Fisiologici Registrazioni e RNA sequenziamento delle appendici gustative del Mosquito febbre gialla Aedes aegypti

Sommario

Utilizzando due metodi per stimare l'espressione genica nei principali appendici gustative di Aedes aegypti, abbiamo individuato il set di geni putativamente sottostanti le risposte neuronali di composti amari e ripugnanti, come determinato da un esame elettrofisiologico.

Abstract

La registrazione elettrofisiologica dei potenziali d'azione dei neuroni sensoriali delle zanzare fornisce agli investigatori uno sguardo sulla percezione chimica di questi vettori di malattia. Recentemente abbiamo identificato un neurone sensibile amaro nel labello della femmina di Aedes aegypti che risponde al DEET e ad altri repellenti, così come al chinino amaro, attraverso un'indagine elettrofisiologica diretta. Queste risposte dei neuroni del recettore gustativo hanno spinto il sequenziamento dell'mRNA totale da campioni di labelli e tarsi maschili e femminili per chiarire i geni putativi della chemiorecezione espressi in questi tessuti di chemiorecezione da contatto. I campioni di tarsi sono stati divisi in sottotipi pro-, meso- e metatoracici per entrambi i sessi. Abbiamo quindi convalidato il nostro set di dati conducendo qRT-PCR sugli stessi campioni di tessuto e utilizzato metodi statistici per confrontare i risultati tra i due metodi. Gli studi che affrontano la funzione molecolare possono ora mirare a geni specifici per determinare quelli coinvolti nella percezione dei repellenti da parte delle zanzare. Questi percorsi recettoriali possono essere utilizzati per lo screening di nuovi repellenti verso l'interruzione del comportamento di ricerca dell'ospite per frenare la diffusione di virus dannosi.

Introduzione

Composti come DEET, Picaridin, Citronellale e IR3535 hanno dimostrato di respingere in modo efficace le zanzare, comprese le importanti vettori della malattia Aedes aegypti ^1,2. Registriamo potenziali d'azione dei neuroni sensoriali associati a specifici sensilla gustativa per determinare le cellule coinvolte con repellenza zanzare. Accoppiato con sequenziamento valle di geni espressi in questi tessuti, possiamo identificare i geni più probabile che mediano le risposte di queste cellule per lo screening di nuovi composti per le capacità repellenza migliorate.

RNA-Seq è uno strumento potente, diventando rapidamente standard per il rilevamento delle modifiche temporali e spaziali in espressione genica. RNA-Seq analisi di appendici chemosensoriali insetti e gli organi sono stati utilizzati per scoprire recettori molecolari in diverse specie di insetti ^3-5, migliorando notevolmente il convenzionale PCR-ricerche gene per gene ^6. Gli insetti rappresentano la classe degli animali più diversi, presentano molte opportunità di studiare la connessione tra geni e fenotipi unici. Tecnologia RNA-seq può essere impiegato su qualsiasi tessuto vivente insetto. Allo stesso modo, la registrazione elettrofisiologica da cellule sensoriali all'interno uniporous sensilli gustativi può essere raggiunto in molte diverse specie di insetti. L'abbinamento di queste due tecniche permette ai ricercatori di restringere i geni coinvolti set in un fenotipo chemosensory osservato. Diverse specie presenteranno sfide specifiche, ma possono informare il collegamento tra i geni dei recettori chemosensoriali e un adattamento chemosensory. Le dimensioni e la morfologia dei chemosensory sensilli è variabile e rendere necessario l'risoluzione dei problemi durante la registrazione di potenziali di azione per ridurre il rumore e identificare segnali ripetibili. Dissezioni di organi chemiosensoriali possono essere banale o delicati e richiede tempo, a seconda della morfologia e dimensioni dell'insetto. Recupero di RNA di alta qualità può richiedere un po 'di risoluzione dei problemi e, come ad esempio evitare alcuni pigmenti durantecollezione tessuti.

Mentre dimostrare gli effetti dei composti repellenti attraverso studi comportamentali è diretta e informativo, questo approccio è tempo intenso e largo rispetto al meccanismo d'azione. Elettrofisiologia accoppiato con RNA-Seq consente analisi più specifiche su ciò che spinge a comportamenti di evitamento insetti. Una volta che il "toolkit" della discriminazione chimico è stato identificato in una specie di insetti, i tentativi più specifiche per migliorare il repellenti conosciute sono possibili. Recettori e proteine ​​associate a cellule sensoriali responsabili di questi comportamenti possono essere espressi heterologously per lo screening chimico diretta. Inoltre, modellistica molecolare in grado di prevedere quali sostanze chimiche si suscitare reazioni forti da questi recettori ^7.

