Neural Stem Cell Transplantation in Sperimentale Contusivi Model of Spinal Cord Injury

Sommario

Lesioni del midollo spinale è una condizione traumatica che provoca grave morbilità e mortalità elevata. In questo lavoro descriviamo in dettaglio un modello contusione di lesioni del midollo spinale nei topi seguita da un trapianto di cellule staminali neurali.

Abstract

Lesioni del midollo spinale è una condizione clinica devastante, caratterizzato da un complesso di disfunzioni neurologiche. Modelli animali di lesione del midollo spinale possono essere utilizzati sia per indagare le risposte biologiche di lesioni e per testare potenziali terapie. Contusione o compressione lesioni consegnato al midollo spinale chirurgicamente esposti sono i più utilizzati modelli della patologia. In questa relazione la contusione sperimentale viene eseguita utilizzando il Infinite Horizon (IH) dispositivo di simulazione, che permette la creazione di un infortunio al modello animale riproducibile attraverso la definizione di parametri specifici sugli infortuni. Il trapianto di cellule staminali è comunemente considerata una strategia potenzialmente utile per la cura di questa condizione debilitante. Numerosi studi hanno valutato gli effetti di trapianto una varietà di cellule staminali. Qui mostriamo un metodo adeguato per le lesioni del midollo spinale seguita da iniezione vena della coda di cellule nei topi CD1. In breve, mettiamo a disposizione le procedure per: i) l'etichettatura delle cellule with un tracciante vitale, ii) la cura pre-operatoria di topi, iii) l'esecuzione di una lesione del midollo spinale contusivo, e iv) la somministrazione endovenosa di post mortem precursori neurali. Questo modello contusione può essere utilizzato per valutare l'efficacia e la sicurezza del trapianto di cellule staminali in un approccio di medicina rigenerativa.

Introduzione

Una lesione al midollo spinale (SCI) è la lesione più comune causata da un trauma ad alta energia come autoveicoli incidenti, cadute, sport e violenza ^1. In grave SCI, la forza lesioni distrugge o danneggia il tessuto neurale, causando la perdita improvvisa della funzione neurologica. Traumatic SCI si verifica spesso nei giovani adulti tra i 10 ei 40 anni di età. Essa colpisce notevolmente condizione mentale e fisica del paziente e provoca un enorme impatto economico per la società ^2. L'approccio di trattamento in fase acuta è spesso limitata ad un alto dosaggio di corticosteroidi, la stabilizzazione chirurgica e decompressione per attenuare eventualmente ulteriori danni ^3-4, ma i ruoli di questi metodi di recupero motorio dopo SCI sono ancora controversi. Oltre alla perdita di tessuto acuta, la lesione traumatica e l'attivazione di meccanismi secondari di degenerazione causa demielinizzazione e morte di diversi tipi di cellule ^5-6. Il grado di recupero della funzione può diten essere correlato al tempo della sostanza bianca risparmiata al sito della lesione ^7.

I modelli animali di SCI possono essere utilizzati sia per indagare le risposte biologiche del tessuto di pregiudizio e per testare potenziali terapie. Inoltre, un modello utile di una patologia umana animale non solo riprodurre alcuni aspetti di tale condizione, ma anche deve offrire vantaggi rispetto diretta osservazione clinica ed esperimento. I modelli più diffusi di lesioni del midollo spinale comportano contusione o compressione lesioni consegnato al midollo spinale chirurgicamente esposti ^8. Lo sviluppo di un infortunio di peso-drop contusione controllato rappresentano una tappa importante nella storia della ricerca SCI. Il centro di ricerca midollo spinale Ohio State University ha perseguito la sfida tecnologica di un dispositivo che può essere utilizzato per indurre un particolare compressione del midollo spinale con parametri di impatto controllati da un computer ^9. Questo è stato originariamente progettato per l'uso with ratti; successivamente è stato modificato per applicare verso topi ^10. I vantaggi di questo tipo di approccio sono che la biomeccanica di lesioni possono essere studiati più in profondità e parametri di lesioni possono essere definiti in maniera più completa per ottenere un modello sperimentale riproducibile, permettendo quindi più precisa valutazione degli effetti trattamenti testati sul processo di recupero funzionale.

