Articolo metodologico

Ad alta risoluzione microscopia elettronica del Helicobacter pylori Cag secrezione di tipo IV Sistema Pili Prodotto in diverse condizioni di Ferro Disponibilità

DOI:

10.3791/52122

⸱

21 novembre 2014

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1Department of Medicine - Division of Infectious Diseases, Vanderbilt University School of Medicine, 2Tennessee Valley Healthcare Systems, U. S. Dept. of Veterans Affairs

In questo articolo

Sommario

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Qui descriviamo un metodo per visualizzare l'organello batterico oncogenico noto come Cag Type IV Secretion System (Cag-T4SS). Troviamo che il Cag-T4SS è prodotto in modo differenziale sulla superficie di H. pylori in risposta a condizioni variabili di disponibilità di ferro.

Abstract

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Helicobacter pylori è un batterio gram negativo di forma elicoidale che colonizza la nicchia gastrica umana di metà della popolazione umana1,2. H. pylori è la causa primaria di cancro gastrico, la seconda causa di decessi correlati al cancro in tutto il mondo3. Un fattore di virulenza che è stato associato ad un aumentato rischio di malattia gastrica è l'isola di patogenicità Cag, una regione di 40 kb all'interno del cromosoma di H. pylori che codifica per un sistema di secrezione di tipo IV e la molecola effettrice affine, CagA4,5. Il Cag-T4SS è responsabile della traslocazione di CagA e peptidoglicano nelle cellule epiteliali dell'ospite5,6. L'attività del Cag-T4SS provoca numerosi cambiamenti nella biologia delle cellule ospiti, tra cui la sovraregolazione dell'espressione delle citochine, l'attivazione delle vie proinfiammatorie, il rimodellamento del citoscheletro e l'induzione di reti di segnalazione cellulare oncogenica5-8. Il Cag-T4SS è una macchina macromolecolare composta da componenti di sottoassemblaggio che coprono la membrana interna ed esterna e si estendono verso l'esterno dalla cellula nello spazio extracellulare. La porzione extracellulare del Cag-T4SS è indicata come "pilus"5. Numerosi studi hanno dimostrato che i pili Cag-T4SS si formano all'interfaccia ospite-patogeno9,10. Tuttavia, le caratteristiche ambientali che regolano la biogenesi di questo importante organello rimangono in gran parte oscure. Recentemente, abbiamo riportato che condizioni di bassa disponibilità di ferro aumentano l'attività di Cag-T4SS e la biogenesi del pilus. Qui presentiamo un protocollo ottimizzato per far crescere H. pylori in condizioni variabili di disponibilità di ferro prima della co-coltura con cellule epiteliali gastriche umane. Inoltre, presentiamo il protocollo completo per la visualizzazione del fenotipo iperpiliato esibito in condizioni di restrizione del ferro mediante analisi di microscopia elettronica a scansione ad alta risoluzione.

Introduzione

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'L'infezione da H. pylori è un fattore di rischio significativo per il cancro gastrico1. Tuttavia, gli esiti della malattia variano e dipendono da numerosi fattori come la genetica dell'ospite, la diversità genetica dei ceppi di H. pylori e gli elementi ambientali come la dieta dell'ospite11. Precedenti studi hanno stabilito che esiste una correlazione tra l'infezione da H. pylori, la carenza di ferro (misurata dalla diminuzione delle concentrazioni di ferritina ed emoglobina nel sangue) e l'aumento della produzione di citochine proinfiammatorie, inclusa la secrezione di IL-8, che alla fine porta ad un aumento della progressione della malattia gastrica12. L'infezione acuta da H. pylori è anche associata all'ipocloridria che compromette la capacità dell'ospite di assorbire il ferro nutriente e, infine, porta a cambiamenti nell'omeostasi del ferro13. Questi risultati clinici suggeriscono che la disponibilità di ferro all'interno della nicchia gastica potrebbe essere un fattore importante nell'esito della malattia. Infatti, i modelli animali di infezione da H. pylori hanno dimostrato che un basso consumo di ferro nella dieta aggrava la malattia gastrica14. I livelli ridotti di ferro in questi animali richiedono che H. pylori induca una risposta di acquisizione del ferro al fine di ottenere il ferro necessario per la replicazione batterica. H. pylori ha la capacità di perturbare il traffico di ferro all'interno delle cellule ospiti per facilitare la replicazione batterica in modo CagA-dipendente15. È interessante notare che è stato dimostrato che l'isola di patogenicità cag è regolata dal fattore di trascrizione ferro-responsivo Fur16,17. Inoltre, i ceppi Cag+ sono associati a un aumento dell'infiammazione e delle malattie gastriche come il cancro1. Questi risultati supportano un modello in cui H. pylori altera l'espressione di Cag-T4SS nel tentativo di ottenere ferro da cellule ospiti che risiedono in un ambiente povero di ferro, con conseguente esacerbazione degli esiti della malattia.