L'istantanea di tutti i geni attivi in ​​una serie limitata di tessuti chemosensoriali può anche essere utile per identificare geni simili in altre specie. Utilizzando omologia di sequenza e di espressione similarities, i ricercatori possono formare gruppi di recettori molecolari più probabile che mediano le risposte a repellenti che sono ampiamente efficaci sugli insetti. Vi presentiamo il seguente protocollo per aiutare i ricercatori a decostruire percorsi chemosensoriali insetti e di convincere di più per approfondire la neuroetologia di non-modello e insetti economicamente importanti.

Protocollo

1. allevamento Ae. adulti aegypti

1. Le uova si schiudono in circa ¾ di pollice in acque poco profonde cassetto. Sovraffollamento ridurrà la dimensione degli adulti.
2. Larve posteriore a 25 ° C (12-HL: 12-HD) ed alimentare con cibo per pesci a terra.
   NOTA: sovralimentazione può ridurre i tassi di sopravvivenza.
3. Rimuovere pupe individualmente da pipetta Pasteur quotidiano e trasferimento in piatti di plastica (9 centimetri × 5,5 centimetri) all'interno secchielli di contenimento con fini coperchi maglia, stabilendo così 24 gruppi di età hr.
4. Mangimi zanzare adulte soluzione al 10% di saccarosio dal batuffolo di cotone collocato sulle pareti schermo di un contenitore gabbia le zanzare in una camera climatica a 27 ° C e 70% di umidità relativa sotto la stessa fotoperiodo come larve.
5. Per elettrofisiologia, utilizzare 5-10 giorno animali vecchi. In generale, gli animali più grandi produrranno risultati migliori. Per l'isolamento di RNA, usare gli animali che si trovano all'interno di un unico 24 ore raggruppamento età nel vecchio campo di 5-10 giorni.

2. Preparazione delle sostanze chimiche

1. Determinare una concentrazione adeguata di elettroliti (ad esempio 1-10 mm) suscita l'attività minima da neuroni sensoriali selezionati. 10 mM NaCl o 1mm KCl sono elettroliti ragionevoli per testare l'attività di base quando si inizia un esperimento.
2. Sciogliere ogni chimica sperimentale nel solvente appropriato (se non l'acqua, usare etanolo o DMSO) che ha poco o nessun effetto sulla attività picco rispetto all'elettrolito sola. Le concentrazioni finali di 10% etanolo o 1% DMSO sono concentrazioni iniziali ragionevoli.
3. Selezionare appropriata (ad esempio il chinino per amaro o di saccarosio per dolci) i prodotti chimici di controllo che sono ben descritti, deterrenti alimentazione o stimolanti negli insetti.

3. Elettrofisiologia (registrazione punta ^8; Figura 1)

1. Elettrodi di vetro Form tirando meccanicamente capillari di vetro. Ottimizzare il calore e tirare le impostazioni di tirare vetro per formare recordi opportunamente sagomataElettrodi ng. Rompere con cautela fine del elettrodo di vetro con pinze sotto un microscopio da dissezione per creare elettrodo punta apertura che è sufficientemente ampia per busta bersaglio sensillum, ma abbastanza piccolo per evitare il contatto con le strutture vicine.
2. Al microscopio, identificare visivamente dalla morfologia e posizionare il target sensilla / sensillum per garantire la ripetibilità della registrazione punta. Animali Prep per consentire l'accesso gratuito al sensilla dall'angolo di entrata dell'elettrodo.
3. Freddo insetti anestetizzare adulti in freezer a -20 ° C. Evitare danni ai neuroni periferici da sovraesposizione a temperature fredde. Tagliare sottili strisce di nastro adesivo con lama di rasoio sul vetrino. Immobilizzare intero insetto su un vetrino con strisce strette.
4. Inserire un filo di tungsteno affilata chimicamente nel torace dorsale o occhio per servire come indifferente (terra) dell'elettrodo.
5. Riempire elettrodo vetro fatto a passo 3,1 con una soluzione stimolante di interesse. Utilizzando una siringa inserita, compilare capIllary dalla fine tirato a Blunt fine. Rovesciare tutte le bolle d'aria, tenendo fine abbattuto. Inserire un filo d'argento (chloriding opzionale) nell'elettrodo di vetro fatto a passo 3.1 per servire come elettrodo di registrazione e stimolante.
6. Collegare gli elettrodi ad un preamplificatore che è stato progettato per registrazioni da contatto chemoreceptive sensilli negli insetti. Questo preamplificatore (300 Hz-3 kHz filtro passa-banda) ridurrà il tempo di assestamento di catturare l'attività neuronale più vicino allo stimolo introduzione possibile. Raccogliere, archiviare e analizzare i segnali elettrici con un microcomputer dotato di software di registrazione picco.
   NOTA: Messa a terra del sistema di registrazione correttamente può migliorare drasticamente il rapporto segnale-rumore.
7. Stimolare sensilla con una soluzione di controllo (solo elettrolita) per garantire la funzionalità. Conte picchi a partire 200 msec seguito l'artefatto stimolo per tutte le preparazioni.
8. Casuale l'ordine di sostanze chimiche di prova per tutti gli esperimenti, tranne studi dose-risposta,per eliminare pregiudizi. Per gli studi dose-risposta, esporre sensilla ad aumentare concentrazioni della sostanza chimica sperimentale. Lasciare un minimo di 3 minuti tra stimoli al fine di garantire un adeguato recupero.
   NOTA: Questo requisito può variare a seconda degli insetti e sensilli. Soglia è definita come quella concentrazione per cui errore standard non si sovrappone con l'errore standard per la concentrazione più bassa testata.