Molti studi hanno valutato gli effetti di trapianto di una varietà di cellule staminali in modelli SCI ^11. Abbiamo recentemente isolato adulte neurali cellule staminali dal Sub-ventricolare Zone (SVZ) parecchie ore dopo la morte del donatore del mouse ^12-13. Questa procedura prevede una popolazione di cellule staminali neurali, chiamato dopo mortem precursori neurali (PM-NPC), che sembrano essere vantaggiosa in un approccio di medicina rigenerativa per curare SCI. In questo articolo mostreremo: i) il protocollo per l'etichettatura delle cellule con il tracciante PKH26 vitale, ii) la surgProcedura iCal per eseguire a lesione traumatica, e iii) la via endovenosa (iv) la somministrazione di cellule marcate. Inoltre, in questo lavoro abbiamo dimostrato che le cellule trapiantate migrano verso siti di lesione del midollo spinale e si differenziano principalmente in microtubuli proteina associata (MAP) 2 cellule positive. Inoltre, la differenziazione è accompagnata dalla promozione di una ripresa stabile della funzione degli arti posteriori.

Protocollo

NOTA: Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato dell'Università degli Studi di Milano Review e il rispetto delle linee guida italiane per gli animali da laboratorio in conformità alla Direttiva Europea Comunità del novembre 1986 (86/609 / CEE).

1. Preparazione di cellule per il trapianto

NOTA: utilizzare le cellule staminali neurali tra il 5 ° e il 9 ° di passaggio nella cultura di questi esperimenti; testare le colture per la proliferazione e la capacità di differenziazione, prima di essere etichettati per il trapianto. Determinare il grado di differenziazione mediante immunocitochimica ^12.

1. Risospendere le cellule ad una concentrazione di 1 x 10 ⁶ cellule / 150 ml (trapianto 1 x 10 ⁶ cellule per topo). Preparare almeno 1,2 x 10 ⁶ cellule per topo è necessaria perché un eccesso di cellule per scopi siringa carico.
2. Lavare le cellule 3 volte utilizzando cellule staminali neurali media ¹³ in un flaconcino da 10 ml conica. In ciascunfase di lavaggio, le cellule precipitato per centrifugazione (500 xg per 5 min, RT).
3. Contare le cellule prima della centrifuga finale.
4. Centrifugare le cellule (500 g per 5 min), e poi aspirare il surnatante, facendo attenzione a non rimuovere tutte le cellule, ma non lasciando più di 25 ml di surnatante.
5. Preparare una sospensione cellulare 2x aggiungendo 1 ml di diluente C al pellet e risospendere con dolce pipettaggio.
6. Immediatamente prima della colorazione, preparare una 2x Dye Solution (4 x ^10-6 M) in diluente C aggiungendo 4 ml di soluzione etanolica di colorante PKH26 a 1 ml di Diluente C in un tubo e mescolare bene per disperdere.
7. Aggiungere rapidamente i 1 ml di sospensione cellulare 2x a 1 ml di 2x Dye Solution e miscelare immediatamente il campione pipettando (densità cellulare finale sarà 1.2 x 10 ⁷ cellule / ml e 2 x ^10-6 M PKH26).
8. Incubare la sospensione cellulare / colorante per 1-5 min.
9. Arrestare la colorazione aggiungendo un volume uguale (2ml) di soluzione di BSA 1% in HBSS e incubare per 1 min.
10. Cellule centrifuga (500 xg per 10 min) e rimuovere con attenzione il surnatante.
11. Risospendere pellet cellulare in 10 ml di HBSS e centrifugare (500 xg per 5 min).
12. Lavare il pellet altre 2 volte con 10 ml di terreno completo per garantire la rimozione di colorante.
13. Risospendere il pellet cellulare in 10 ml di mezzo completo per la valutazione del recupero di cellule, vitalità cellulare e l'intensità di fluorescenza. Se sono necessarie cellule per il trapianto, lavare e risospendere in soluzione fisiologica sterile ad una concentrazione di 3,3 x 10 ⁵ cellule / 50 microlitri.

