Qui descriviamo un metodo per visualizzare l'organello batterico oncogenico noto come Cag Type IV Secretion System (Cag-T4SS). Troviamo che il Cag-T4SS è prodotto in modo differenziale sulla superficie di H. pylori in risposta a condizioni variabili di disponibilità di ferro.
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Articolo metodologico
Ad alta risoluzione microscopia elettronica del Helicobacter pylori Cag secrezione di tipo IV Sistema Pili Prodotto in diverse condizioni di Ferro Disponibilità
In questo articolo
Sommario
Abstract
Helicobacter pylori è un batterio gram negativo di forma elicoidale che colonizza la nicchia gastrica umana di metà della popolazione umana1,2. H. pylori è la causa primaria di cancro gastrico, la seconda causa di decessi correlati al cancro in tutto il mondo3. Un fattore di virulenza che è stato associato ad un aumentato rischio di malattia gastrica è l'isola di patogenicità Cag, una regione di 40 kb all'interno del cromosoma di H. pylori che codifica per un sistema di secrezione di tipo IV e la molecola effettrice affine, CagA4,5. Il Cag-T4SS è responsabile della traslocazione di CagA e peptidoglicano nelle cellule epiteliali dell'ospite5,6. L'attività del Cag-T4SS provoca numerosi cambiamenti nella biologia delle cellule ospiti, tra cui la sovraregolazione dell'espressione delle citochine, l'attivazione delle vie proinfiammatorie, il rimodellamento del citoscheletro e l'induzione di reti di segnalazione cellulare oncogenica5-8. Il Cag-T4SS è una macchina macromolecolare composta da componenti di sottoassemblaggio che coprono la membrana interna ed esterna e si estendono verso l'esterno dalla cellula nello spazio extracellulare. La porzione extracellulare del Cag-T4SS è indicata come "pilus"5. Numerosi studi hanno dimostrato che i pili Cag-T4SS si formano all'interfaccia ospite-patogeno9,10. Tuttavia, le caratteristiche ambientali che regolano la biogenesi di questo importante organello rimangono in gran parte oscure. Recentemente, abbiamo riportato che condizioni di bassa disponibilità di ferro aumentano l'attività di Cag-T4SS e la biogenesi del pilus. Qui presentiamo un protocollo ottimizzato per far crescere H. pylori in condizioni variabili di disponibilità di ferro prima della co-coltura con cellule epiteliali gastriche umane. Inoltre, presentiamo il protocollo completo per la visualizzazione del fenotipo iperpiliato esibito in condizioni di restrizione del ferro mediante analisi di microscopia elettronica a scansione ad alta risoluzione.
Introduzione
'L'infezione da H. pylori è un fattore di rischio significativo per il cancro gastrico1. Tuttavia, gli esiti della malattia variano e dipendono da numerosi fattori come la genetica dell'ospite, la diversità genetica dei ceppi di H. pylori e gli elementi ambientali come la dieta dell'ospite11. Precedenti studi hanno stabilito che esiste una correlazione tra l'infezione da H. pylori, la carenza di ferro (misurata dalla diminuzione delle concentrazioni di ferritina ed emoglobina nel sangue) e l'aumento della produzione di citochine proinfiammatorie, inclusa la secrezione di IL-8, che alla fine porta ad un aumento della p....
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Protocollo
1. H. pylori crescita in condizioni particolari di ferro Disponibilità e co-coltura con cellule umane epiteliali gastriche
- Seleziona H. pylori ceppo PMSS1 per questi studi perché ha un intatto patogenicità cag isola ed esprime un tipo di funzionamento del sistema di secrezione IV. Utilizzare anche una gabbia mutante isogenico (PMSSI Δ Cage) come controllo negativo. Grow batteri su piastre di TSA addizionato con 5% di sangue di pecora (piastre di agar sangue) per 24 ore a 37 ° C in presenza del 5% di CO 2.
NOTA: Preparare i reagenti e assemblare materiali come indicato in materiali e attrezzatur....
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Risultati
In questa relazione, abbiamo dimostrato che le condizioni di diversa disponibilità di ferro hanno la capacità di modulare H. pylori Cag-T4SS pilus biogenesi all'interfaccia patogeno host. Quando coltivate in terreno da solo, H. pylori fa una media di 3 pili / cell. Quando H. pylori è coltivato in ferro esaurire condizioni (utilizzando il chelante dipiridile sintetico) che sono sub-inibitorio per la crescita batterica (Figura 1), i batteri producono numerosi Cag-T4SS pili (~ 7 .......
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Discussione
Il ferro è un micronutriente essenziale per la maggior parte delle forme di vita, compresi i batteri patogeni. Nel tentativo di limitare la validità di microrganismi invasori, ospiti vertebrati sequestrano il ferro di nutrienti in un processo noto come "immunità nutrizionale" 18. In risposta a questo, batteri patogeni sono evoluti per utilizzare il ferro come molecola di segnalazione globale di percepire l'ambiente circostante e regolano l'elaborazione delle caratteristiche di virulenza come.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questa ricerca è stata supportata dal Department of Veterans Affairs Career Development Award 1IK2BX001701 e dal premio CTSA UL1TR000445 dal National Center for Advancing Translational Sciences. I suoi contenuti sono di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente punti di vista ufficiali del National Center for Advancing Translational Sciences o del National Institutes of Health. Gli esperimenti di microscopia elettronica a scansione sono stati eseguiti in parte attraverso l'uso della VUMC Cell Imaging Shared Resource, supportata da sovvenzioni NIH CA68485, DK20593, DK58404, DK59637 e EY08126.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| di brucella modificato | |||
| Peptone da caseina (10 g/L) | Sigma | 70172 | |
| Digestato peptico di tessuto animale (10 g/L) | Sigma | 70174 | |
| Estratto di lievito (2 g/L) | Sigma | 92144 | |
| Destrosio (1 g/L) | Sigma | D9434 | |
| Cloruro di sodio (5 g/L) | Thermo Fisher | S271-10 | |
| Colesterolo (250X) (4 ml/L) | Life Technologies | 12531018 | |
| Cloruro ferrico (100 o 250 uM) | Sigma | 157740-100G | |
| Dipiridile (200 uM) | Sigma | D216305-100G | |
| RPMI | |||
| RPMI+HEPES (1X) | Life Technologies | 22400-121 | |
| Siero fetale bovino ( 100 ml/L) | Life Technologies | 10438-026 | |
| microscopia elettronica | |||
| Paraformaldeide (2,0% acquosa) | Scienze della microscopia elettronica | 15713 | |
| Gluteraldeide (2,5% acquosa) | Scienze della microscopia elettronica | 16220 | |
| Cacodilato di sodio (0,05 M) | Scienze della microscopia elettronica | 12300 | |
| Tetrossido di osmio (0,1% acquoso) | Scienze della microscopia elettronica | 19150 | |
| Etanolo (assoluto) | Sigma | E7023 | |
| Vernice all'argento colloidale | Scienze della microscopia elettronica | 12630 | |
| Stub di campioni SEM Scienze | microscopia elettronica | 75220 | |
| Vetrini coprioggetti | Thermo Fisher | 08-774-383 | |
| della secrezione IL-8 | |||
| Kit ELISA Quantikine IL-8 | R& D Systems | D8000C |
Riferimenti
- Cover, T. L., Blaser, M. J. Helicobacter pylori in health and disease. Gastroenterology. (6), 1863-1873 (2009).
- Sycuro, L. K., et al. Peptidoglycan crosslinking relaxation promotes Helicobacter pylori's helical shape and stomach colonization. Cell. 141
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Ristampe e permessi