4. RNA Isolamento e Sequencing (Figura 2)

1. Preparare i pestelli RNasi-free ermetici da loro raffreddamento in ghiaccio secco prima di tessuto disruption.Prepare accompagnano pestelli RNasi-free che si adattano provette con tappo a scatto saldamente. Tenere tubi di raccolta chiusi a meno dissezione attivamente per evitare eccessiva formazione di condensa.
2. Utilizzando aspiratore filtrato, mettere da 30 a 40 le zanzare-anestetizzato freddo (15 sec in -20 ° C freezer) sul palco freddo e mostra per il sesso. Luogo animali dorsale lato negativo, afferrare le ali per non danneggiare appendici gusto.
3. Utilizzando due coppie di pinza sottile, sezionare Paired Labella o tarsi da maschi o femmine sotto un microscopio da dissezione e limitare l'inserimento di tessuti adiacenti.
   NOTA: 500 Labella accoppiato produce circa 800-1000 nanogrammi di mRNA totale. 400 tarsi individuale (5 segmenti ciascuno) produrranno 1,200-1,800 nanogrammi di mRNA totale.
4. Con un paio di Ansimare-pinze, leggermente cogliere proboscide zanzara solo prossimali di Labella esporre mandrini interni. Utilizzando altra coppia di raccolta-pinze, rimuovere Labella e aggiungere tessuto lato del tubo di raccolta a freddo.
5. Con un paio di pinze, leggermente cogliere gamba zanzare allo svincolo di tibia e primo segmento tarsale. Utilizzando altra coppia di pinze, rimuovere tarsi e aggiungere tessuto lato del tubo di raccolta a freddo.
   NOTA: Prendere in considerazione i tipi di cellule a livello di interfaccia del tessuto desiderato e indesiderati. Mentre è importante limitare l'inclusione di tessuto limitrofo, è altrettanto importante non omettere porzioni di tessuto desiderato. Il ficampione finale deve rappresentare accuratamente l'intero organo di interesse. Creare un confine preciso con le pinze di presa in modo tale che una pinza di raccolta possono liberare proprio raschiando o afferrare solo il tessuto desiderato.
6. Periodicamente, spin down tubo di raccolta brevemente 0 ° C centrifugare a 9.000 xg per mantenere il tessuto sul fondo della provetta. Se l'umidità si accumula nei tubi di raccolta durante la dissezione, aggiungere 50ul di freddo reagente Trizol per coprire il tessuto raccolti.
7. Utilizzando anti-macchia marcatore laboratorio, etichetta chiaramente uno senza RNase 1,5 ml schiocco provetta con tappo per ogni tipo di tessuto per la raccolta. Usando 1,5 ml provetta rack e azoto liquido, congelare poi macinare tessuto in polvere fine (pezzi pregiati se in Trizol). Ripetere una volta. Portare il volume totale di Trizol a 1 ml e sospendere nuovamente il tessuto terra nel vortex.
8. Aggiungere 200 ul di cloroformio e mescolare accuratamente. Dopo 5 min a temperatura ambiente, centrifugare a centrifugare a 4 ° C e 11.000 xg per 15 min. Attentamenteaggiungere strato acquoso direttamente ad una colonna filtro DNA genomico. Spin down a 11.000 x g per 5 min. Aggiungere uguale volume di RNase-free etanolo al 70% a flusso continuo e mescolare pipetta. Trasferire il liquido a una colonna collezione RNA e continuare l'estrazione di RNA secondo le istruzioni fornite.
9. Quantificare e valutare la purezza di RNA totale su uno spettrofotometro di precisione e procedere con qualsiasi metodo di sequenziamento RNA standard.

