Articolo metodologico

A lungo termine Time Lapse Imaging del mouse cocleari Espianti

DOI:

10.3791/52101

⸱

2 novembre 2014

 , 
1Biological Sciences Platform, Sunnybrook Research Institute, 2Department of Otolaryngology - Head and Neck Surgery, University of Toronto, 3Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto

In questo articolo

Sommario

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Immagini dal vivo della coclea embrionale dei mammiferi è impegnativo, perché i processi di sviluppo a portata di mano operano su un gradiente temporale nell'arco di dieci giorni. Qui vi presentiamo un metodo per la coltura e quindi l'imaging embrionale dei tessuti espianto cocleare preso da un topo reporter fluorescente in cinque giorni.

Abstract

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Qui vi presentiamo un metodo a lungo termine time-lapse imaging dal vivo espianti del mouse cocleari embrionali. Il programma di sviluppo responsabile della costruzione altamente ordinata, complessa struttura dei proventi coclea di mammifero per una decina di giorni. Al fine di studiare i cambiamenti nell'espressione genica in questo periodo e la loro risposta alla farmaceutica o la manipolazione genetica, l'imaging a lungo termine è necessario. In precedenza, l'imaging in tempo reale è tipicamente stata limitata dalla redditività del tessuto espiantato in una camera umidificata cima a un microscopio standard. Difficoltà nel mantenere condizioni ottimali per la crescita della cultura in materia di umidità e temperatura ha posto limiti alla lunghezza di esperimenti di imaging. Un microscopio integrato in una coltura di tessuti incubatore modificato fornisce un ambiente ideale per l'imaging a lungo termine-live. In questo metodo si dimostra come stabilire embrionali di topo espianti cocleari e come utilizzare un microscopio incubatore per condurre lasso di tempo Imaging utilizzando sia in campo chiaro e microscopia a fluorescenza per esaminare il comportamento di una tipica giornata embrionale (E) 13 espianto cocleare e Sox2, un marker delle cellule prosensory della coclea, su 5 giorni.

Introduzione

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La coclea dei mammiferi è un organo complesso altamente ordinato. Nel topo, tra l'emergere dell'orecchio interno primitiva vescicola otica del giorno E11 e il completamento del programma di sviluppo nelle fasi postnatali precoci, più ondate di segnalazione cellulare e cambiamenti coordinati nell'espressione genica hanno luogo. Esecuzione dalla base all'apice del condotto cocleare è il suono di rilevamento epitelio sensoriale, o l'organo del Corti. Sviluppo dell'organo del Corti è squisitamente controllato in modo tale che entro la fine dello sviluppo, che sarà composto da una sola fila di cellule ciliate interne, tre file di cellule ciliate esterne intervallate da cinque file di cellule di supporto (due file di celle pilastro, tre file di celle Deiters ') 1. Deviazione da questo preciso ordine si traduce in perdita di udito, heighlighting l'importanza di studye Ofthe genesi e patterning del epithemlium sensoriale 2.

In coltura in vitro del mouse Coch embrionalelea è uno strumento essenziale per lo studio dei meccanismi di sviluppo dell'organo del Corti. Questa tecnica è stata fondata nel 1974 e nel corso degli ultimi 40 anni, è stato utilizzato per chiarire molti dei meccanismi attraverso i quali è specificato l'epitelio sensoriale e l'organo del Corti stabilito 3. La coclea è un organo complesso con processi di sviluppo dinamici; una manipolazione può richiedere fino a sette giorni per manifestare 1. Ad esempio, quando si aggiunge inibitori GSK 3β ad una cultura espianto cocleare a E13, il periodo di incubazione ottimale per osservare un effetto robusto del composto è di sei giorni 4.

Immagini dal vivo della coclea in via di sviluppo permette di indagine in cambiamenti nella morfologia dell'organo del Corti, cambiamenti di espressione genica, il monitoraggio di migrazione, proliferazione o morenti cellule, e permette l'osservazione in tempo reale dei risultati di agenti farmaceutici e la rottura di segnalazione percorsi. Fino ad ora, vivere l'imaging della cocleaè stata principalmente effettuata mediante microscopia confocale a immagini piccole aree dell'organo del Corti in periodi di tempo brevi 5-8, ma questa tecnica ha dei limiti dovuti alla redditività espianto. Nelle immagini degli effetti delle manipolazioni a lungo termine sui processi evolutivi lenti, l'ambiente di imaging è cruciale. Tipicamente un sistema di imaging vivo confocale utilizza una scatola di plastica umidificata che siede sul microscopio. Calore e umidità possono sfuggire attraverso le fessure nella scatola incubazione dove incontra il tavolo microscopio, attraverso le finestre di accesso, attraverso le aperture a battente e attraverso le aperture intorno varie parti del Microscopio quali l'obiettivo o della sorgente luminosa. Questo non è ottimale per mantenere espianti sani per più di due o tre giorni.