Due fattori che aumentano l'infiammazione e la morbilità sono l'espressione di Cag e la bassa assunzione di ferro nella dieta. Questi fatti supportano l'ipotesi che la ridotta disponibilità di ferro aumenti la produzione di Cag-T4SS pili all'interfaccia patogeno dell'ospite, con conseguente peggioramento della malattia gastrica11-14. L'obiettivo del metodo fornito in questo manoscritto è quello di stabilire il ruolo del ferro micronutriente nella regolazione della biogenesi del pilus Cag-T4SS. In lavori precedenti, abbiamo utilizzato due approcci per osservare un aumento ferro-dipendente dell'espressione di Cag-T4SS. In primo luogo, sono stati analizzati i ceppi di output di animali mantenuti con diete ad alto e basso contenuto di ferro e hanno rivelato che i ceppi di output della dieta a basso contenuto di ferro producevano più pili Cag-T4SS rispetto ai ceppi dietetici ad alto contenuto di ferro14. In secondo luogo, la crescita del ceppo H. pylori 7.13 in vitro in condizioni di piena di ferro ha portato a una riduzione della formazione di pili, mentre le cellule cresciute in presenza di un chelante del ferro hanno prodotto significativamente più pili.

Abbiamo continuato a studiare la regolazione ferro-dipendente del fenotipo Cag-T4SS pili e offriamo il seguente protocollo ottimizzato e risultati rappresentativi eseguiti con un ulteriore ceppo di Helicobacter pylori, PMSS1. Il razionale alla base dello sviluppo di questa tecnica è stato quello di correlare l'aumento dell'attività di Cag-T4SS in condizioni di limitazione del ferro con l'aumento della formazione di Cag-T4SS pilus. L'implicazione e l'uso più ampi di questa tecnica forniranno condizioni di coltura ottimizzate che si tradurranno in un'elevata produzione del pili Cag-T4SS. Questo test sarà utile ai ricercatori che cercano di determinare la composizione e l'architettura del Cag-T4SS arricchendo questa importante caratteristica batterica della superficie. La preparazione e la visualizzazione del campione mediante microscopia elettronica a cannone a emissione di campo presenta numerosi vantaggi rispetto a tecniche alternative come i metodi di microscopia ottica per visualizzare il Cag-T4SS e sarà appropriata per i ricercatori interessati a studiare la regolazione di questo organello10.

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Protocollo

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1. H. pylori crescita in condizioni particolari di ferro Disponibilità e co-coltura con cellule umane epiteliali gastriche

  1. Seleziona H. pylori ceppo PMSS1 per questi studi perché ha un intatto patogenicità cag isola ed esprime un tipo di funzionamento del sistema di secrezione IV. Utilizzare anche una gabbia mutante isogenico (PMSSI Δ Cage) come controllo negativo. Grow batteri su piastre di TSA addizionato con 5% di sangue di pecora (piastre di agar sangue) per 24 ore a 37 ° C in presenza del 5% di CO 2.
    NOTA: Preparare i reagenti e assemblare materiali come indicato in materiali e attrezzature della tabella. Le concentrazioni finali per ciascun reagente è elencato tra parentesi.
  2. Raschiare i batteri dalla piastra utilizzando un applicatore con punta di cotone sterili e inoculare in brodo di Brucella modificato preparata dai componenti (vedi Materiali e attrezzature Table) e integrato con il colesterolo. Incubare le culture per una notte a 37° C in aria ambiente integrato con il 5% di CO 2 con agitazione a 200 giri al minuto (rpm).
    NOTA: colesterolo viene utilizzato al posto di siero fetale bovino a causa del fatto che il siero è complesso; contenente numerose fonti di ferro nutrienti come eme che provoca variabilità nei risultati.
  3. Il giorno della coltura batterica, seminare le cellule epiteliali gastriche umane AGS (ATCC CRL-1739) su poli-D-lisina coprioggetto trattati in piastre da 12 pozzetti (circa 1 x 10 5 cellule per pozzetto).
  4. Il giorno seguente, diluire colture batteriche ad una OD600 di 0,3 in solo o integrato con 100 mM FeCl 3, 200 mM dipiridile (un chelante del ferro sintetico), o 200 micron dipiridile più 250 micron FeCl 3 brodo brucella modificato. Incubare le colture per 4 ore a 37 ° C in aria ambiente supplementato con 5% di CO 2 con agitazione a 200 rpm.
  5. Batteri centrifugare a 1000 xg per raccogliere le cellule e rimuovere surnatanti prima di risospendere in un volume uguale di fresco Brucella modificato brodo integrata con colesterolo. Misura OD600 della cultura (OD600 = 1,0 = 5,5 x 10 8 cellule / ml) e aggiungere batteri alle cellule epiteliali in una molteplicità di infezione (MOI) di 20: 1. Effettuare diluizioni seriali e le cellule batteriche piastra su piastre di agar sangue per valutare la vitalità cellulare batterica.
  6. Incubare H. cellule epiteliali gastriche umane pylori e AGS co-coltura per 4 ore a 37 ° C in presenza del 5% di CO 2 in condizioni statiche prima di eseguire la microscopia elettronica a scansione (SEM) preparazione del campione.

