Articolo metodologico

Un ibrido metodo di estrazione del DNA per la valutazione delle comunità batteriche qualitativa e quantitativa di pollame campioni di produzione

DOI:

10.3791/52161

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10 dicembre 2014

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1Egg Safety and Quality Research Unit, USDA-Agricultural Research Service, 2Poultry Microbiological Safety and Processing Research Unit, USDA-Agricultural Research Service, 3Department of Biochemistry and Biophysics, Oregon State University, 4College of Public Health, University of Georgia, 5Department of Biological Sciences, Center for Microbial Genetics and Genomics, Northern Arizona University

In questo articolo

Sommario

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Un nuovo metodo di estrazione del DNA ibrido semi-automatico da utilizzare con campioni di produzione avicola ambientale è stato sviluppato e ha dimostrato miglioramenti rispetto a un comune metodo di estrazione meccanica ed enzimatica in termini di stime quantitative e qualitative delle comunità batteriche totali.

Abstract

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L'efficacia di protocolli di estrazione di DNA può essere altamente dipende sia dal tipo di campione indagati ei tipi di analisi effettuate a valle. Considerando che l'uso di nuove tecniche di analisi della comunità batterica (ad esempio, microbiomics, metagenoma) sta diventando sempre più prevalente nelle scienze agrarie e ambientali e molti campioni ambientali all'interno di queste discipline può essere physiochemically e microbiologicamente unico (ad esempio, fecale e campioni lettiera / biancheria da lo spettro della produzione di pollame), metodi di estrazione del DNA appropriati ed efficaci devono essere scelti con cura. Pertanto, un metodo di estrazione del DNA ibrido romanzo semi-automatico è stato sviluppato specificatamente per l'uso con i campioni di produzione di pollame ambientale. Questo metodo è una combinazione dei due tipi principali di estrazione del DNA: meccanica ed enzimatica. A due fasi intense passo omogeneizzazione meccanica (con bead-battendo specificamente formulato per environmencampioni TAL) inserito all'inizio del metodo di estrazione del DNA "standard" enzimatica per campioni fecali per migliorare la rimozione di batteri e DNA dalla matrice del campione e migliorare il recupero di batteri Gram-positivi membri della comunità batteriche. Una volta che è stata avviata la parte di estrazione enzimatica del metodo ibrido, il processo di purificazione rimanente è stato automatizzato utilizzando una stazione di lavoro robotizzata per aumentare il throughput del campione e diminuire errore di elaborazione del campione. Rispetto ai metodi di estrazione del DNA severe meccaniche ed enzimatiche, questo nuovo metodo ibrido fornito le migliori prestazioni complessive combinato quando si considera quantitativa (con 16S rRNA qPCR) e qualitativo (utilizzando microbiomics) le stime del totale comunità batteriche durante l'elaborazione di feci di pollame e campioni di lettiera .

Introduzione

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Quando si analizzano campioni clinici o ambientali complessi (ad esempio, feci, terreni), ci sono due metodologie principali utilizzate per l'estrazione del DNA. Il primo è una rottura meccanica della matrice utilizzando un'intensa fase di beadbeating, mentre il secondo è una rottura enzimatica della matrice per rilasciare chimicamente le cellule batteriche e inibire contemporaneamente gli inibitori della PCR dalla matrice. Dati i diversi mezzi con cui funzionano questi due tipi di metodi di estrazione, non sorprende che studi precedenti abbiano dimostrato che il metodo di estrazione del DNA appropriato dipende sia dal campione che dall'analisi. Studi compara....

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Protocollo

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1. omogeneizzazione meccanica di pollame ambientale campioni di produzione

  1. Prima di estrazione, impostare un bagno d'acqua a 95 ° C e lasciare il tempo bagnomaria per raggiungere tale temperatura.
  2. Pesare 0,33 g di terra o di materiale fecale in una provetta 2 ml di Lisi Matrix E.
    1. Non superare 0,33 g di campione nel tubo, perché altrimenti le seguenti soluzioni per superare la capacità del tubo.
    2. Scongelare i campioni congelati a RT prima della pesata.
    3. Per analizzare un totale di 1 g di suolo / feci, pesare 3 replicare 0,33 g campioni per ogni campione ambientale individuo.
    4. Conse....

