Neural Stem Cell Transplantation in Sperimentale Contusivi Model of Spinal Cord Injury

Stephana Carelli; Toniella Giallongo; Claudio Gerace; Anthea De Angelis; Michele D. Basso; Anna Maria Di Giulio; Alfredo Gorio

doi:10.3791/52141

Articolo metodologico

Neural Stem Cell Transplantation in Sperimentale Contusivi Model of Spinal Cord Injury

DOI:

10.3791/52141

⸱

17 dicembre 2014

Stephana Carelli^*¹ , Toniella Giallongo^*¹ , Claudio Gerace¹ , Anthea De Angelis¹ , Michele D. Basso² , Anna Maria Di Giulio¹ , Alfredo Gorio¹

¹Laboratory of Pharmacology, Department of Health Sciences, University of Milan, ²Department of Neuroscience, College of Medicine, The Ohio State University

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Lesioni del midollo spinale è una condizione traumatica che provoca grave morbilità e mortalità elevata. In questo lavoro descriviamo in dettaglio un modello contusione di lesioni del midollo spinale nei topi seguita da un trapianto di cellule staminali neurali.

Abstract

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Lesioni del midollo spinale è una condizione clinica devastante, caratterizzato da un complesso di disfunzioni neurologiche. Modelli animali di lesione del midollo spinale possono essere utilizzati sia per indagare le risposte biologiche di lesioni e per testare potenziali terapie. Contusione o compressione lesioni consegnato al midollo spinale chirurgicamente esposti sono i più utilizzati modelli della patologia. In questa relazione la contusione sperimentale viene eseguita utilizzando il Infinite Horizon (IH) dispositivo di simulazione, che permette la creazione di un infortunio al modello animale riproducibile attraverso la definizione di parametri specifici sugli infortuni. Il trapianto di cellule staminali è comunemente considerata una strategia potenzialmente utile per la cura di questa condizione debilitante. Numerosi studi hanno valutato gli effetti di trapianto una varietà di cellule staminali. Qui mostriamo un metodo adeguato per le lesioni del midollo spinale seguita da iniezione vena della coda di cellule nei topi CD1. In breve, mettiamo a disposizione le procedure per: i) l'etichettatura delle cellule with un tracciante vitale, ii) la cura pre-operatoria di topi, iii) l'esecuzione di una lesione del midollo spinale contusivo, e iv) la somministrazione endovenosa di post mortem precursori neurali. Questo modello contusione può essere utilizzato per valutare l'efficacia e la sicurezza del trapianto di cellule staminali in un approccio di medicina rigenerativa.

Introduzione

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Una lesione al midollo spinale (SCI) è la lesione più comune causata da un trauma ad alta energia come autoveicoli incidenti, cadute, sport e violenza ^1. In grave SCI, la forza lesioni distrugge o danneggia il tessuto neurale, causando la perdita improvvisa della funzione neurologica. Traumatic SCI si verifica spesso nei giovani adulti tra i 10 ei 40 anni di età. Essa colpisce notevolmente condizione mentale e fisica del paziente e provoca un enorme impatto economico per la società ^2. L'approccio di trattamento in fase acuta è spesso limitata ad un alto dosaggio di corticosteroidi, la stabilizzazione chirurgica e decompressione per attenuare....

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Protocollo

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NOTA: Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato dell'Università degli Studi di Milano Review e il rispetto delle linee guida italiane per gli animali da laboratorio in conformità alla Direttiva Europea Comunità del novembre 1986 (86/609 / CEE).

1. Preparazione di cellule per il trapianto

NOTA: utilizzare le cellule staminali neurali tra il 5 ° e il 9 ° di passaggio nella cultura di questi esperimenti; testare le colture per la proliferazione e la capacità di differenziazione, prima di essere etichettati per il trapianto. Determinare il grado di differenziazione mediante immunocitochimica ^12.<....

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Risultati

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Il numero totale di cellule trapiantate è 1 x 10 ⁶ cellule ed è stato suddiviso in tre iniezioni consecutive nella vena della coda. Abbiamo somministrato 3,3 x 10 ⁵ cellule in 50 ml di soluzione di tampone fosfato (PBS). La prima iniezione è stata effettuata in 30 min dopo la lesione, la seconda 6 ore dopo e l'ultimo 18 ore dopo la lesione. La scelta di un limite di tempo di 18 ore dopo SCI per l'amministrazione PM-NPC è stata determinata dalla permeabilità ottimale della barriera emato-encefalica .......

