Approfittando di ridotta interazione Droplet-superficie per ottimizzare il trasporto di Bioanalytes in microfluidica digitale

Sommario

Viene descritto il protocollo per la fabbricazione e il funzionamento dei dispositivi di deumidificazione sul campo (Field-DW), così come gli studi preliminari sugli effetti dei campi elettrici sul contenuto delle goccioline.

Abstract

La microfluidica digitale (DMF), una tecnica per la manipolazione delle goccioline, è un'alternativa promettente per lo sviluppo di piattaforme "lab-on-a-chip". Spesso, il movimento delle goccioline si basa sulla bagnatura di una superficie, direttamente associata all'applicazione di un campo elettrico; Le interazioni superficiali, tuttavia, rendono il movimento dipendente dal contenuto di goccioline, limitando l'ampiezza delle applicazioni della tecnica.

Sono state presentate alcune alternative per ridurre al minimo questa dipendenza. Tuttavia, si basano sull'aggiunta di specie chimiche extra alla gocciolina o all'ambiente circostante, che potrebbero potenzialmente interagire con le porzioni di goccioline. Per affrontare questa sfida, il nostro gruppo ha recentemente sviluppato dispositivi Field-DW per consentire il trasporto di cellule e proteine nel DMF, senza additivi aggiuntivi.

Qui, viene fornito il protocollo per la fabbricazione e il funzionamento del dispositivo, inclusa l'interfaccia elettronica per il controllo del movimento. Continuiamo anche gli studi con i dispositivi, dimostrando che possono essere trasportati anche organismi modello multicellulari, relativamente grandi, probabilmente non influenzati dai campi elettrici necessari per il funzionamento del dispositivo.

Introduzione

La miniaturizzazione dei dispositivi che funzionano con i liquidi è di fondamentale importanza per lo sviluppo di piattaforme "lab-on-a-chip". In questo senso, gli ultimi due decenni hanno visto un significativo progresso nel campo della microfluidica, con una varietà di applicazioni. ^1-5 contrasto con il trasporto di liquido nei canali chiusi (microfluidica canale), DMF manipola goccioline su array di elettrodi. Uno dei meriti più interessanti di questa tecnica è l'assenza di parti mobili per il trasporto di fluidi, e il movimento è immediatamente fermato spegnendo segnali elettrici.

Tuttavia, il movimento delle gocce dipende contenuti gocciolina, certamente una caratteristica indesiderabile per una piattaforma universale "lab-on-a-chip". Goccioline contenenti proteine ​​e altri analiti aderire alle superfici dei dispositivi, diventando inamovibile. Probabilmente, questo è stato il limite maggiore per ampliare la gamma di applicazioni DMF; ^6-8alternative per ridurre al minimo la formazione di incrostazioni di superficie indesiderato comportano l'aggiunta di specie chimiche in più per la goccia o dei suoi dintorni, che potrebbe potenzialmente influenzare il contenuto delle gocce.

In precedenza, il nostro gruppo ha sviluppato un dispositivo per consentire il trasporto di cellule e proteine ​​in DMF, senza additivi aggiunti (dispositivi di campo-DW). ⁹ Ciò è stato ottenuto combinando una superficie basata sulla candela fuliggine, ¹⁰ con una geometria dispositivo che favorisce goccia di rotolamento e conduce ad una forza verso l'alto sul droplet, diminuendo ulteriormente l'interazione gocciolina superficie. In questo approccio, il movimento gocciolina non è associato con bagnatura superficiale. ¹¹

L'obiettivo del metodo dettagliato di seguito descritto è quello di realizzare un dispositivo DMF in grado di trasportare goccioline contenenti proteine, cellule e interi organismi, senza additivi supplementari. I dispositivi di campo-DW aprono la strada per le piattaforme interamente controllate di lavoro in gran parte indipendentemente goccia chimicory.

Qui, anche simulazioni presenti mostrando che, nonostante l'alta tensione necessaria per il funzionamento del dispositivo, la caduta di tensione attraverso la goccia è una piccola frazione della tensione applicata, indicando effetti trascurabili sulla bioanalytes all'interno della gocciolina. Infatti, prove preliminari con Caenorhabditis elegans (C. elegans), un nematode utilizzato per una varietà di studi in biologia, mostrano che i vermi nuotano indisturbati come vengono applicate tensioni.

Protocollo

NOTA: Nelle procedure descritte di seguito, le linee guida di sicurezza di laboratorio devono essere sempre seguite. Di particolare importanza è la sicurezza quando si tratta di alta tensione (> 500 V) e prodotti chimici di trattamento.