2. SEM Preparazione del campione per visualizzare H. pylori Cag-T4SS Pili

  1. Rimuovere H. pylori e co-colture AGS dal surnatante incubatore e decantare la cultura (salvo per IL-8 ELISA). Lavare delicatamente tre volte con sodio 0,05 M tampone cacodilato (pH 7,4). Fix campioni per 2-4 ore a temperatura ambiente in una soluzione di 2,0% paraformaldeide, 2.5% Glutaraldeide, e tampone cacodilato di sodio 0,05 M. Dopo fissazione primaria, lavare campioni tre volte con tampone cacodilato di sodio 0,05 M.
  2. Eseguire ancoraggio secondario utilizzando 0,1% tetrossido di osmio in 0,05 M di sodio tampone cacodilato in due fasi sequenziali 10 min di fissaggio. Dopo la fissazione secondaria, lavare campioni tre volte con tampone cacodilato di sodio 0,05 M.
  3. Dopo fissazione primaria e secondaria, disidratano campioni di lavaggio sequenziale con concentrazioni crescenti di etanolo come da Tabella 1.
  4. Dopo etanolo disidratazione, effettuare tre lavaggi sequenziali di anidride carbonica liquida. Poi i campioni a secco in un punto critico con una macchina asciugatrice punto critico ad una temperatura di 31,1 ° C e pressione di 1073 PSI.
  5. Monte coprioggetto sul stub campione alluminio SEM e dipingere con una linea sottile di argento colloidale sul bordo del campione per ottenere adeguata messa a terra ed evitare di ricarica durante l'imaging SEM.
  6. Campioni cappotto con 5 nm dioro-palladio utilizzando una macchina cappotto polverizzazione di aumentare campione di segnale degli elettroni secondari e l'effetto bordo.

3. I parametri di imaging per analisi ad alta risoluzione SEM

  1. Vedi i campioni con un campo-Emission Gun microscopio elettronico a scansione (SEM-FEG).
  2. Immagine in una modalità di aspirazione ad alta ad una distanza di lavoro di 5-10 mm.
  3. Impostare la tensione di accelerazione di 5 kV.
  4. Impostare dimensione del punto di 2-2,5.
  5. Inclinare il campione tra i 15-25 ° per ottenere una migliore visualizzazione dell'interfaccia ospite-patogeno.
  6. Priorità di imaging batteri aderenti ai bordi delle cellule epiteliali per la visualizzazione ad alto ingrandimento, in quanto queste aree di interazione ospite-patogeno sono arricchiti per i batteri-Pili formando.

4. Analisi statistica per valutare Pili Quantificazione

  1. Analizzare H. pylori Cag-T4SS pili utilizzando il software ImageJ per quantificare il numero di pili / cellule e per cento delle cellule esibendo il piliated phenotype secondo le istruzioni riportate di seguito.
  2. Aprire i file microfotografia nel software ImageJ. Identificare pili come strutture formate tra la cellula batterica e cellula ospite, con larghezza uniforme (10-13 nm) e la lunghezza (60-150 nm).
    NOTA: La struttura pilus è presente su ceppi batterici WT, ma assente in ceppi isogeni quali Δ Cage ceppi mutanti, che ospitano l'inattivazione del gene che codifica per il principale ATPasi che l'assemblaggio tipo poteri secrezione IV pilus.
  3. Calibrare lo strumento di misurazione tracciando una linea con lo strumento linea retta e quindi facendo clic sulla scheda "Analizza". Selezionare "Imposta Scala" dal menu a discesa e immettere il valore bar di ingrandimento nella casella "Noto Distanza" e impostare l'unità di misura per l'impostazione appropriata (nm). Fare clic su "OK".
  4. Misurare Cag-T4SS pili utilizzando lo strumento linea retta per disegnare su tutta la lunghezza o la larghezza del pilus e poi premere "Ctrl-M" per misurare ogni pilus. Osservare una finestra di dialogo con i valori misurati. Registrare questi valori o copiare e incollare in un programma di foglio di calcolo.
  5. Utilizzare la lunghezza e la larghezza dei parametri stabiliti in precedenza 24, caratteristiche non tengono conto che non si adattano al profilo di Cag-T4SS. Poi quantificare il numero di pili in base ai valori che rientrano nelle cut-off 10-13 nm di larghezza e 60-150 nm di lunghezza.
  6. Analizzare la quantificazione dei pili statisticamente con il test t di Student a due code utilizzando il software GraphPad Prism.

