velocità. I mitocondri in genere a mantenere il loro potenziale di membrana per ~ 2-3 ioni di ghiaccio dopo l'isolamento e sono più stabili come una soluzione madre concentrata in MIB.
    2. I mitocondri isolamento dal tessuto del mouse
      1. Anestetizzare il mouse secondo il protocollo IACUC. Impostare un vaporizzatore al 5,0% per indurre l'anestesia. Confermato che l'animale è anestetizzato da una mancanza di riflessione per pizzico piedi o riflesso corneale quando l'occhio si avvicina o sfruttato con un batuffolo di cotone. Mantenere il mouse sotto anestesia per tutta la procedura chirurgica mantenendo il vaporizzatore tra 1,5% e 2,0%.
      2. Excise il fegato e il midollo spinale di ogni animale e luogo separatamente nel freddo ghiaccio 1x PBS - / - per lavare via il sangue.
      3. Per il fegato, trasferire il tessuto ad un piatto pesare su ghiaccio e tagliare a pezzi sottili usando una lama di rasoio fresco per 1 min.
      4. Aggiungere tessuti e tampone appropriato (MIB per il fegato o SC MIB per il midollo spinale) al recipiente fino buffer raggiunge la prima riga. Omogeneizzare il tessuto con il pestello a mano per cinque passaggi. Assicurarsi che la nave è in ghiaccio durante questa fase, non rimuovere il pestello sopra il liquido e di utilizzare una velocità costante con continui passaggi.
      5. Trasferimento omogenati per pulire 15 ml provette.
      6. Provette per centrifuga in un rotore ad angolo fisso a 750 xg, a 4 ° C per 10 min.
      7. Salvare il surnatante in provette pulite e disporli sul ghiaccio.
        NOTA: mitocondri sono nel supernatante dopo questo primo, rotazione a bassa velocità, mentre le membrane cellulari e cellule intatte sono pellettizzati.
      8. Risospendere il pellet midollo spinale in 500 ml di SC MIB.
      9. Re-omogeneizzare ogni tre volte, riempiendo solo la metà nave con SC MIB questa volta.
      10. Trasferire il nuovo omogeneizzato in una nuova provetta.
      11. Centrifugare la in un rotore ad angolo fisso a 750 xg, a 4 ° C per 10 min.
      12. Combinare questi nuovi surnatanti, che contengono più mitocondri, con il primo supernatante da ogni campione.
      13. Provette per centrifuga in un rotore ad angolo fisso a 10.000 xg, a 4 ° C per 5 min.
      14. Supernatanti Aspirare e risospendere il pellet fegato in 500 ml di MIB e pellet del midollo spinale in 50 microlitri SC MIB e collocare immediatamente su ghiaccio.
        NOTA: mitocondri sono nel pellet dopo questa rotazione ad alta velocità. I mitocondri in genere a mantenere il loro potenziale di membrana per ~ 2-3 ioni di ghiaccio dopo l'isolamento e sono più stabili come una soluzione madre concentrata in MIB.
      15. Effettuare un saggio concentrazione proteica di stimare la concentrazione di mitocondri in soluzione. Seguire istruzionis per l'utilizzo di un kit commerciale Protein Assay o metodo simile 26. Tipici concentrazioni di mitocondri sono: fiasche T175 rendimenti 2 ~ 2 mg / ml, 1 fegato di topo ~ 3-5 mg / ml e 1 midollo spinale di topo ~ 1-3 mg / ml.
  4. Citocromo c test utilizzando un progetto di R & S Rat / Mouse citocromo c Quantikine ELISA Kit (adattato dal protocollo fornito dal produttore).
    1. Immediatamente prima di impostare le reazioni, diluire mitocondri a 0,5 mg / ml concentrazione di lavoro con EB e distribuire mitocondri diluiti in 1,5 ml provette per le reazioni (di solito 30-50 ml di mitocondri per provetta).
    2. Aggiungere sia EB o DMSO, all'1% del volume totale, ai mitocondri diluito e incubare le reazioni sul banco per 7-10 min. Queste reazioni sono stabili per un massimo di 30 minuti a temperatura ambiente, se è necessario un periodo di tempo più lungo.
    3. Mitocondri pellet per centrifugazione in un rotore ad angolo fisso a 10.000 xg, a 4 ° C per 5 min e accurataly separare il surnatante e mettere ciascuno in separata provette da 1,5 ml.
      NOTA: Tubes può o essere congelato a -20 ° C per un'analisi successiva o utilizzato immediatamente.
    4. Determinare rilascio del citocromo c da un confrontando la concentrazione del citocromo c nel pellet e supernatante 27.
      1. Preparare campioni solubilizzando il pellet nel volume originale della reazione con 0,5% Tx-100 in PBS 1x.
      2. Per ogni campione, preparare 2 pozzetti della piastra ELISA, uno per il pellet ora solubilizzato e uno per il supernatante dalla reazione mediante aggiunta di 100 ml di citocromo c coniugato (utilizzare direttamente dalla bottiglia) più 100 ml di 0,5% Tx- 100 in PBS 1x e quindi il campione di pellet o surnatante.
      3. Vortice delicatamente la piastra di un livello basso (livello 2-4) per 20 secondi per mescolare, coprire e incubare per 1 ora, 37 ° C.
      4. Avanti, lavare la piastra quattro volte con tampone di lavaggio diluito secondo il manufacturistruzioni di Er. Rimuovere qualsiasi eccesso di soluzione picchiettando i pozzetti su carta assorbente.
      5. Successivamente, aggiungere 150 ml di 1: 1 A + B soluzione di sviluppo a ciascun pozzetto ed incubare la piastra per 20-30 minuti al buio a temperatura ambiente.
      6. Infine, aggiungere 50 ml di soluzione di stop in tutti i pozzetti e le letture di assorbanza a 540 nm con un lettore di micropiastre. Calcolare la quantità di rilascio del citocromo c confrontando la quantità di citocromo c nel pellet vs supernatante per ogni reazione.