5. quantitativa RT-PCR convalida di RNA Sequencing (Figura 3)

1. Selezionare come molti geni come possibile confrontare i livelli di espressione genica relativi su una gamma dinamica, sia in previsto abbondanza sequenza e la funzione del gene chemosensory presunta.
2. Coppie di progettazione di primer per ogni gene target per amplificare uno specifico prodotto della PCR 100-180 paio di basi. Escludi non specifico di amplificazione gDNA garantendo almeno un fondo per set estende un confine introne. In alternativa, utilizzare il trattamento DNasi per ridurre la contaminazione genomico.
3. Raccoglieretessuto insetto come descritto nel paragrafo precedente. Calcolare la quantità di tessuto è necessario per fornire abbastanza RNA per completare tutte le reazioni qRT-PCR.
   NOTA: triplice copia biologica e reazioni triplicate tecnici forniranno la massima fiducia nei risultati.
4. Calcola relativa quantificazione gene come X _bersaglio ^{- (Ct [destinazione] -Ct [riferimento])} per ogni gene target e media per ogni replica, sia biologico e tecnico. Utilizzare gene housekeeping (s) per normalizzare valori Ct tra i replicati biologici e di sradicare la scala Y in confronto di espressione relativa.
5. Valutare la somiglianza di RNA-Seq e dataset qRT-PCR usando la procedura di equivalenza bootstrap basato ^{regressione-9,} in modo iterativo applicato, per i dati di ogni tessuto.
   NOTA: Questa procedura identifica la più piccola "regione di somiglianza" che può essere costruito intorno alla dati RNA-Seq e qRT-PCR osservata, e consentire l'espressione genica relativa come misurato da qRT-PCR da considerare statisticamente equivalente alla misurazione dell'espressione genica relativa da RNA-seq.

Risultati

Le registrazioni in tracce di potenziali d'azione da Ae. aegypti sensilla gustativa (Figura 1) dimostrare l'efficacia della stimolazione diretta con una gamma di prodotti chimici. Questa tecnica può essere usata per quantificare risposte a qualsiasi sostanza chimica stimolante contando punte di una data ampiezza e durata in un intervallo di tempo ragionevole (generalmente inferiore a 500 ms). Registrazioni Trace devono essere facilmente riproducibili sotto un dato insieme di condizioni sperimen...

Discussione

L'aspetto più impegnativo di potenziali d'azione di registrazione da sensilla gustativa è decidere quali risposte sono "normali". Quando impiegando singolo sensillum gustativa punta registrando la prima volta per una determinata specie di insetti, il numero totale e sensibilità dei neuroni recettori gustativi (GRN) sono probabilmente sconosciuta. Molte registrazioni preliminari vengono prima tenuti a decidere la gamma e le concentrazioni di sostanze chimiche da testare. In questo caso, abbiamo comincia...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Capillare in vetro	A-M Systems	628000	Standard, 1,5 mm X 0,86 mm, 4"
Filo d'argento	A-M Systems	7875.015	"
filo di tungsteno	Alfa Products	369	0,127 mm di diametro
Pinze fini	Strumenti per la scienza fine	11252	#5SF Inox
Tavolino refrigerato	BioQuip Products	1429	Chill
Preamplificatore	Syntech	Taste Probe	preamplificatore
Software per elettrofisiologia	Software Syntech	Autospike	per elettrofisiologia
TetraMin cibo per pesci Tetra		Tropical cibo per pesci granuli	cibo per pesci macinato in polvere fine
TRIzol	Life Technologies	15596-026	Reagente per isolamento RNA
RNeasy Plus Mini Kit	Qiagen	74136	include l'eliminatore di gDNA e le colonne di spin RNeasy
Spettrofotometro Nanodrop	Nano Drop Products	ND-1000	spettrometro da tavolo
R statistics	freeware (creato da Robert Gentleman e Ross Ihaka)	www.r-project.org	Usa la funzione lm del pacchetto stats e la funzione equiv.boot del pacchetto di equivalenza nell'ambiente di calcolo R.
rack per provette da 1,5 ml	Evergreen	240-6388-030	Versare l'azoto liquido in alcuni pozzetti vuoti per congelare e macinare i tessuti.
Provette di raccolta da 1,5 ml con pestello	Grainger	6HAX6	RNase free
Centrifuge	Thermo Scientific	11178160	Centrifuga il tessuto congelato per tenerlo sul fondo della provetta da 1,5 ml.
Primer-BLAST Primer Strumento di progettazione	NCBI	n/a