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Articolo metodologico

Un ibrido metodo di estrazione del DNA per la valutazione delle comunità batteriche qualitativa e quantitativa di pollame campioni di produzione

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DOI:

10.3791/52161

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10 dicembre 2014

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1Egg Safety and Quality Research Unit, USDA-Agricultural Research Service, 2Poultry Microbiological Safety and Processing Research Unit, USDA-Agricultural Research Service, 3Department of Biochemistry and Biophysics, Oregon State University, 4College of Public Health, University of Georgia, 5Department of Biological Sciences, Center for Microbial Genetics and Genomics, Northern Arizona University

In questo articolo

Sommario

Un nuovo metodo di estrazione del DNA ibrido semi-automatico da utilizzare con campioni di produzione avicola ambientale è stato sviluppato e ha dimostrato miglioramenti rispetto a un comune metodo di estrazione meccanica ed enzimatica in termini di stime quantitative e qualitative delle comunità batteriche totali.

Abstract

L'efficacia di protocolli di estrazione di DNA può essere altamente dipende sia dal tipo di campione indagati ei tipi di analisi effettuate a valle. Considerando che l'uso di nuove tecniche di analisi della comunità batterica (ad esempio, microbiomics, metagenoma) sta diventando sempre più prevalente nelle scienze agrarie e ambientali e molti campioni ambientali all'interno di queste discipline può essere physiochemically e microbiologicamente unico (ad esempio, fecale e campioni lettiera / biancheria da lo spettro della produzione di pollame), metodi di estrazione del DNA appropriati ed efficaci devono essere scelti con cura. Pertanto, un metodo di estrazione del DNA ibrido romanzo semi-automatico è stato sviluppato specificatamente per l'uso con i campioni di produzione di pollame ambientale. Questo metodo è una combinazione dei due tipi principali di estrazione del DNA: meccanica ed enzimatica. A due fasi intense passo omogeneizzazione meccanica (con bead-battendo specificamente formulato per environmencampioni TAL) inserito all'inizio del metodo di estrazione del DNA "standard" enzimatica per campioni fecali per migliorare la rimozione di batteri e DNA dalla matrice del campione e migliorare il recupero di batteri Gram-positivi membri della comunità batteriche. Una volta che è stata avviata la parte di estrazione enzimatica del metodo ibrido, il processo di purificazione rimanente è stato automatizzato utilizzando una stazione di lavoro robotizzata per aumentare il throughput del campione e diminuire errore di elaborazione del campione. Rispetto ai metodi di estrazione del DNA severe meccaniche ed enzimatiche, questo nuovo metodo ibrido fornito le migliori prestazioni complessive combinato quando si considera quantitativa (con 16S rRNA qPCR) e qualitativo (utilizzando microbiomics) le stime del totale comunità batteriche durante l'elaborazione di feci di pollame e campioni di lettiera .

Introduzione

Quando si analizzano campioni clinici o ambientali complessi (ad esempio, feci, terreni), ci sono due metodologie principali utilizzate per l'estrazione del DNA. Il primo è una rottura meccanica della matrice utilizzando un'intensa fase di beadbeating, mentre il secondo è una rottura enzimatica della matrice per rilasciare chimicamente le cellule batteriche e inibire contemporaneamente gli inibitori della PCR dalla matrice. Dati i diversi mezzi con cui funzionano questi due tipi di metodi di estrazione, non sorprende che studi precedenti abbiano dimostrato che il metodo di estrazione del DNA appropriato dipende sia dal campione che dall'analisi. Studi comparativi di estrazione del DNA hanno precedentemente dimostrato che alcuni metodi sono più appropriati per migliorare la qualità e la quantità del DNA da campioni ambientali1-3, mentre altri hanno dimostrato miglioramenti per analisi a livello di comunità come l'elettroforesi su gel a gradiente denaturante (DGGE)4-6, il polimorfismo della lunghezza del frammento a restrizione terminale (T-RFLP)7, l'analisi automatizzata degli spaziatori intergenici ribosomiali (ARISA)8 e i microarray filogenetici9. Pertanto, è necessario utilizzare o sviluppare metodi di estrazione del DNA appropriati in base ai tipi di campioni ambientali e ai tipi di analisi eseguite su tali campioni, soprattutto alla luce dei recenti progressi nelle analisi delle comunità batteriche.