Definiamo 'microscopio incubatore' come un microscopio invertito sigillato all'interno di un livello di CO 2 incubatore, piuttosto che un incubatore costruito intorno al microscopio. Un microscopio incubatore extende la durata dell'esperimento tale che piuttosto che l'imaging in due o tre giorni, i campioni possono essere esposte per due settimane. Un microscopio incubatore fornisce un ottimo ambiente per la crescita cellulare e la differenziazione, con il minimo disturbo per espiantare le culture e le condizioni standard controllato. Negli studi che si svolgono su più giorni è comune ricorrere a campioni di imaging quotidianamente rimuovendoli dal termostato e li trasporta ad un microscopio a fluorescenza invertito. Anche se questo approccio può funzionare, di estrarre le stoviglie dal termostato infligge stress sul tessuto in via di sviluppo sensibile. Variazioni acidità del mezzo di coltura e le fluttuazioni di temperatura dovuto alla rimozione dal termostato può provocare lo sviluppo ottimale e tessuto sano. Imaging stessa regione nello stesso piano focale e nello stesso orientamento in ogni punto temporale è estremamente impegnativo. Utilizzando un sistema automatizzato all'interno di un incubatore, è possibile mantenere in buona salutetessuti, per raccogliere le immagini a più punti di tempo e di garantire che la stessa area viene catturato in ogni fotogramma. Negli ultimi anni sono stati sviluppati diversi incubatori tessuto microscopio integrati, questi sono stati utili non solo nella pratica clinica 9 ma anche in cellule staminali e cancro ricerche 10,11.

Qui vi presentiamo un protocollo per il lungo termine l'imaging dal vivo di espianti embrionali del mouse cocleari. Usiamo un sistema di microscopia automatizzata all'interno di un incubatore CO 2 standard che ha la capacità di catturare immagini di più campioni in momenti insieme. Il sistema è costituito da un microscopio invertito impostato all'interno di un incubatore. I campioni sono collocati in una pedana rotante che permette l'imaging di campioni multipli ad ogni tempo. Illuminazione, l'acquisizione di immagini e la rotazione della pedana sono controllati da un sistema automatico gestito tramite software Metamorph. Impostando una routine di imaging con il software operativo possiamo impostare un esperimento di correre per un massimo di two settimane con minimo intervento umano. In questo esempio si usa sia in campo chiaro e fluorescenza a mostrare una crescita su larga scala e riarrangiamento della coclea, e, in particolare, la regione prosensory. In questo esperimento, coclee verrà sezionato da Sox2 EGFP topi reporter del giorno embrionale E13. Sarà stabilita culture in vitro e poi ripreso nel corso di cinque giorni.

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Protocollo

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Tessuto mouse è stato raccolto da Sox2 EGFP -reporter topi 12 mantenuti e eutanasia ai sensi del canadese sugli orientamenti per la cura degli animali per la cura e l'uso di animali da laboratorio.