5. Opzionale: Valutazione della secrezione di IL-8 in correlazione con Pilus produzione

  1. Utilizzando surnatanti dal punto 2.1, eseguire un IL-8 ELISA secondo le istruzioni del produttore con il kit (vedi Materiali e attrezzature Tabella).
  2. Analizzare l'IL-8 secreto dalle cellule ospiti e calcolare la percentuale di IL-8 induzione rispetto al WT PMSS1 coltivate in terreno da solo. Eseguire l'analisi statistica con due code il test t di Student con GraphPad Prism cosìftware.

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Risultati

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In questa relazione, abbiamo dimostrato che le condizioni di diversa disponibilità di ferro hanno la capacità di modulare H. pylori Cag-T4SS pilus biogenesi all'interfaccia patogeno host. Quando coltivate in terreno da solo, H. pylori fa una media di 3 pili / cell. Quando H. pylori è coltivato in ferro esaurire condizioni (utilizzando il chelante dipiridile sintetico) che sono sub-inibitorio per la crescita batterica (Figura 1), i batteri producono numerosi Cag-T4SS pili (~ 7 ...

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Discussione

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Il ferro è un micronutriente essenziale per la maggior parte delle forme di vita, compresi i batteri patogeni. Nel tentativo di limitare la validità di microrganismi invasori, ospiti vertebrati sequestrano il ferro di nutrienti in un processo noto come "immunità nutrizionale" 18. In risposta a questo, batteri patogeni sono evoluti per utilizzare il ferro come molecola di segnalazione globale di percepire l'ambiente circostante e regolano l'elaborazione delle caratteristiche di virulenza come...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

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Questa ricerca è stata supportata dal Department of Veterans Affairs Career Development Award 1IK2BX001701 e dal premio CTSA UL1TR000445 dal National Center for Advancing Translational Sciences. I suoi contenuti sono di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente punti di vista ufficiali del National Center for Advancing Translational Sciences o del National Institutes of Health. Gli esperimenti di microscopia elettronica a scansione sono stati eseguiti in parte attraverso l'uso della VUMC Cell Imaging Shared Resource, supportata da sovvenzioni NIH CA68485, DK20593, DK58404, DK59637 e EY08126.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
di brucella modificato
Peptone da caseina (10 g/L)Sigma70172
Digestato peptico di tessuto animale (10 g/L)Sigma70174
Estratto di lievito (2 g/L)Sigma92144
Destrosio (1 g/L)SigmaD9434
Cloruro di sodio (5 g/L)Thermo FisherS271-10
Colesterolo (250X) (4 ml/L)Life Technologies12531018
Cloruro ferrico (100 o 250 uM)Sigma157740-100G
Dipiridile (200 uM)SigmaD216305-100G
RPMI
RPMI+HEPES (1X)Life Technologies22400-121
Siero fetale bovino ( 100 ml/L)Life Technologies10438-026
microscopia elettronica
Paraformaldeide (2,0% acquosa)Scienze della microscopia elettronica15713
Gluteraldeide (2,5% acquosa)Scienze della microscopia elettronica16220
Cacodilato di sodio (0,05 M)Scienze della microscopia elettronica12300
Tetrossido di osmio (0,1% acquoso)Scienze della microscopia elettronica19150
Etanolo (assoluto)SigmaE7023
Vernice all'argento colloidaleScienze della microscopia elettronica12630
Stub di campioni SEM Scienzemicroscopia elettronica75220
Vetrini coprioggettiThermo Fisher08-774-383
della secrezione IL-8
Kit ELISA Quantikine IL-8R& D SystemsD8000C
Brodo modificatoPreparazione per della Valutazione

Riferimenti

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