2. Preparazione per la chirurgia

1. Pulire e sterilizzare attrezzature chirurgia.
2. Preparare l'area chirurgia strofinando con un agente asettica. Configurare il dispositivo IH di simulazione.
3. Preparare la apparecchiature per l'anestesia: l'Scavenger Gas attivo con VetScav pesata dei filtri dispositivo, flusso continuo di induzione Camera, Oxygen Generatore, Low Flow O ₂ Meter per topi. Pulire la camera di induzione e la maschera utilizzata durante la chirurgia.
4. Anestetizzare animali con 2,5% (v / v) isoflurano in ossigeno (1 L / min), e attendere 5 min dopo l'induzione di flusso per il farmaco abbia effetto. Controllare se i baffi sono spasmi o se vi è lento ritiro degli arti posteriori in risposta pizzicare la zampa. Durante l'intervento, ridurre la concentrazione di isoflurano al 2,0% (v / v) isoflurano in ossigeno (1 L / min).

3. Preparazione di topi per Chirurgia e Trapianti

1. Tenere il maschio adulto CD1 topi (25-30 g) per almeno 3 giorni prima degli esperimenti in condizioni standard (22 ± 2 ° C, 65% di umidità, e la luce artificiale tra 8:00-8:00).
   NOTA: L'intera procedura, dalla preparazione chirurgica di sutura ci vorranno circa 40 min.
   1. Per identificare l'animale, contrassegnare la coda mediante inchiostro colorato resistente all'acqua.
2. Utilizzare un elettric Clipper per tagliare il pelo dorsale del mouse dal collo, circa a livello T2, alla zona lombare.
3. Sterilizzare l'area preparata con una soluzione di ioduro ed etanolo (70% in acqua sterile).
4. Trattare l'animale con un sub cutanea (sc) iniezione di 200 microlitri gentamicina (1 mg / ml in soluzione salina sterile).
5. Applicare il lubrificante oftalmica per entrambi gli occhi degli animali per prevenire l'essiccamento e iniettare buprenorfina (per via sottocutanea, 0,03 mg / kg), per alleviare il dolore.

4. Laminectomy

1. Posizionare il mouse su un vetrino più caldo per evitare il problema di ipotermia durante l'intervento chirurgico. Posizionare l'animale con la dorsale verso l'alto.
2. Effettuare una incisione verticale con un bisturi sopra la regione di interesse, da T7 a T12.
3. Tenere la pelle e pad superficiale grasso utilizzando pinze normali (di solito si trova nello spazio compreso tra il 5 ^° e 6 ^° processi dorsali toraciche).
4. Contare il processo sotto il vaso come T6poi passare a T7.
5. Inserire un piccolo cuscinetto sotto il lato ventrale del mouse per aumentare la curvatura della colonna vertebrale. Immobilizzare il midollo spinale bloccando con le pinze Graefe.
6. Tagliare i muscoli paravertebrali bilateralmente da T7 e T10 livello vertebrale utilizzando il bisturi finché la superficie dorsale dei contatti lamina la punta bisturi.
7. Usare il bisturi per spuntare la giunzione da T7 fino T10. Arrestare nello spazio tra T8 e T9 sporgenze spinosi. Tagliare i tessuti tra T8-T9 e T9-T10 con micro forbici.
   1. Utilizzare il Rongeur per rimuovere il processo di T9. Esporre la giunzione raschiando accuratamente via lo strato muscolare con le forbici micro. Continuare fino a quando l'osso è esposto.
8. Utilizzare le pinze per rimuovere muscoli dalla lamina ed aprire un piccolo spazio tra le vertebre. Inserire delicatamente le forbici micro sotto l'osso, tagliare la lamina su entrambi i lati e rimuovere questa parte con una pinza.
9. Rimuovere la lamina con la forceps per esporre il cavo. Assicurarsi di non lasciare frammenti ossei liberi o frastagliati dietro; rimuoverli con il Rongeur.
10. Utilizzare piccole pinze punta per rimuovere il periostio nonché eventuali frammenti di ossa o muscoli che può essere vicino l'incisione.
11. Rimuovere la metà superiore del processo dorsale T9 e procedere con il protocollo del dispositivo IH di simulazione.