1. Coltura embrionale coclee

  1. Supplemento Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) miscelando 8,89 ml di DMEM, 1 ml di siero fetale bovino (FBS), 100 ml di 100x N2 integratore, e 10 ml di 10 mg / ml ciprofloxacina. Supplemento soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) mescolando 495 ml HBSS con 5 ml di 100% HEPES.
  2. Preparare vetro cultura fondo piatti:
    1. In una cappa a flusso laminare, risospendere 200 microlitri seminterrato estratto membrana substrato in 5 ml di DMEM. Preparare 35 millimetri di vetro del diametro di coltura fondo piatti con 10 mm di pozzi. Pipettare 150 ml di substrato / DMEM al centro di ogni piatto fondo di vetro. Questi piatti possono essere utilizzati dopo 40 minuti di incubazione, oppure possono memorizzare in un CO 2 Incubatore a 35 ° C per almeno una settimana.
      NOTA: fondo trasparente piatti sono utilizzati per i seguenti motivi: per garantire che la base del piatto è trasparente e adatto per l'imaging, per creare un pozzo nel centro del piatto che permette gli espianti di stabilirsi in una zona facilmente posizionato e infine in modo che dopo un esperimento il campione può essere trattati per immunoistochimica e successiva analisi.
  3. Preparare la stazione di lavoro e gli strumenti:
    1. Accendere il banco di lavoro pulito a flusso laminare, e spruzzare verso il basso con il 70% EtOH per creare uno spazio di lavoro pulito. Mettere a bagno pinze, cucchiai, e un nero 184 piatto elastomero di silicone (un mix di 184 elastomero di silicone (10 parti), il catalizzatore (1 parte) e polvere di carbone (2,5 g)), nel 70% EtOH.
  4. Nella stazione di lavoro pulita, embrioni di raccolta per l'esperimento. Raccogliere embrioni di gestazione appropriato in ghiaccio freddo HBSS integrato con 1% HEPES.
    1. Determinare un organo esterno o visibile che dimostreràattività di giornalista e di esaminare gli embrioni utilizzando uno stereo microscopio a fluorescenza. Raccogliere gli embrioni che presentano attività di giornalista in ghiaccio freddo HBSS integrato con 1% HEPES come questi sono oggetto dell'esperimento.
  5. Raccogliere le ossa temporali:
    1. Lavorare rapidamente, utilizzando una sorgente di luce fredda e una pinza sottile, raccogliere le teste dei cuccioli. Fare attenzione a clip in vertebre cervicali e sotto la mascella per evitare danni alle ossa temporali.
    2. Aprire con cautela il cranio. Rimuovere il cervello, tagliare la parte anteriore della testa, e trasferire il cranio posteriormente ghiaccio fresco HBSS freddo addizionato con 1% HEPES in un piatto pulito. Sezionare con cautela le a forma di ossa temporali di arachidi avendo cura di mantenere il sistema vestibolare in tatto.
  6. Sezionare la coclea:
    1. Trasferire le ossa temporali ad un piatto rivestito nero elastomero siliconico in ghiaccio freddo HBSS integrato con 1% HEPES, pin regione vestibolare dell'osso. Inserire i perni di insetti aun angolo obliquo per stabilizzare l'osso temporale e creare spazio per le pinze. Il fissaggio è un passo cruciale nel processo come se l'osso temporale può muoversi troppo è molto difficile raccogliere una coclea intatta.
    2. Rimuovere con cautela la cartilagine che circonda la coclea. Inserire una barba della pinza nella cartilagine sul bordo esterno della base della coclea e ritagliare un foro nella cartilagine.
    3. Agganciare un lembo sul lato, inserire il dente della pinza e separare delicatamente il tetto del condotto dalla cartilagine. Agganciare orizzontalmente nella parte superiore e in diagonale, e sollevare con cautela la parte anteriore della capsula. Inserire un polo della pinza tra la cartilagine rimanente e il condotto e la clip delicatamente l'ultima sezione. La superficie apicale della coclea è ora esposta.
    4. Partendo dalla base, prendere l'area dove il tetto del condotto incontra l'epitelio cocleare e aprire il condotto cocleare. Rimuovere delicatamente il tetto, tagliose necessario fino a quando non viene completamente rimosso. Tagliare porzioni di membrana sinistra sul lato mediale del condotto. Pulire il condotto di tessuto mesenchimale eccesso e staccare il condotto dal sistema vestibolare.
  7. Cultura espianti:
    1. Inserire un espianto, luminale superficiale fino, al centro di un vetro rivestito piatto di coltura di fondo del substrato, accuratamente erogare tutto il liquido e lasciate per due minuti. Aggiungere 150 microlitri DMEM integrato, goccia a goccia per l'espianto, facendo attenzione a non disturbarlo. Qualora l'espianto galleggiare liberamente, riposizionare con una pinza, ma fare attenzione che l'espianto si deposita sul fondo del piatto in modo che possa collegare al substrato.
    2. Porre le capsule fondo di vetro da 12 cm di diametro piatto Petri profondo, con un piattino di acqua sterile per mantenere l'umidità. Mettere culture in un incubatore a 35 ° C durante la notte in modo che l'espianto di allegare al substrato e appiattire.