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Risultati

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Per questo studio, escrementi fecali freschi e campioni di lettiera sono stati recuperati da una casa commerciale broiler (~ 25.000 uccelli) nel sud-est degli Stati Uniti. I polli da carne (Gallus gallus) erano Cobb-500 attraversa, ed erano 59 giorni di età al momento del campionamento. Freschi campioni di feci e lettiere sono stati recuperati da quattro aree distinte all'interno della casa (vicino a pad di raffreddamento, vicino alle linee waterer / alimentazione, tra le righe waterer / alimentazione, e nei pr.......

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Discussione

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Il metodo di estrazione del DNA usato effettuata totali stime comunità batteriche quantitativi e qualitativi sia per i campioni di feci e di lettiera, sostenendo l'analisi dei campioni natura dipendente di metodi di estrazione del DNA visto in precedenza 1,3,6. Per entrambi i campioni di feci e del disordine, l'ordine di esecuzione dei metodi di estrazione del DNA era diverso per il quantitativo (meccanica> Hybrid> enzimatica) e qualitativa (enzimatica> Hybrid> Meccanica) totali stime dell.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Gli autori ringraziano Latoya Wiggins e Katelyn Griffin per la loro assistenza nell'acquisizione dei campioni, così come Laura Lee Rutherford per la loro assistenza nel campionamento e nelle analisi molecolari. Vorremmo anche ringraziare Sarah Owens dell'Argonne National Lab per la preparazione e il sequenziamento dei campioni microbiomici. Queste indagini sono state supportate in egual misura dal Servizio di Ricerca Agricola, dai progetti USDA CRIS "Pathogen Reduction and Processing Parameters in Poultry Processing Systems" #6612-41420-017-00 e "Molecular Approaches for the Characterization of Foodborne Pathogens in Poultry" #6612-32000-059-00.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Lysing Matrix E tuboMPBio6914-050Diverse misure disponibili e gli ultimi 3 numeri del cat. No. indicare la dimensione (-050 = 50 provette, -200 = 200 provette, -1000 = 1.000 provette)
Soluzione di fosfato di sodioMPBio6570-205Può essere acquistata singolarmente, oppure contenuta anche all'interno del FastDNA Spin Kit per feci (Cat. No. 116570200)
PLS BufferMPBio6570-201
Buffer ASL (560 ml)Qiagen19082
FastPrep 24 omogeneizzatoreMPBio11600450048 x 2 ml HiPrep adapter (Cat. N. 116002527) disponibile per raddoppiare la produttività della fase di omogeneizzazione meccanica
QIAamp DNA Stool Mini KitQiagen51504
QIAcube24 (110V)Qiagen9001292I risultati preliminari mostrano che QIAcube HT (Cat. No. 9001793) può essere utilizzato per migliorare la produttività, ma a questa macchina sono necessari diversi materiali di consumo ed è necessario svolgere un lavoro più comparativo.
Puntali con filtro, 1.000 ml (1024)Puntalicon filtro Qiagen 990352
, 200 ml (1024)Qiagen990332
QIAcube Adattatori per rotore (10 x 24)Qiagen990394Per le provette per microcentrifuga da 1,5 ml incluse nel kit adattatore per rotore c'è un'alternativa. Si tratta di Sarstedt Micro tubo 1,5 ml Tappo di sicurezza, Cat. No. 72.690
Provette per campioni RB (2 ml)Qiagen990381Alternativa: Eppendorf Safe-Lok micro provetta, Cat. N. 022363352

Riferimenti

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  1. Maukonen, J., Simoes, C., Saarela, M. The currently used commercial DNA-extraction methods give different results of clostridial and actinobacterial populations derived from human fecal samples. FEMS microbiology ecology. 79, 697-708 (2012).
  2. Tang, J. N., et al.

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Ristampe e permessi

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Tag

Hybrid DNA ExtractionMechanical HomogenizationEnzymatic ExtractionBead BeatingRobotic WorkstationPCR Inhibitor Removal16S rRNA qPCRMicrobiome AnalysisPoultry Fecal SamplesEnvironmental Sample Processing

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