5. IH urto Dispositivo Protocol (contusione)

1. Posizionare il mouse al centro della piattaforma di stabilizzazione del dispositivo IH Impactor.
2. Bloccare l'animale con due denti pinze collegati con la piattaforma di stabilizzazione da due bracci di posizionamento congiunto (braccio sinistro per la vertebra toracica, braccio destro per vertebra cervicale).
3. Utilizzare il braccio rostrale per afferrare il bordo laterale del corpo vertebrale rostrale (T8).
4. Manipolare il braccio caudale nello stesso modo di cogliere il corpo vertebrale T10.
5. Posizionare la piattaforma stabilizzazione del dispositivo e abbassare la punta (diametro 0,75mm) il più vicino al cavo come possibile senza toccarlo.
6. Sollevare la punta tre giri completi prima di iniziare l'impatto.
7. Eseguire la contusione con dispositivo di simulazione impostato per fornire una forza di 60 kdyn a 100 mm / sec.

6. suture e post-cura

1. Suturare l'incisione con un filo di sutura riassorbibile 4/0. Coprire il midollo spinale esposto al sito di lamina rimosso; suturare il tessuto alle estremità del taglio mediante un piccolo ago. Mettete i due punti immediatamente sopra e sotto il luogo di esposizione del midollo spinale.
2. Chiudere la pelle con due o tre clip Reflex senza pizzicare fuori i muscoli sottostanti.
3. Idratare il mouse post-intervento chirurgico con 2 ml di soluzione salina per via sottocutanea iniettati nella parte bassa della schiena.
4. Posizionare il mouse di nuovo in una gabbia di pre-riscaldato per evitare l'ipotermia durante il recupero chirurgico. Posizionare gabbie su rilievi di riscaldamento.
5. Monitorare i topi durante il post-infortunio fase acuta controllando ildimensioni della vescica, la sutura e il peso dell'animale due volte al giorno. Premere delicatamente vescica (due volte al giorno per 7 giorni) per evitare infezioni (urine potrebbe essere nuvoloso, sanguinosa o contenenti precipitati) del tratto urinario.
6. Trattare topi una volta al giorno con una iniezione di soluzione salina (2 ml per due giorni dopo l'intervento chirurgico iniezione sc) e antibiotici (gentamicina 0,2 ml; sc iniezione) per cinque giorni dopo infortunio.
7. Trattare topi per analgesia post-operatoria con buprenorfina (0,1 mg / kg; due volte al giorno) per 3 giorni post-lesione.

7. Coda Vein iniezione di cellule

NOTA: Nel passaggio successivo viene dimostrata la procedura per l'iniezione delle cellule nella vena della coda. Le cellule possono anche essere somministrati con un trapianto intraspinale utilizzando un telaio stereotassico ^15-16, o nella cisterna magna ^17. È importante considerare che altri tipi di cellule possono essere trapiantate con questo metodo, come le cellule stromali mesenchimali(ad esempio, le cellule staminali mesenchimali del midollo osseo, cellule staminali derivate dal tessuto adiposo, amniotico cellule del liquido). Inoltre, altre opzioni di trattamento, come le nanoparticelle possono essere iniettati attraverso la vena della coda dopo la lesione del midollo spinale.

1. Utilizzare 70% etanolo e PBS per pulire l'ago prima dell'uso. Maniglia l'ago e siringa solo con guanti sterili.
2. Risospendere le cellule in provetta e il carico 75 microlitri di cellule in una siringa da 0,3 ml (29 G ago e siringa 0,33 cc).
3. Accertarsi che non bolle sono presenti all'interno della sospensione cellulare. Mantenere la siringa in posizione orizzontale per evitare la sedimentazione delle cellule.
4. Posizionare il mouse sotto la lampada di calore per dilatare le vene coda.
5. Afferra il mouse e delicatamente tirarlo nel dispositivo di immobilizzazione del mouse per visualizzare la vena della coda laterale come una linea blu sottile.
6. Pulire la coda con un tampone imbevuto di alcool. Quando la vena è visualizzato, afferrare la vena caudale tra il dito medio e il pollice della mano sinistra.
7. Portare l'ago in superficie con un angolo da 15 ° all'orizzonte e assicurarsi che il bisello è alto.
8. Iniettare 50 ml di cellule ad una velocità di .33 ml / sec. Dopo l'iniezione, ritardare la retrazione dell'ago da 10 sec. Ritrarre l'ago lentamente e prestare attenzione alla possibile efflusso di sospensione cellulare.
9. Pulire la siringa come al punto 7.1 tra i carichi.