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Discussione

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In questo articolo abbiamo descritto un metodo per ottenere un modello riproducibile di lesioni del midollo spinale traumatica con un Infinite Horizon urto con una forza di 70 Kdyne (grave). Utilizzando un paradigma forza maggiore (80 Kdyne), siamo in grado di causare un danno più grave che purtroppo è associato con la mortalità più elevati topi. Per evitare questo problema, che comunemente scelto un paradigma forza moderata (70 Kdyne) associato ad una lesione ripetibile con un progressivo recupero della funzione e mort.......

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano assenza di competizione interesse finanziario.

Ringraziamenti

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Gli Autori ringraziano il sostegno economico di FAIP (Federazione Associazioni Italiane Paraplegici), Fondazione "Neurogel-en-Marche" (Francia), Fondazione "La Colonna".

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
PKH26GL-1KT	Sigma	091M0973
Dispositivo di impatto dell'orizzonte infinito (IH)	Sistemi e strumentazione di precisione, LLC	Modello 0400 Seriale 0171
Gentamicina 10 mg/ml	Euroclone	ECM0011B	1 mg/ml in soluzione salina sterile
Isoflurano-Vet 250 ml	Merial	B142J12A
Blefarolin POM OFT 10 g
Scaldavetrini	2Biological Instruments	HB101-sm-402
Bisturi, dimensioni 10	Lance Paragon	26920
Pinze Graefe piccole	2Biological Instruments	11023-14
Rongeur	Medicon Instruments	07 60 07
Micro forbici	2Biological Instruments	15000-00
Suture assorbibili (4/0)	Safil Quick	C0046203
Hemostat	2Biological Instruments	13014-14
Applicatore di clip per ferite Reflex 7	2Biological Instruments	12031-07
Clip per ferite riflesse da 7 mm	2Biological Instruments	12032-07
NGS	Euroclone	ECS0200D
Triton X 100	Merck Millipore	1086431000
Anti Microtubule Assocoated Protein (MAP) 2	Millipore	AB5622
Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11008
Reagente FluorSave	Calbiochem	345789
Cellule staminali neurali terreno			DMEM-F12 (Euroclone) contenente 2 mm di l-glutammina (Euroclone), 0,6% di glucosio (Sigma-Aldrich), 9,6 gm/ml di putrescina (Sigma-Aldrich), 6,3 ng/ml di progesterone (Sigma-Aldrich), 5,2 ng/ml di selenito di sodio (Sigma-Aldrich), 0,025 mg/ml di insulina (Sigma-Aldrich), 0,1 mg/ml di transferrina (Sigma-Aldrich) e 2 μ g/ml di eparina (sale sodico, grado II; Sigma-Aldrich), bFGF (ricombinante umano, 10 ng/ml; Life Technologies) e EGF (ricombinante umano, 20 ng/ml; Tecnologie per la vita)
DMEM-F12	Euroclone	ASM5002
l-glutammina	Euroclone	ECB3000D
glucosio	Sigma-Aldrich	G8270-100G
putrescine	Sigma-Aldrich	P5780-25G
progesterone	Sigma-Aldrich	P6149-1MG
Sodio-selenito	Sigma-Aldrich	S9133-1MG
transferrina	Sigma-Aldrich	T 5391
Insulina	Sigma-Aldrich	I1882
Eparina sale di sodio	Sigma-Aldrich	H0200000
bFGF	Life Technology	PHG0024
h-EGF	Life Technology	PHG6045
Siringa 0,33 cc 29 G	Terumo	MYJECTOR
buprenorfina	Schering Plough SpA	TEMGESIC
gel occhi	Bausch & Lomb	LIPOSIC

Riferimenti

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Cord Injury Statistical Center: spinal cord injury facts and figures at glance. , https://www.nscisc.uab.edu/PublicDocuments/fact_figures_docs/Facts%202013.pdf (2013).
Yip, P. K., Malaspina, A. Spinal cord trauma and the molecular point of no return. Molecular Neurodegeneration. 7, 6(2012).
Fehlings, M. G., Cadotte, D. W., Fehlin....

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Cellule staminali neurali modello di contusione Infinite Horizon Impactor iniezione in vena caudale marcatura cellulare tracciante PKH 26 precursori neurali post mortem chirurgia murina funzione degli arti posteriori

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