3. Valutazione della funzione mitocondriale (Dys)

  1. Immediatamente prima reazioni sono impostati, diluire mitocondri a 0,5 mg / ml di concentrazione lavorare con EB e poste in provette da 1,5 ml per le reazioni (tipicamente 30-50 ml di mitocondri sono utilizzati per provetta).
  2. Trattamenti mitocondriali
    1. Aggiungere trattamenti appropriati (controllo EB, 1 micron FCCP mescolato con 50 Nm Valinomicina, 10 micron rotenone, 5 mM oligomicina, 2 mM KCN, o 200 mM di ADP, concentrazioni finali) per separare reazioni a 1/10 del volume totale dei mitocondri diluiti. Incubare le reazioni sul banco per 7 min.
      NOTA: Si deve prestare attenzione quando si maneggiano tali sostanze come l'ingestione accidentale o assorbimento attraverso la pelle potrebbe essere dannoso.
    2. Diluire TMRE, ricostituito in acqua sterile alla concentrazione di lavoro di 100 mM e conservati a -20 ° C, a 2 mM e aggiungere un volume pari al volume di reazione mitocondriale.
    3. Incubare le reazioni sul banco per 7 min.
    4. Mitocondri pellet per centrifugazione in un rotore ad angolo fisso a 10.000 xg, a 4 ° C per 5 min.
    5. Carico metà del volume supernatante di ciascun campione su una piastra 396 pozzetti e leggere la fluorescenza.
      NOTA: eccitazione e di emissione di TMRE devono essere ottimizzati in base alle istruzioni del fabbricante, con il volume e la piastra che verrà utilizzato per lail dosaggio. Utilizzando una piastra standard 384 pozzetti nero con 25 ml di 1 micron TMRE (concentrazione di reazione finale) il segnale più forte è stata ottenuta usando lunghezze d'onda di eccitazione / emissione   485 nm / 535 nm.
    6. Calcolare la piega-differenza tra il controllo della fluorescenza (EB) e ogni trattamento dividendo il valore di fluorescenza relativa (RFU) ottenuto dal lettore di piastre per il campione sperimentale dal RFU dal campione di controllo.

