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Articolo metodologico

Large-Scale Purificazione di suino o bovino fotorecettore Outer Segmenti per fagocitosi saggi su cellule retiniche dell'epitelio pigmentato

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⸱

DOI:

10.3791/52100

⸱

12 dicembre 2014

 ,  ,  ,  , 
1INSERM, U968, 2Sorbonne Universités, UPMC Paris 06, UMR_S 968, Institut de la Vision, 3CNRS, UMR_7210, 4Department of Biological Sciences, Center for Cancer, Genetic Diseases and Gene Regulation, Fordham University

In questo articolo

Sommario

Questo articolo descrive il protocollo per la purificazione di frammenti del segmento esterno del fotorecettore (POS) tramite ultracentrifugazione da retine suine/bovine utilizzando l'omogeneizzazione e la centrifugazione in gradiente di saccarosio. Questo protocollo consente la preparazione di grandi scorte di aliquote POS, etichettate o non etichettate, che possono poi essere conservate a -80 °C.

Abstract

Analisi di una delle funzioni vitali epiteliale pigmentato retinico (RPE) cellule, la fagocitosi delle passate età frammenti distali dei segmenti esterni fotorecettori (POS) può essere eseguita in vitro. Fotorecettore segmenti esterni con pile di dischi membranose contenenti la macchina phototransduction vengono continuamente rinnovati nella retina. POS esausti vengono eliminati tutti i giorni dalle cellule RPE. Roditore, suina / bovini e cellule RPE umani riconoscono POS da varie specie in un modo simile. Per facilitare l'esecuzione di grandi serie di esperimenti con poca variabilità, un grande magazzino di POS può essere isolato da occhi suini e conservato congelato in aliquote. Questo protocollo sfrutta la caratteristica di fotopigmenti che visualizzano un colore arancione quando tenuti all'oscuro. Sotto fioca luce rossa, retine sono raccolti in un buffer da paraocchi aperte tagliate a metà. La sospensione cellulare retina viene omogeneizzata, filtrata e caricato su un gradiente di saccarosio continuo. Dopo centrifugation, POS sono situati in una banda discreta nella parte superiore della sfumatura che ha un caratteristico colore arancione. POS vengono poi raccolti, filato, risospese in sequenza in tamponi di lavaggio, contati e aliquotati. POS ottenute in questo modo possono essere utilizzati per saggi di fagocitosi ed analisi di attivazione della proteina, localizzazione o interazione in vari momenti dopo sfida POS. In alternativa, POS può essere etichettato con fluorofori, e. G., FITC, prima che si dispensa per la successiva quantificazione di fluorescenza di POS vincolanti o engulfment. Altre possibili applicazioni includono l'uso di modificato POS o POS sfida combinato con condizioni di stress per studiare l'effetto dello stress ossidativo o invecchiamento sulle cellule RPE.

Introduzione

Nella retina, la visione viene attivato per isomerizzazione di molecole fotosensibili denominate opsine, prima di essere trasformato in un segnale che può essere trasmesso tra i neuroni fino alle aree visive del cervello. Queste molecole sono incorporati in pile di dischi membranose simili a frittelle che costituiscono le porzioni segmento esterno dei fotorecettori (PRS). Essere sottoposti a costante esposizione alla luce e quindi notevoli livelli di stress ossidativo, PR continuamente rinnovare i loro segmenti esterni per limitare il potenziale danno ossidativo. Segmenti esterni dei fotorecettori sono in stretto contatto con microvilli apicale delle retina epiteliali del pigmento (RPE) cellule vicine. Cellule RPE costituiscono la parte esterna della barriera emato-retinica e garantire numerosi compiti che sono cruciali per la salute e la funzione fotorecettori 1, come tempra raggi luminosi con pigmenti di melanina, ri-isomerizzazione del componente opsin fotoreattivo retina, fornendo nutrienti e gCRESCITA fattori, partecipando a disposizione PR metabolita.

