Articolo metodologico

Fisiologici Registrazioni e RNA sequenziamento delle appendici gustative del Mosquito febbre gialla Aedes aegypti

DOI:

10.3791/52088

⸱

30 dicembre 2014

 , 
1Agricultural Research Service, Henry A. Wallace Beltsville Agricultural Research Center, Plant Sciences Institute, Invasive Insect Biocontrol and Behavior Laboratory, United States Department of Agriculture

In questo articolo

Sommario

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Utilizzando due metodi per stimare l'espressione genica nei principali appendici gustative di Aedes aegypti, abbiamo individuato il set di geni putativamente sottostanti le risposte neuronali di composti amari e ripugnanti, come determinato da un esame elettrofisiologico.

Abstract

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La registrazione elettrofisiologica dei potenziali d'azione dei neuroni sensoriali delle zanzare fornisce agli investigatori uno sguardo sulla percezione chimica di questi vettori di malattia. Recentemente abbiamo identificato un neurone sensibile amaro nel labello della femmina di Aedes aegypti che risponde al DEET e ad altri repellenti, così come al chinino amaro, attraverso un'indagine elettrofisiologica diretta. Queste risposte dei neuroni del recettore gustativo hanno spinto il sequenziamento dell'mRNA totale da campioni di labelli e tarsi maschili e femminili per chiarire i geni putativi della chemiorecezione espressi in questi tessuti di chemiorecezione da contatto. I campioni di tarsi sono stati divisi in sottotipi pro-, meso- e metatoracici per entrambi i sessi. Abbiamo quindi convalidato il nostro set di dati conducendo qRT-PCR sugli stessi campioni di tessuto e utilizzato metodi statistici per confrontare i risultati tra i due metodi. Gli studi che affrontano la funzione molecolare possono ora mirare a geni specifici per determinare quelli coinvolti nella percezione dei repellenti da parte delle zanzare. Questi percorsi recettoriali possono essere utilizzati per lo screening di nuovi repellenti verso l'interruzione del comportamento di ricerca dell'ospite per frenare la diffusione di virus dannosi.

Introduzione

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Composti come DEET, Picaridin, Citronellale e IR3535 hanno dimostrato di respingere in modo efficace le zanzare, comprese le importanti vettori della malattia Aedes aegypti 1,2. Registriamo potenziali d'azione dei neuroni sensoriali associati a specifici sensilla gustativa per determinare le cellule coinvolte con repellenza zanzare. Accoppiato con sequenziamento valle di geni espressi in questi tessuti, possiamo identificare i geni più probabile che mediano le risposte di queste cellule per lo screening di nuovi composti per le capacità repellenza migliorate.

RNA-Seq è uno strumento potente, diventando rapidamente ....

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Protocollo

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1. allevamento Ae. adulti aegypti

  1. Le uova si schiudono in circa ¾ di pollice in acque poco profonde cassetto. Sovraffollamento ridurrà la dimensione degli adulti.
  2. Larve posteriore a 25 ° C (12-HL: 12-HD) ed alimentare con cibo per pesci a terra.
    NOTA: sovralimentazione può ridurre i tassi di sopravvivenza.
  3. Rimuovere pupe individualmente da pipetta Pasteur quotidiano e trasferimento in piatti di plastica (9 centimetri × 5,5 centimetri) all'interno secchielli di contenimento con fini coperchi maglia, stabilendo così 24 gruppi di età hr.
  4. Mangimi zanzare adulte soluzione al 10% di saccarosio dal batuff....

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Risultati

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Le registrazioni in tracce di potenziali d'azione da Ae. aegypti sensilla gustativa (Figura 1) dimostrare l'efficacia della stimolazione diretta con una gamma di prodotti chimici. Questa tecnica può essere usata per quantificare risposte a qualsiasi sostanza chimica stimolante contando punte di una data ampiezza e durata in un intervallo di tempo ragionevole (generalmente inferiore a 500 ms). Registrazioni Trace devono essere facilmente riproducibili sotto un dato insieme di condizioni sperimen.......

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Discussione

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L'aspetto più impegnativo di potenziali d'azione di registrazione da sensilla gustativa è decidere quali risposte sono "normali". Quando impiegando singolo sensillum gustativa punta registrando la prima volta per una determinata specie di insetti, il numero totale e sensibilità dei neuroni recettori gustativi (GRN) sono probabilmente sconosciuta. Molte registrazioni preliminari vengono prima tenuti a decidere la gamma e le concentrazioni di sostanze chimiche da testare. In questo caso, abbiamo comincia.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Gli autori ringraziano Bryan T. Vinyard dell'USDA, Agricultural Research Service, Henry A. Wallace Beltsville Agricultural Research Center, Biometrical Consulting Service, Beltsville, MD per le analisi statistiche. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da una sovvenzione al J.C.D. dal Programma di Ricerca Deployed War Fighter Protection (DWFP) finanziato dal Dipartimento della Difesa attraverso l'Armed Forces Pest Management Board (AFPMB).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Capillare in vetroA-M Systems628000Standard, 1,5 mm X 0,86 mm, 4"
Filo d'argentoA-M Systems7875.015"
filo di tungstenoAlfa Products3690,127 mm di diametro
Pinze finiStrumenti per la scienza fine11252#5SF Inox
Tavolino refrigeratoBioQuip Products1429Chill
PreamplificatoreSyntechTaste Probepreamplificatore
Software per elettrofisiologiaSoftware SyntechAutospikeper elettrofisiologia
TetraMin cibo per pesci TetraTropical cibo per pesci granulicibo per pesci macinato in polvere fine
TRIzolLife Technologies15596-026Reagente per isolamento RNA
RNeasy Plus Mini KitQiagen74136include l'eliminatore di gDNA e le colonne di spin RNeasy
Spettrofotometro NanodropNano Drop ProductsND-1000spettrometro da tavolo
R statisticsfreeware (creato da Robert Gentleman e Ross Ihaka)www.r-project.orgUsa la funzione lm del pacchetto stats e la funzione equiv.boot del pacchetto di equivalenza nell'ambiente di calcolo R.
rack per provette da 1,5 mlEvergreen240-6388-030Versare l'azoto liquido in alcuni pozzetti vuoti per congelare e macinare i tessuti.
Provette di raccolta da 1,5 ml con pestelloGrainger6HAX6RNase free
CentrifugeThermo Scientific11178160Centrifuga il tessuto congelato per tenerlo sul fondo della provetta da 1,5 ml.
Primer-BLAST Primer Strumento di progettazioneNCBIn/a
nudo da tavolo

Riferimenti

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  1. Klun, J. A., Khrimian, A., Debboun, M. Repellent and deterrent effects of SS220, picaridin, and DEET suppress human blood feeding by Aedes aegypti, Anopheles stephensi, and Phlebotomus papatasi. J. Med. Entomol. 43 (1), 34-39 (2006).
  2. Dickens, J. C., Bohbot, J. D.

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Registrazione dei neuroni gustativiregistrazione elettrofisiologicadissezione dei tessutiisolamento dell RNA totalevalidazione tramite qPCRconteggio dei potenziali d azionegeni della chemoricezionetessuti gustativi

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