2. live Imaging

  1. Selezionare campioni espianto. Utilizzare uno stereo microscopio a fluorescenza per valutare la condizione di ciascuna coclea espiantato. Selezionare espianti solo se il condotto è intatta e attaccata al vetro dalla base all'apice.
  2. Impostare l'incubatore a 35 ° C con il 5% di CO 2 per coltura di tessuti cocleare. Mettere le culture nel microscopio incubatore:
    1. Aspirare delicatamente il DMEM integrato e sostituirlo con almeno 500 ml di media fresco. Per l'imaging fino a 6 giorni, 1-1,5 ml è meglio. Nei casi in cui espianti sono vagamente collegati, pipettare un anello di media di tutto il bordo del piatto. Questo liquido in più farà una miniatura 'camera umidificata' senza disturbare l'espianto mentre si continua ad attribuire alla matrice.
      1. In alternativa, l'uso incernierato piatto copre per aprire i coperchi mentre il piatto rimane nel suo montaggio al microscopio se i reagenti devono essere scambiati durante gli intervalli tra le raccolte di immagini. Coperture piatto incernierati permettono i coperchi di essereaperto senza disturbare i campioni o di estrarre le stoviglie dalle loro impostazioni. Questo mantiene la loro esatta posizione per le successive acquisizioni di immagini.
    2. Inserire i piatti di vetro di fondo contenenti campioni adeguati nel supporto piatto del campione. Il microscopio in questo esempio ha una piattaforma rotante che contiene otto piatti 35 millimetri campione.
    3. Sotto la cappa a flusso laminare sostituire i coperchi di plastica con coperchio di vetro e inserire i piatti nel supporto piatto del campione. Posizionare il supporto piatto del campione all'interno dell'incubatrice facendo attenzione a non spostare il espianti dal fondo del piatto o disturbare media.
  3. Impostare la routine di imaging:
    1. Accendere il microscopio, lampada UV e la fotocamera e aprire il software di imaging.
    2. Individuare i campioni, scegliere un area di esposizione, piano di messa a fuoco e regolare i tempi di esposizione per ogni piatto in sequenza. Scegliere il piano di messa a fuoco dipende non solo la vista del espianto al momento della partenza, ma alavendo presente come il tessuto si muoverà e per quanto tempo il decorso verrà eseguito.
    3. Impostare una pila Z centraggio intorno al piano focale selezionato nel canale di fluorescenza. Impostare la frequenza e la lunghezza del campionamento per l'esperimento. La frequenza di campionamento è limitata dal tempo necessario per raccogliere le immagini, quindi questo dovrebbe essere determinato dopo aver selezionato campi di vista e impostando una pila Z. In questo caso il campionamento ha luogo ogni 30 minuti in cinque giorni. La durata dell'esperimento può essere fino a 14 giorni.
  4. Genera un film:
    1. Alla fine del periodo di time lapse aprire i file di immagine. Viene utilizzato in questo caso il software Metamorph che si apre punti di raccolta sequenziali. Fotogramma per fotogramma scegliere il miglior piano focale per mostrare la popolazione di cellule.
    2. Convertire le immagini in un file .avi, o esportarli come un montaggio per generare un insieme di immagini che possono essere aperti e analizzati nel software di elaborazione delle immagini o convertiti in forma multiplats utilizzando il software di elaborazione video.

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Risultati

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Qui vi mostriamo un montaggio (Figura 1) e un film (Figura 2), a dimostrazione di come un tipico espianto cocleare organotipica crescerà se placcato su E13.5. Un Sox2 topo reporter è stato utilizzato per visualizzare la regione prosensory. Il film illustra che la coclea subisce crescita e la convergenza ed estensione, le cellule nella zona laterale del dominio Sox2 verde non sembrano dividere il tessuto circostante si espande. Questa è una caratteristica dell'organo di...

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Discussione

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Ci sono diversi punti tecnici da considerare quando le culture sono stabiliti e nella creazione del microscopio time-lapse in modo per l'imaging a lungo termine.