Inoltre, le cellule RPE eliminano spesi POS e riciclano i loro componenti, un'occupazione quotidiana che è regolato dal ritmo circadiano in retina di mammifero 2,3. La clearance di capannone POS è assolutamente necessario per la sopravvivenza PR. Quando è completamente abrogato, POS detriti si accumulano e PRS degenerano causando una rapida 4,5 perdita della vista. Se il profilo ritmica viene persa e sostituita da un'attività costante, PR e RPE difetti accumulano con l'età 6. Pertanto, è molto importante per caratterizzare la regolazione molecolare di RPE fagocitosi in vitro per comprendere fenotipi legati al suo erettile. È interessante notare che il macchinario molecolare in cellule RPE è molto simile a quello utilizzato dai macrofagi per eliminare cellule apoptotiche ed entrambi sono determinati dal riconoscimento della fosfatidilserina esposta su detriti fagocitica 7-9. Tuttavia, le cellule RPE e macrofagi regolano phagocytosis diversamente, come macrofagi optare per l'eliminazione immediata di cellule apoptotiche al momento dell'incontro, mentre le cellule RPE ritmicamente inghiottire POS solo una volta al giorno, nonostante il loro contatto permanente con i segmenti esterni. Questo suggerisce specifici meccanismi di regolazione che non sono ancora pienamente compresi.

Molte delle molecole implicati nel meccanismo RPE fagocitica sono stati identificati o convalidato grazie all'utilizzo di POS isolata e coltura cellulare saggi fagocitosi. Il recettore alphavbeta5 integrina situata sulla superficie cellulare apicale RPE, in coordinamento con il suo ligando MFG-E8, si lega selettivamente al POS 10-12, che vengono poi interiorizzata attraverso il MerTK tirosina chinasi del recettore 13-15. Il recettore scavenger CD36 ha dimostrato di partecipare aspirazione POS ed influenzare la velocità 16,17, e potrebbe essere utilizzato come sensore di fosfolipidi ossidati in superficie POS 18. Internalizzazione deve il reclutamento di F-actina citoscheletro-assproteine ​​ociated quali annessina 2 19, miosina II 20 e miosina VIIA 21,22. Sono utilizzati anche POS Native o ossidato in vitro per capire invecchiamento fenotipi di cellule RPE in vivo legati all'accumulo di mal digerito POS ossidato 23-28. La generazione di cellule RPE derivate da cellule staminali ha avviato una nuova applicazione per POS isolati che vengono utilizzati per dimostrare la funzionalità delle cellule prima di essere trapiantate in animali o pazienti 29,30,27.

Prima descritto da Molday e colleghi nel 1987 31, il protocollo per l'isolamento di POS bovina combina un passo ultracentrifugazione di omogenati retiniche sui continui gradienti di saccarosio con l'osservazione del caratteristico aspetto arancione di greggi fotopigmento retinica (portando 11- retinica cis). Negli ultimi 10 anni, a causa di precauzioni prese, al fine di minimizzare il rischio di morbo della mucca pazza, l'uso degli occhi suina è diventato sempre più dinamicongly prominente. Il protocollo qui descritto viene illustrato come ottenere grandi quantità di POS da suina o bovina occhi che possono essere aliquotati e conservati per lunghi periodi di tempo. Questo elimina la necessità di preparare POS da occhi roditore, che richiede l'utilizzo di un gran numero di animali per la preparazione e il dosaggio POS 32,33,21,22. Inoltre, dettagli di etichettatura POS prima memorizzazione utilizzando molecole fluorescenti sono indicati, per quantificare e visualizzare POS in modo semplificato e comparabile per alcune applicazioni rispetto all'etichettatura POS dopo la fagocitosi dosaggio 32,10. Pertanto, queste grandi scorte consentono riproducibilità e facilità d'uso in molti diversi tipi di esperimenti.

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Protocollo

Questo esperimento di isolamento POS richiede tempo e può richiedere fino a 12 ore per completare se POS sono etichettati prima di riporlo. Il protocollo è stato adattato da un documento pubblicato da RS Molday e colleghi nel 1987 31 e modificato da SC Finnemann e colleghi nel 1997 10.

Gli animali sono stati trattati secondo l'Associazione per la Ricerca e la Visione e Ophthalmology (ARVO) Dichiarazione per l'uso di animali in Oftalmica e Vision Research. Protocolli sono stati esaminati e approvati dal Comitato Etico Charles Darwin dell'Università Pierre e Marie Curie di Parigi-06 e la Istituzionale Animal Care and Use Committee Fordham University.