1. Rivestimento di un substrato conduttivo con la candela fuliggine

1. Taglio di metallo in rame in rettangoli (75 x 43 mm, spessore di 0,5 mm). Pulire ogni substrato di rame per immersione in mordenzante di rame per circa 30 secondi, lavare con acqua corrente per circa 20 secondi, e asciugare con carta.
   NOTA: Se si utilizza il metodo 1 di seguito, cambiare le dimensioni di 75 x 25 mm per adattarsi alla macchina.
2. Sweep una candela di paraffina candela sotto il substrato di rame per 30-45 secondi, per ottenere un rivestimento di fuliggine approssimativamente uniforme (spessore di circa 40 micron). Mantenere il substrato ~ 1 cm all'interno della fiamma. Non toccare la superficie di fuliggine fragile.

2. Proteggere lo strato di fuliggine con rivestimento

NOTA: Lo strato di fuliggine è molto fragileE deve essere ricoperta per protezione. Due alternative semplici (metodi 1 e 2 di seguito) sono suggeriti qui, ma i protocolli più robusti sono attualmente in fase di sviluppo.

1. Metodo 1
   1. Caricare il campione nell'evaporatore metallo o sistema di sputtering. Seguendo le procedure di funzionamento del sistema, evacuare la camera, e inizia la deposizione controllata di oro sullo strato di fuliggine (150-200 nm). Lasciare raffreddare l'apparecchio a temperatura ambiente.
   2. Dip-coat substrato metallizzato in una soluzione di 1-dodecantiolo (1% v / v, in etanolo al 95%, ACS / USP grado), per 10 min all'interno di una cappa chimica. Quindi, tenendo il dispositivo ad un angolo vicino a 60 °, lavare delicatamente la superficie con diverse gocce di solo etanolo. Lasciate che i dispositivi a secco, durante la notte.
2. Metodo 2
   1. In una cappa chimica, subito dopo il rivestimento del substrato di fuliggine e mentre il substrato è ancora calda della fiamma candela, versare alcune gocce di liquido fluorurato su un lato dellasubstrato, e inclinare il substrato ad un angolo di circa 90 °. Deposita più gocce, e far rotolare su tutta la superficie di fuliggine.
      NOTA: Quando la goccia cade su un punto, la fuliggine verrà spazzato via da quella zona. Lasciare le goccioline di liquido fluorurato diffusione il più possibile.
   2. Cuocere il substrato su una piastra calda (160 ° C per 15 min) all'interno di una cappa chimica.
   3. Lasciate che il substrato sedersi durante la notte a temperatura ambiente prima dell'uso. Conservare a tempo indeterminato.

3. Realizzazione di Top elettrodi (adattato da Abdelgawad et al. ¹²⁾

1. Disegnare gli elettrodi che utilizzano software di progettazione grafica. Ciascun elettrodo è lungo 2 mm di larghezza 0,3 mm, e la distanza tra gli elettrodi è di 0,3 mm. Il divario tra i contatti (a scatto nel connettore, vedi sotto) è di 2,3 mm (figura 1).
2. Tagliare un laminato di rame flessibile (35 micron di spessore) nel formato di Monarch (3,87 x 7,5 pollici). Utilizzare altre dimensioni if compatibile con la stampante. Caricare il laminato nel vassoio di alimentazione manuale di una stampante a colori.
3. Assicurarsi di utilizzare "nero ricco", o "Registrazione nero", quando si stampa su foglio di rame (vedi Abdelgawad et al. ¹² per i dettagli) per consentire uno strato più denso di inchiostro nero sul supporto di rame, proteggendo il motivo stampato durante l'incisione . Lasciate che il supporto stampato asciugare completamente, durante la notte.
4. All'interno di una cappa chimica, riscaldamento (40 ° C) un becher con 50 ml di mordenzante rame. Immergere il laminato stampato nel bicchiere, e agitare delicatamente nella soluzione per circa 10 min. Tempo di attacco dipende dalla soluzione mordenzante rame. Ogni pochi minuti, controllare la corrosione e vedere se il modello è intatto.
5. Lavare accuratamente il laminato con acqua e rimuovere il rivestimento con acetone ed etanolo nella cappa chimica. Lavare, ancora una volta, e asciugare delicatamente il laminato con il tovagliolo di carta.
6. Fissare accuratamente il laminato con elettrodi ad un glass slitta (75 x 25 mm, spessore di ~ 1 mm), con nastro biadesivo. Evitare di sacche d'aria.
7. Attaccare un film di perfluoroalkoxy PFA agli elettrodi con i nastri. Questo serve per evitare contatti accidentali degli elettrodi con la goccia, che danneggia migliori elettrodi a causa di corto circuito.

4. L'interfaccia elettronica (circuito in figura 2)

1. Saldare i relè ed i condensatori C a un circuito universale.
2. Montare il resto dei 10 comandi dei relè di una breadboard per i circuiti elettronici.
3. Filo di ingresso ogni driver di relè a un canale nella scheda di controllo.
4. Scatto con attenzione i primi elettrodi in un connettore (Figura 3). Filo uscita ogni driver del relè ad un elettrodo superiore, come mostrato in figura. Si noti che esiste un connettore contatto a terra tra una coppia di fili dal relè, per minimizzare il rumore elettrico.
   NOTA: Il connettore si siede su una piattaforma regolabile per controllare tha distanza (0,1-0,5 mm) tra superiore e inferiore (fuliggine rivestito) substrato.
5. Utilizzare un programma per controllare la temporizzazione per alta tensione (HV) applicazione (circa 0,8 sec) a 4 elettrodi contemporaneamente, spostando 1 elettrodo nella direzione del moto (cioè per 0,8 secondi, azionare 1234, poi 2345, 3456, ecc ., 0.8 sec per ciascun gruppo, e poi indietro, si muove in modo gocciolina nella direzione opposta pure).

