In vivo e in vitro Allevamento di Nematodi entomopatogeni (Steinernematidae e Heterorhabditidae)

Summary

L'obiettivo di questa presentazione è quello di dimostrare in vivo e in vitro tecniche per l'allevamento di nematodi entomopatogeni. Metodi in vivo considerano l'allevamento di questi nematodi con un host insetto, mentre i metodi in vitro utilizzano rich media agar.

Abstract

Nematodi entomopatogeni (EPN) (Steinernematidae e Heterorhabditidae) hanno una partnership mutualistico con Gram-negativi Gamma-Proteobacteria della famiglia Enterobacteriaceae batteri. Xenorhabdus sono associati con steinernematids nematodi, mentre Photorhabdus sono simbionti di heterorhabditids. Insieme nematodi e batteri formano un complesso potente insetticida che uccide una vasta gamma di specie di insetti in una intima e specifico. Qui, dimostriamo in vivo e in vitro tecniche comunemente utilizzate nell'allevamento di questi nematodi in condizioni di laboratorio. Inoltre, queste tecniche rappresentano passaggi fondamentali per la creazione di successo di culture EPN e costituiscono anche la base per altri test biologici che utilizzano questi organismi per la ricerca. La produzione di aposymbiotic nematodi (senza simbionti) è spesso fondamentale per un approfondito e approccio multiforme allo studio della simbiosi. Questoprotocollo non richiede l'aggiunta di antibiotici e può essere realizzato in un breve lasso di tempo con attrezzature di laboratorio standard. Nematodi prodotti in questo modo sono relativamente robusti, anche se la loro sopravvivenza in deposito possono variare a seconda delle specie utilizzate. Le tecniche descritti in questa presentazione corrispondono a quelli descritti da vari autori e raffinato dal Laboratorio di P. Archivio, University of Arizona (Tucson, AZ, USA). Queste tecniche sono distinti dal corpo di tecniche che vengono utilizzati nella produzione di massa di tali organismi a fini di gestione nocivo.

Introduction

Nematodi entomopatogeni (EPN) Steinernema e Heterorhabditis spp. (Steinernematidae, Heterorhabditidae) e dei loro simbionti batterici, Xenorhabdus e Photorhabdus spp (Enterobacteriaceae) sono considerati un modello emergente di animali terrestri-microbici relazioni simbiotiche ^2-4,6,10,19. Xenorhabdus e Photorhabdus spp. sono nutrito come simbionti nell'intestino della sola fase di vita libera dei nematodi, noto anche come il giovanile infettiva (IJ) o stadio 3 ^° infettivo giovanile ^8,10,13. La coppia batterio-nematode è patogeno per una vasta gamma di insetti ed è stato implem....

Protocol

1 In vivo Allevamento di Nematodi entomopatogeni con i loro batteri Symboitic

1. Invertire una capsula di Petri in plastica 100 x 15 mm e collocare due dischi di carta da filtro (90 mm) nel coperchio del piatto.
2. Distribuire uniformemente 1 ml della sospensione acqua IJ (larve infettive) (ad una concentrazione di 1.000-2.000 IJ / ml) sulla carta da filtro.
   NOTA: IJs non devono essere sterilizzati in superficie.
3. Aggiungere 10 ultimo instar larve della maggior waxmoth Galleria mellonella al piatto. L'obiettivo è quello di fornire circa 100-200 IJs / larva.
4. Coprire il coperchio con la parte inferiore dell....

Results

Il metodo di allevamento in vivo utilizza insetti vivi come host per la crescita e la riproduzione dei nematodi. Camere di infezione sono un metodo efficiente per esporre insetti IJs. Questa è l'unica fase del ciclo di vita dei nematodi 'che i vettori simbionti batterici da un insetto host all'altro. Figura 1 mostra il set up per una camera un'infezione così come i materiali necessari per costruire questa camera. In vitro metodi di allevamento consentono EPN a crescere senza un host in.......

Discussion

Utilizzando un ospite adatto è un fattore chiave per il successo in allevamento vivo di EPN. Di solito, sia steinernematids e heterorhabditids possono riprodursi e completare il loro ciclo di vita in larve della maggiore tarma della cera, Galleria mellonella (Lepidoptera: Pyralidae). Tuttavia, altre specie di insetti provenienti da diverse famiglie e / o gli ordini possono essere considerati. Alcune delle specie di nematodi attualmente descritte sono noti per avere specificità per un particola.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
For In vivo Infezioni
100 x 15 piastre di Petri	VWR	25384-088
Carta da filtro, 9 cm di cellulosa grado 1	Whatman/VWR	28450-081	Carta da filtro di grado 1 consigliata
Ospiti per insetti	Timberline	http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG	Galleria mellonella sono recommended
Per agar fegato-rene (per 500 ml)
60 x 15 mm Piastre di Petri	VWR	25384-092
Fegato di manzo, 50 g	Di provenienza locale; macelleria o supermercato		Gli avanzi possono essere conservati congelati e scongelati per un uso futuro
Rene di manzo, 50 g	Di provenienza locale; macelleria o supermercato		Gli avanzi possono essere conservati congelati e scongelati per un uso futuro
Cloruro di sodio 2,5 g (0,5% concentrazione finale)	Acros/VWR	200002-434	qualsiasi grado di ricerca NaCl può essere utilizzato
Agar, 7,5 g (1,5% agar, concentrazione finale)	HiMedia/VWR	95026-642	qualsiasi grado di terreno agar può essere utilizzato
500 ml distillato H2O
Per agar lipidico (per 1 L)
100 x 15 piastre di Petri	VWR	25384-088
Brodo nutriente, 8 g	BD/VWR	90002-660
Estratto di lievito, 5 g	EMD/VWR	EM1.03753.0500
Cloruro di magnesio esaidrato 10 ml (0,2 g/ml)	EMD/VWR	EM-MX0045-1
Olio di mais, 4 ml	Qualsiasi marca	Provenienza locale; supermercato	È possibile utilizzare
qualsiasi marca di olio di maisSciroppo di mais, 96 ml combinare 7 ml di sciroppo di mais in 89 ml di H2O riscaldato e agitare per omogeneità	Karo	Di provenienza locale; agar del supermercato
, 15 g	HiMedia/VWR	95026-642	può essere utilizzato qualsiasi agar di grado Media
H2O, 890 ml