1. Generale Set Up

  1. Ottenere 80 fresche di maiale o vacca occhi fresco come appena dopo la macellazione possibile e tenerli freddo al buio. Fornire istruzioni al provider così l'azienda procede nello stesso modo. Questo protocollo è ottimizzato per 80 occhi. Aprocedere con più occhi e ottenere scorte più grandi (ad esempio, dal 160 occhi), il doppio della quantità di soluzione ed effettuare 2 giri di ultracentrifugazione; campioni piscina più tardi nella fase di raccolta (vedi punto 2.2.2).
  2. Impostare sulla panchina della lampada luce di sicurezza rossa, tamponi assorbenti, salviette (tavolo Materials). Preparare 15 centimetri piatti e sacchetti per la raccolta dei rifiuti a rischio biologico (parti dell'occhio inutilizzato, vetrose ...). Indossare aderente labcoat, guanti, protezioni maniche e occhiali.
  3. Precauzioni:
    1. Pre-raffreddare tutte le soluzioni poi tenerli freddo durante tutte le fasi. Mantenere occhi e gradienti raffreddata su ghiaccio per quanto possibile.
    2. Mantenere occhi e tessuti derivati ​​nel buio più possibile fino alla fase di raccolta dopo l'ultracentrifugazione per evitare photobleaching di pigmenti visivi e della perdita del colore rosa-arancio della forma attiva della fotopigmenti.