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Risultati

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Il trattamento di cellule HEK-293T con 200 pg / ml TNF-α, 40 ng / ml IL1-β, e 75 ng / ml di IFN-γ (* 3) per 24-48 ore porta a quantità progressive di morte cellulare (Figura 1A ). La vitalità cellulare è stata valutata utilizzando test MTT e dimostra costantemente che non vi è ~ 10% di diminuzione della vitalità cellulare al trattamento con 24 ore e ~ 20% di diminuzione con il trattamento 48 ore. Le cellule trattate con concentrazioni simili (100 pg / ml TNF-α, 40 ng / ml IL1-β, e 75 ng / ml IFN-γ) port...

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Discussione

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Il trattamento di cellule HEK-293T con citochine ricombinanti provoca una moderata quantità di morte cellulare oltre 48 ore (Figura 1). La quantità di morte cellulare indotta da TNF-alfa è simile agli studi precedentemente riportati 30 e vitalità cellulare diminuisce dopo la co-somministrazione di molteplici citochine che sono maggiori di quantità sommativi con qualsiasi citochine solo è anche coerente con la letteratura 31,32. La possibilità di modulare gli importi e tipi di tratt...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questa ricerca è stata supportata in parte dalla sovvenzione NSF CHE-1229562 (VDGM), dall'Ufficio di Ricerca Universitaria presso l'Università di Elon, dal Dipartimento di Chimica di Elon e dal Premio Elon Lumen (TL e TAD), dal Programma Fellows dell'Elon College (JAC) e dal Programma d'Onore dell'Elon College (TAD).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Acido L-glutammicoSigmaG1251Può utilizzare invece il sale di potassio.
malicoSigmaM8304Può usare invece il sale di potassio.
KH2PO4SigmaP0662
K2HPO4SigmaP3786
EGTASigmaE3889
Trisma baseSigmaT6066
MOPSSigmaM3183
CCCPSigmaC2920Diluire fino a 100  μ M come stock di lavoro in etanolo e immagazzinare a -20  °C.
ValinomycinSigmaV0627Realizzare in DMSO e utilizzare come 5  μ M stock di lavoro. Negozio a -20  °C.
saccarosioFisherS5-500
KCNMallinckrodt6379Fare una scorta concentrata in etanolo e poi diluire con acqua 
rotenoneSigmaR8875Altamente tossico. Prodotto in etanolo.
oligomicinaSigmaO4876Altamente tossico. Prodotto in etanolo.
ADPSigmaA2754
TMRESigma8717-25mgDiluire 100  μ M stock con EB immediatamente prima dell'uso.
DMEMGibco11965-0841x regolare (glicemia alta).
Pen/StrepInvitrogen15140-155
L-glutamminaFisherSH3002101Conservare aliquote a -20  ° C
FBSLonza14-501Forigine USA, qualità premium. Inattivare a caldo e conservare le aliquote a -20  °C.
Trypsin-EDTASigmaT4049
DMSOSIgmaD2650
Protien Assay Dye (5x)Bio-Rad500-0006Qualsiasi test proteico può sostituirlo.
BSAFisherBP1600-100Produrre 2 mg/ml di brodo in acqua per il dosaggio delle proteine.
MTT polvereSigmaM2128Filtro sterlize 5 mg/ml stock prodotto in PBS. Memorizza le aliquote a -20  ° C; Negozio a 4  ° C per un massimo di 1 settimana.
Soluzione di tergitolo (NP-40)SigmaNP40S
Ricombinante Umano IL-1BGibcoPCH08014Una volta aperto aliquote del negozio a -20  ° C
Gibcoumano ricombinante TNF-alfaPHC3015L
Gibcoumano ricombinante IFN-gammaPHC4031
Dulbeccos PBS (-/-)SigmaD8537Assicurati che sia privo di ioni Mg2+ e Ca2+.
Kit ELISA Cytochrom cR& D systemsDTC0Human per cellule HEK-293T.
acido

Riferimenti

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