8. test comportamentali e Hind Limb Funzione

1. Posizionare il mouse in campo aperto.
2. Valutare la funzione locomotoria e il recupero degli arti posteriori, dopo contusione con il test in campo aperto secondo la scala del mouse Basso (BMS) ^18.
   NOTA: la funzione neurologica deve essere valutato periodicamente, dal giorno 3 dopo la lesione per 4 settimane ^18.

9. Perfusion

1. Al termine del periodo sperimentale, anestetizzare animali mediante iniezione intraperitoneale di sodio pentobarbital (65 mg / kg). Utilizzare pizzichi punta a evaluate il livello di anestesia e procedere solo dopo che il mouse non risponde agli stimoli nocivi.
2. Trattenere l'animale in posizione supina su un piano chirurgico.
3. Tagliare attraverso l'involucro e la parete addominale appena sotto la gabbia toracica. Separare il diaframma dal fegato.
4. Utilizzare le forbici per tagliare la membrana per esporre la cavità pleurica.
5. Tagliare i lati della gabbia toracica fino alle ossa collare.
6. Utilizzare i hemostats per bloccare la cartilagine xifoide e posizionare il hemostat sopra la testa.
7. Tenere il terzo inferiore del cuore su un piano trasversale con le pinze. Inserire l'ago nel ventricolo sinistro.
8. Utilizzare un emostatico per bloccare il cuore. Questo assicura l'ago e impedisce la fuoriuscita.
9. Usare le forbici per tagliare l'atrio destro.
10. Lasciare il PBS a pompa (18 ml / min) attraverso l'animale. Mantenere questa pressione durante il periodo di buffer di infusione (3-4 min; corrispondente a circa 70 ml di PBS). Continuare fino a quando il cuore è puro.
11. Passare il rubinetto per consentire il fissativo (4% paraformaldeide in acqua distillata, 4% PFA) attraverso la pompa. Lasciare PFA 4% per pompare attraverso l'animale per circa 8-10 minuti (300 ml). Aumentare gradualmente la pressione per raggiungere un massimo di 30 ml / min. Un fegato indurito è la migliore indicazione di una perfusione successo.

10. Tissue Raccolta ed elaborazione, Istologia e Iimmunohistochemistry

1. Sezionare midollo spinale da T5 a L1. Poi post-fissare il tessuto in 6 ml a 4% PFA (O / N a 4 ° C).
2. Mettere stesso tessuto in una soluzione al 30% di saccarosio per 72 ore a 4 ° C per crio proteggerlo e per impedire la formazione di cristalli durante il congelamento.
3. Congelamento rapido il cavo con ghiaccio secco e conservarlo a -80 ° C.
4. Sezione mediante un criostato con spessore 15 micron e raccogliere sezioni su vetrini e proseguire per immunocitochimica.
5. Sciacquare le sezioni con 200 ml di PBS per ogni sLiDE (3 volte; 5 minuti ciascuno, RT).
6. Permeabilize ciascun vetrino con 200 ml di 10% NGS e 0,2% Triton X-100 in PBS per 1 ora a RT.
7. Sciacquare sezioni con 200 ml di PBS per ogni diapositiva (3 volte; 5 minuti ciascuna, RT).
8. Bloccare siti non specifici con 200 ml di soluzione bloccante per slitta (5% NGS; 0,1% Triton X-100 in PBS) per 30 min (RT).
9. Incubare ogni diapositiva con 200 ml di anticorpi primari O / N a 4 ° C (diluire l'anticorpo in 5% NGS; 0,1% Triton X-100 in PBS).
10. Lavare le sezioni con 200 ml di PBS per ogni diapositiva (3 volte, 5 min ciascuno; RT).
11. Incubare con opportuni anticorpi secondari per 2 ore a temperatura ambiente.
12. Lavare le sezioni con 200 ml di PBS per ogni diapositiva (3 volte, 5 min ciascuno; RT).
13. Nuclei macchia con 200 ml di 4 ', 6-diamidin-2-phenilindole (DAPI) (1 mg / ml concentrazione finale, 10 minuti a temperatura ambiente).
14. Montare utilizzando il reagente FluorSave e analizzare al microscopio confocale.
    NOTA: Indeterminazioni controllo, anticorpi primari devono essere omessi e sostituiti con concentrazioni equivalenti di IgG non correlata della stessa sottoclasse. Protein 2 anticorpo primario associata ai microtubuli è stato utilizzato.