2. Protocollo Azioni

  1. Preparare soluzioni e gradienti:
    1. Taurina Thaw magazzino completamente con un bagno d'acqua a 37 ° C.
    2. Preparare tutte le soluzioni di soluzioni madre (Tabella 1, soluzioni di archivio) e mescolare bene il saccarosio con altri ingredienti con un agitatore magnetico per ogni soluzione.
      1. Preparare 15 ml della soluzione di omogeneizzazione ad una concentrazione finale del 20% di saccarosio, 20 mM Tris pH7.2 acetato, 2 mM MgCl 2, 10 mM glucosio e taurina 5 mM.
      2. Preparare la soluzione di saccarosio al 25% ad una concentrazione finale del 25% di saccarosio (utilizzando 70% stock saccarosio), 20 mM tris acetato pH 7,2, glucosio 10 mM e taurina 5 mM.
      3. Preparare la soluzione di saccarosio al 60% ad una concentrazione finale del 60% di saccarosio (utilizzando polvere saccarosio), 20 mM Tris pH7.2 acetato, glucosio 10 mM e taurina 5 mM.
      4. Preparare la soluzione di lavaggio 1 per una concentrazione finale di 20 mM acetato tris pH 7,2 e 5 taurina mm.
      5. Preparare la soluzione di lavaggio 2ad una concentrazione finale del 10% di saccarosio, 20 mM Tris acetato pH 7,2 e 5 mM taurina.
      6. Preparare la soluzione di lavaggio 3 ad una concentrazione finale del 10% di saccarosio, 20 mM sodio fosfato pH 7,2 taurina e 5 mM.
    3. Fissa Il creatore gradiente su un agitatore magnetico e inserire una ancoretta nella camera vicina all'uscita cui verrà inserita la soluzione al 60%. Utilizzare una cut-off punta P200 pipetta posto all'uscita del tubo per ottenere la corretta velocità di colata.
    4. Cast gradienti lineari delicatamente diluendo e agitando la soluzione di saccarosio del 60% a quello del 25% con 12 ml di ciascuna soluzione (cioè, totale 6 tubi per 80 occhi) in tubi ultracentrifuga pre-refrigerati. Mescolare bene la soluzione di saccarosio gradualmente-diluizione del 60%. Stazionario il gradiente di velocità del flusso, versando la soluzione uniformemente e non troppo veloce.
      NOTA: Al fine di ottenere un continuo, gradiente lineare, mantenere l'apertura puntale destra alla superficie della soluzione per l'intero gradiente formation.
    5. Lasciate che i gradienti sedersi sul ghiaccio per circa 1 ora per la stabilizzazione. Tenere i gradienti refrigerate fino caricato. Non agitare le provette per evitare di disturbare il gradiente.
  2. Collezione Tessuto:
    1. Raccogliere tessuti sotto fioca luce rossa. Dai un occhio in una mano e colpire la parte anteriore con bordo di lama di rasoio tenendo l'occhio lontano (per evitare spruzzi; Figura 1). Utilizzare la lama di rasoio per tagliare il bulbo oculare anteriore in 2 metà (cornea più di almeno 5 mm nella sclera). Rimuovere la lente e capovolgere l'oculare dentro e fuori in modo che possa essere tenuto sopra la punta di un dito esponendo così la retina.
    2. Utilizzando la lama di rasoio in un angolo, raschiare delicatamente la retina, staccando facilmente e costituirsi strato rosata, la superficie tapetum tagliati a testa del nervo ottico (Figura 1). Raccogliere tutte le retine in 2 x 50 ml tubetti contenenti ciascuno 15 ml di soluzione di omogeneizzazione sul ghiaccio.
    3. Homo Retinagenization:
      1. Agitare la sospensione vigorosamente a mano per 2 minuti per interrompere i diversi strati cellulari, rompere POS fuori dal resto della cellula PR, frammento POS e omogeneizzare la sospensione retina.
      2. Filtro 3x attraverso un doppio strato di garza pulita per rimuovere frammenti di tessuto di grandi dimensioni e raccogliere il flusso continuo in clean 50 ml tubi (Figura 1). La sospensione della retina di essere abbastanza spessa, per massimizzare la resa, premere delicatamente sulla garza per rilasciare rimanenti tessuti frammentati dopo ogni filtrazione.
  3. Fotorecettore esterno frammento segmento (POS) isolamento:
    1. Adagiare la retina preparazione greggio, intorno 6-7 ml per provetta, oltre 6 x 30 ml tubi ultracentrifuga ciascuno contenente 24 ml di fresche refrigerate continua 25 - 60% di saccarosio gradiente (Figura 1). Bilanciare i tubi opposte come appropriato per essere utilizzato il rotore. Ultracentrifuga a 106.000 xg per 50 min a 4 ° C.
    2. Rimuovere la maggior parte della soluzione sopra la banda rosa-arancio nel terzo superiore del gradiente per aspirazione (Figura 2A). Raccogliere la banda rosa-arancio con un cut-off P1000 punta in un bicchiere. Eliminare il riposo dopo neutralizzazione con candeggina (rifiuti biologici).
    3. Diluire con ~ 4 - 5 volumi di ghiacciata Wash 1 soluzione. Separare in altrettanti tubi 30 ml come necessario. Centrifugare a 3.000 xg per 10 min a 4 ° C. Eliminare con cautela il surnatante.
    4. Pellet Risospendere in 10 ml di Wash 2 soluzione e far girare a 3000 g per 10 minuti come descritto sopra. Risospendere pellet in 15 ml Lavare 3 e girano di nuovo a 3000 xg per 10 min. Combina le sospensioni da diverse pellet per ridurre il numero di tubi necessari prima della centrifugazione in Wash 2 e lavare 3 soluzioni.
  4. POS aliquotando senza etichettatura:
    1. Risospendere POS in 10-20 ml DMEM. Prediluito 10 ml in 490 microlitri DMEM (1:50) e contano allungata così come POS turbinava in uncamera di conteggio delle cellule (Figura 2B). Calcola la resa e la concentrazione in particelle POS per mL.
      NOTA: La resa varia a seconda principalmente dall'età e ceppo di suini / mucche e dimensioni degli occhi, per esempio, una buona preparazione varia da 5 - occhi 8 x 10 9 POS da 80 suini.
    2. Stabilire volume finale DMEM (tipicamente 10 - 20 ml) e aggiungere saccarosio per ottenere una concentrazione finale di 2,5% di saccarosio.
    3. Preparare aliquote della dimensione desiderata, ad esempio, 5 x 10 7 POS per provetta per un volume risospensione 2 ml per un esperimento a 96 pozzetti a 40 microlitri / pozzetto. Spin 1 aliquota per 5 min a 2300 xg a temperatura ambiente e valutare le dimensioni del pellet. Preparare varie dimensioni aliquote per i diversi volumi di applicazione come POS non deve essere congelato e scongelato due volte.
    4. Congelare aliquote POS a -80 ° C fino a nuovo uso.
      NOTA: Aliquote sono stabili per molti mesi. Nelle nostre mani, senza etichetta o con etichetta POS può essere conservato per almeno un anno.
  5. Etichettatura POS e in aliquote:
    NOTA: Usiamo tipicamente FITC etichettare POS per la quantificazione dei test di fagocitosi, ma altri coloranti possono essere utilizzati come pure a seconda delle esigenze.
    1. Risospendere 1 10 mg FITC flaconcino a 2,5 mg / ml in concentrazione 0,1 M Na tampone carbonato pH 9,5 mescolando 2,6 ml 0,1 M NaHCO3 pH 8,4 con 1,4 ml di 0,1 M Na 2 CO 3 pH 11,5 (Tabella 2, Soluzioni di riserva). Ruotare per 1 ora a temperatura ambiente, proteggendo dalla luce e girare per 5 minuti alla massima velocità per far sedimentare i solidi FITC non risospese.
    2. Risospendere il pellet POS in 10 ml di soluzione di lavaggio 3 (o DMEM) e aggiungere 2 ml di soluzione FITC per 80 occhi. Conservare rimasto FITC congelato a -80 ° C. Ruotare per almeno 1,5 ore a temperatura ambiente. Proteggere dalla luce utilizzando un foglio di alluminio.
    3. Lavare POS etichettato due volte con soluzione di lavaggio 3 come descritto nel paragrafo 2.3.4, quindi una o due volte in DMEM fino quasi nessun FITC gratuito è visto nel surnatante fraction. Risospendere POS in DMEM e procedere come per il POS senza etichetta per il conteggio e la suddivisione in aliquote (sezione 2.4).
  6. Utilizzando POS in esperimenti:
    1. POS Scongelare a temperatura ambiente, e tenerli all'oscuro il più possibile se sono fluorescenza etichettati. Spin per 5 min a 2300 xga RT. Aspirare il surnatante.
    2. Subito risospendere in volume appropriato di soluzione di dosaggio come dettato dall'esperimento. In caso di diversi momenti della sfida POS, negozio risospeso POS a RT al buio tra i punti temporali per diverse ore.