5. Visualizzazione Droplet e Manipolazione

1. Per registrare il movimento gocciolina, utilizzare il sistema di visualizzazione, che si compone di un 24X - assemblaggio ingrandimento 96X combinato con una telecamera CCD. Collegare il videoregistratore alla fotocamera tramite S-video.
2. Pipettare una goccia 4 ml contenente C. elegans nel supporto sul fondo del substrato fuliggine rivestito.
3. Portare i primi elettrodi a ca 0.3 mm sopra la goccia. La gocciolina dovrebbe essere vicino al centro, proprio sotto il quinto elettrodi, per facilitare le operazioni.
4. Accendere l'interfaccia elettronica e alta tensione (500 V _RMS) e regolare la distanza elettrodo superiore alla goccia finché inizia a muoversi. Non lasciate che i primi elettrodi toccano la goccia.
5. Raccogliere dati registrando il numero di trasferimenti gocciolina successo sul dispositivo in risposta agli impulsi elettrici. Un esperimento di successo è caratterizzata da almeno 700 trasferimenti goccioline, cioè, un trasferimento dopo ogni impulso elettrico.
6. Raccogliere dati continuo, fino alla gocciolina non si muove più in risposta a 5 a 10 impulsi.
   NOTA: Quando la superficie comincia a degradare, il movimento potrebbe essere ripristinato portando i primi elettrodi più vicino alla goccia.

Risultati

In precedenza, abbiamo utilizzato i dispositivi di campo-DW per consentire il movimento delle proteine ​​in DMF. In particolare, goccioline con albumina di siero bovino (BSA) possono essere spostati ad una concentrazione di 2000 volte superiore a quanto precedentemente riportato da altri autori (senza additivi). Ciò è dovuto alla ridotta interazione tra la goccia e la superficie; la figura 4 mostra una gocciolina contenente fluorescente-tag BSA (vedi Freire et al ⁹ per ulteriori info...

Discussione

La fase più critica del protocollo è la protezione dello strato di fuliggine, direttamente associata con il successo in goccioline movimento. Metallizzazione lo strato di fuliggine (precedenti metodi 1) permette di quasi il 100% di successo fabbricazione. Tuttavia, il tempo massimo di funzionamento è di circa 10 minuti; eventualmente, le frazioni delle gocce sono bagnare la fuliggine attraverso buchi nello strato di metallo. Rivestimento lo strato di fuliggine con il liquido fluorurato è l'alternativa più semplice e...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Candela di paraffina			Qualsiasi candela di paraffina
Sistema di sputtering	Denton Vacuum, Moorestown, NJ		Sputter coater Desk V HP dotato di un bersaglio Au.
1-dodecanetiolo	Sigma-Aldrich	471364
Teflon	Dupont	AF-1600
Fluorinert FC-40	Sigma-Aldrich	F9755	Liquido fluorurato: Preparare la resina Teflon-AF in Fluorinert FC-40, 1:100 (p/l), per creare il rivestimento idrofobo.
Software di progettazione grafica -Adobe Illustrator	Adobe Systems		Potrebbero essere utilizzati anche altri software.
Laminato di rame	Stampante laser Dupont	LF9110
	Xerox	Phaser 6360 o simile	Verificare la compatibilità con "nero ricco" o "nero di registrazione" (vedere il testo).
Copper Etchant	Transene	CE-100
Film Perfluoroalcossi (PFA)	McMaster-Carr	84955K22
Breadboard	Allied Electronics	70012450 o simile	Abbastanza grande da consentire l'assemblaggio di 10 driver.
Scheda a circuito universale	Allied Electronics	70219535 o simile
	Connettore Allied Electronics	5145154-8 o simile
Scheda di controllo e programma di controllo (software LabView)	National Instruments	NI-6229 o simile
Amplificatore ad alta tensione	Trek	PZD700
Condensatori C e C1, 100 nF, 60 V	Allied
Transistor T, NPN	Allied
9350289 diodo D, 1N4007	Allied
Relè	Alleati
Sistema di visualizzazione	Edmund Optics	VZM 200i o simile	Sistema di ingrandimento 24X – 96X. È combinato con una telecamera a colori CCD Hitachi KP-D20B da 1/2 pollice.
Registratore	Sony	GV-D1000 NTSC o simile	È collegato alla fotocamera tramite un cavo S-video.
Simulazioni	COMSOL Multiphysics	V. 4.4