Risultati

Il numero totale di cellule trapiantate è 1 x 10 ⁶ cellule ed è stato suddiviso in tre iniezioni consecutive nella vena della coda. Abbiamo somministrato 3,3 x 10 ⁵ cellule in 50 ml di soluzione di tampone fosfato (PBS). La prima iniezione è stata effettuata in 30 min dopo la lesione, la seconda 6 ore dopo e l'ultimo 18 ore dopo la lesione. La scelta di un limite di tempo di 18 ore dopo SCI per l'amministrazione PM-NPC è stata determinata dalla permeabilità ottimale della barriera emato-encefalica ...

Discussione

In questo articolo abbiamo descritto un metodo per ottenere un modello riproducibile di lesioni del midollo spinale traumatica con un Infinite Horizon urto con una forza di 70 Kdyne (grave). Utilizzando un paradigma forza maggiore (80 Kdyne), siamo in grado di causare un danno più grave che purtroppo è associato con la mortalità più elevati topi. Per evitare questo problema, che comunemente scelto un paradigma forza moderata (70 Kdyne) associato ad una lesione ripetibile con un progressivo recupero della funzione e mort...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
PKH26GL-1KT	Sigma	091M0973
Dispositivo di impatto dell'orizzonte infinito (IH)	Sistemi e strumentazione di precisione, LLC	Modello 0400 Seriale 0171
Gentamicina 10 mg/ml	Euroclone	ECM0011B	1 mg/ml in soluzione salina sterile
Isoflurano-Vet 250 ml	Merial	B142J12A
Blefarolin POM OFT 10 g
Scaldavetrini	2Biological Instruments	HB101-sm-402
Bisturi, dimensioni 10	Lance Paragon	26920
Pinze Graefe piccole	2Biological Instruments	11023-14
Rongeur	Medicon Instruments	07 60 07
Micro forbici	2Biological Instruments	15000-00
Suture assorbibili (4/0)	Safil Quick	C0046203
Hemostat	2Biological Instruments	13014-14
Applicatore di clip per ferite Reflex 7	2Biological Instruments	12031-07
Clip per ferite riflesse da 7 mm	2Biological Instruments	12032-07
NGS	Euroclone	ECS0200D
Triton X 100	Merck Millipore	1086431000
Anti Microtubule Assocoated Protein  (MAP) 2	Millipore	AB5622
Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11008
Reagente FluorSave	Calbiochem	345789
Cellule staminali neurali terreno			DMEM-F12 (Euroclone) contenente 2 mm di l-glutammina (Euroclone), 0,6% di glucosio (Sigma-Aldrich), 9,6 gm/ml di putrescina (Sigma-Aldrich), 6,3 ng/ml di progesterone (Sigma-Aldrich), 5,2 ng/ml di selenito di sodio (Sigma-Aldrich), 0,025 mg/ml di insulina (Sigma-Aldrich), 0,1 mg/ml di transferrina (Sigma-Aldrich) e 2 μ g/ml di eparina (sale sodico, grado II; Sigma-Aldrich), bFGF (ricombinante umano, 10 ng/ml; Life Technologies) e EGF (ricombinante umano, 20 ng/ml; Tecnologie per la vita)
DMEM-F12	Euroclone	ASM5002
l-glutammina	Euroclone	ECB3000D
glucosio	Sigma-Aldrich	G8270-100G
putrescine	Sigma-Aldrich	P5780-25G
progesterone	Sigma-Aldrich	P6149-1MG
Sodio-selenito	Sigma-Aldrich	S9133-1MG
transferrina	Sigma-Aldrich	T 5391
Insulina	Sigma-Aldrich	I1882
Eparina sale di sodio	Sigma-Aldrich	H0200000
bFGF	Life Technology	PHG0024
h-EGF	Life Technology	PHG6045
Siringa 0,33 cc 29 G	Terumo	MYJECTOR
buprenorfina	Schering Plough SpA	TEMGESIC
gel occhi	Bausch & Lomb	LIPOSIC