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Risultati

La combinazione del gradiente di saccarosio lineare e l'ultracentrifugazione permette la separazione dei vari componenti della sospensione retinica per densità. Cellule e detriti RPE grande retiniche pesanti si depositano o vicino al fondo del gradiente (Figura 2A). Accendino POS e cellule singole leggeri o detriti cellulari dalla retina migrano bande come separati per raggiungere la metà superiore del gradiente entro la fine del periodo di centrifugazione. Mantenendo gli occhi ed i campioni al buio fin...

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Discussione

Tre passaggi o condizioni sono cruciali per la purificazione ottimale: qualità del gradiente di colata e delicata manipolazione tubi gradiente, mantenendo tessuti refrigerati e al buio fino alla fase di raccolta, la forza di scuotimento di omogenati retina per ottenere il corretto isolamento POS dal resto del PR cell. Se alcuni problemi sorgono nel vedere il gruppo arancione correttamente, sono molto probabilmente a causa di uno dei tre motivi di cui sopra (si veda anche il secondo paragrafo della sezione Risult...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere alcun interesse finanziario concorrente.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto da Agence Nationale de la Recherche (Jeunes Chercheuses / Jeunes Chercheurs a EFN), Fondation Voir et Entendre e Fondation Bettencourt Schueller (Young Investigator Grants a EFN), Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS, posizione permanente per EFN) , e il National Eye Institute dei National Institutes of Health (R01-EY13295 a SCF). Inoltre, l'Institut de la Vision è finanziato dal Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Université Pierre et Marie Curie di Parigi-6, Centre National de la Recherche Scientifique e attrezzature de Paris.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Materiale/Attrezzatura specifica Creatore
gradienti a 2 camereCreatore di gradiente
Tubi in silicone di 3 mm di diametroper colata in gradiente
agitazione magnetica di piccole dimensioniBarra di agitazione che si adatta alla camera di creazione del gradiente Lampada
a luce di sicurezza rossaLampada inattinica per la dissezione nel provette scure
Ultra Clear 25 x 89 cmBeckman344058Provette per ultracentrifugazione
PP Oak Ridge ProvetteNalgene3119-0050Provette per centrifugazione da 30 ml
Optima LE-80KBeckman Coulter365668Ultracentrifuge
SW 32Ti rotore oscillanteBeckman Coulter369694Rotore oscillante per ultracentrifuga
Avanti J-26 XPBeckman Coulter393124Centrifuga
JA-25.50 RotoreBeckman Coulter363058per centrifuga Avanti J-26 XP
FITC Isomero ILife TechnologiesF-1906Colorante fluorescente
Altro materiale/attrezzatura
Camera di conteggio (come Neubauer o Malassez)
Secchielli per ghiaccio scuri con coperchi
Bilance
Agitatore magnetico e asta
Microcentrifuga
37 gradi C bagnomaria-80
gradi C freezer
Materiali di consumo Camice
da laboratorioSalute e sicurezza
Guanti
Protezioni per maniche Occhiali
Cuscinetti
assorbenti
Sacchetti e bidoni della
Weck-PrepDissezioneLamette da barba larghe 60 mm/2,25 pollici
di plastica da 15 cm
Fogli
15 e 50 mldi consumo comuni
Microprovette
Foglio di
di con camere da 30 mlBarra didi sostegnorefritaspazzatura a rischio biologicoLame Piatto di garza sterili Provette da Materiali alluminio

Riferimenti

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