Usiamo matrice di membrana basale come substrato per la coltura di espianti cocleari, ma il supporto deve essere adattato al tipo di cellula. Ad esempio, per colture neuronali di immagine, può essere meglio per fornire un rivestimento fibronectina. Temperatura di incubazione e la composizione del gas dovrebbero essere scelti in ...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Grazie a Willy Sun per l'assistenza tecnica e il Dr. Kris Gellynck per gli utili commenti e tre revisori anonimi per i loro consigli costruttivi. Questo lavoro è stato finanziato dalla udienza Regeneration Initiative Sunnybrook

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Dulbecco's Modified Eagle mediaGibco12430Più marche producono questo
estratto di membrana seminterrato Corning354230Matrigel. Prodotti simili alternativi sono disponibili presso altri fornitori.
http://catalog2.corning.com/Lifesciences/en-US/Shopping/Product.aspx?categoryname=Cell+Culture+and+Bioprocess%28Lifesciences%29|Extracellulari+Matrice+Proteine+ECM+e+Fattori+Attaccamento%28Scienze della Vita%29|Matrigel+Basamento+Membrana+Matrice+%28Scienze della vita%29
Siero fetale bovinoGibco16000044Diverse marche producono questo
http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=fbs&resultPage=1&results PerPage=15& autocomplete=
HEPESGibco5630080Diverse marche producono questo
http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=hepes&resultPage=1&results PerPage=15& autocomplete=
100 x N2 supplementoGibco17502-048Diverse marche producono questo
http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=n2&resultPage=1&results PerPage=15& autocomplete=
CiprofloxacinSigma Aldrich17850-5G-FDiverse marche producono questo
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/17850?lang=en®ion=CA
La soluzione salina bilanciata di HankGibco14170161Diverse marche producono questo. Deve essere rifiancato prima dell'uso.
http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/reagents/balanced-salt-solutions/hbss-hanks-balanced-salt-solution.html?s_kwcid=AL!3652!3!26107410508!e!!g!!hbss&ef_id=xoFOglw2s UMAAMU8:20140228185720:s
Pinze finiStrumenti per scienze fini11254-20Numero di misura 5
http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=350&CategoryId=29 Curette Strumenti per le scienze fini10080-05misura 1 mm
http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=91&CategoryId=118
Spilli per insetti Strumenti discienza fine26001-35Deve essere in acciaio inossidabile
http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=124
Piatti in plastica da 50 mmCorning/Falcon351006Diverse marche producono questo
carboneSigma Aldrich05105-250GPiù marche producono articoli simili
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/05105?lang=en®ion=CA
184 elastomero siliconicoDow/Corning SYLGARD® 184 KIT ELASTOMERO SILICONICOI piatti sono fatti in casa con diverse settimane di anticipo. L'elastomero siliconico può provenire da qualsiasi fornitore.http://www.dowcorning.com/applications/search/products/Details.aspx?prod=01064291
Piatti con fondo in vetroMatTekP35G-0-10-CLe dimensioni del piatto sono determinate dalle specifiche del sistema di imaging.  Diametro 35 mm, Pozzetto da 10 mm, il coprioggetto numero 0 si adatta a Olympus Vivaview FL.
http://glass-bottom-dishes.com/catalog/index.php?main_page=product_info&cPath= 1_4_15& products_id=2
StereomicroscopioZeiss495101-9804-000  Modello Stemi 2000. più marche producono articoli simili
http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/stereo-zoom-microscopes/stemi-2000.html
Sorgente di luce freddaZeiss000000-1063-182Più marche producono articoli simili
http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/microscope-components/lightsources.html
Stereomicroscopio fluorescente Leica microsystemsContatta Leica microsystemsLeica M165-FC. Diverse marche producono articoli simili
http://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/fluorescence/details/product/leica-m165-fc/
Incubatore Microscopio + software di imagingOlympusContatto OlympusMicrocope invertito sigillato all'interno di un incubatore a CO2. Microscopio incubatore Vivaview FL con software di imaging Metamorpoh proprietario.
http://olympuscanada.com/seg_section/product.asp?product=1055&c=0
Banco pulitoThermo Scientific51029701Diverse marche producono articoli simili
http://www.thermoscientific.com/en/product/heraguard-eco-clean-bench.html
Incubatore a CO2Thermo Scientific3310Diverse marche producono articoli simili
http://www.thermoscientific.com/en/products/co2-incubators.html
Cappa a flusso laminareThermo Scientific51026651Diverse marche producono articoli simili
http://www.thermoscientific.com/en/products/biological-safety-cabinets-clean-benches.html

Riferimenti

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