Il sequenziamento di nuova generazione, in combinazione con valutazioni comunitarie più quantitative (ad esempio, PCR quantitativa (qPCR)), sta diventando sempre più diffuso nelle scienze ambientali e cliniche, tuttavia, sono state condotte pochissime ricerche per determinare l'effetto dei metodi di estrazione del DNA su questi set di dati. La maggior parte degli studi comparativi sull'estrazione del DNA si è occupata di stime della comunità microbiomica da campioni umani o modello umano10,11, non di campioni di animali agricoli. I pochi studi di sequenziamento di nuova generazione incentrati sul pollame hanno affrontato specifiche domande metagenomiche12,13 o microbiomiche14; non hanno discusso l'effetto del metodo di estrazione del DNA sulle analisi microbiomiche risultanti. Considerando la natura complessa dei campioni ambientali relativi alla produzione avicola (ad esempio, feci, lettiera/lettiera, terreno da pascolo), i metodi di estrazione del DNA devono essere selezionati con attenzione. È noto che i campioni ambientali relativi al pollame contengono un gran numero di inibitori della PCR e sono state necessarie diluizioni dell'estratto di DNA fino a 500 volte per la PCR e la successiva analisi a valle15-17. Pertanto, è essenziale che i metodi di estrazione del DNA siano ottimizzati per questi tipi di campioni, al fine non solo di interrompere fisicamente la matrice, ma anche di essere in grado di ridurre/eliminare il gran numero di inibitori presenti.

Il Mini Kit QIAamp DNA Stool, un metodo di estrazione enzimatica, è stato considerato il "gold standard" per l'estrazione del DNA da campioni intestinali/fecali difficili1,18,19 ed è stato applicato con successo a campioni ambientali di pollame8,14. La rimozione enzimatica degli inibitori della PCR attraverso l'uso di una matrice proprietaria è uno dei maggiori vantaggi dell'utilizzo di questo metodo per questi tipi di campioni ambientali, così come la capacità di migliorare significativamente la produttività (e ridurre l'errore di elaborazione del campione) utilizzando stazioni di lavoro automatizzate. Uno dei principali svantaggi è la mancanza di una fase di omogeneizzazione meccanica per dissociare fisicamente le cellule batteriche dalla matrice ambientale. Durante l'analisi di campioni intestinali e fecali di origine non avicola, l'aggiunta di una fase di battitura delle perle o di interruzione meccanica all'interno di un protocollo di estrazione del DNA ha aumentato significativamente l'efficienza di estrazione9, la resa/qualità del DNA1,4,5 e ha migliorato significativamente le analisi della comunità a valle in termini di ricchezza, diversità e copertura5,6,11. Questi studi hanno confrontato non solo i metodi di battitura meccanica delle perle con il metodo enzimatico "gold standard", ma alcuni hanno anche aggiunto la fase di battitura meccanica delle perle al protocollo enzimatico per migliorare i risultati6,9,11.

Secondo i risultati degli studi di cui sopra, le analisi della comunità batterica (sia qualitative che quantitative) potrebbero essere migliorate da campioni ambientali relativi al pollame attraverso l'aggiunta di una fase di omogeneizzazione meccanica al metodo enzimatico. Pertanto, l'obiettivo di questo studio era duplice: (1) sviluppare una nuova tecnica di estrazione del DNA che utilizzasse gli aspetti più desiderabili sia dei metodi di estrazione meccanica (potente fase di omogeneizzazione) che enzimatica (rimozione e automazione degli inibitori della PCR) e (2) confrontare le valutazioni quantitative (tramite qPCR) e qualitative (tramite microbiomica) della comunità batterica di questo nuovo metodo con metodi meccanici ed enzimatici rappresentativi.

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Protocollo

1. omogeneizzazione meccanica di pollame ambientale campioni di produzione

  1. Prima di estrazione, impostare un bagno d'acqua a 95 ° C e lasciare il tempo bagnomaria per raggiungere tale temperatura.
  2. Pesare 0,33 g di terra o di materiale fecale in una provetta 2 ml di Lisi Matrix E.
    1. Non superare 0,33 g di campione nel tubo, perché altrimenti le seguenti soluzioni per superare la capacità del tubo.
    2. Scongelare i campioni congelati a RT prima della pesata.
    3. Per analizzare un totale di 1 g di suolo / feci, pesare 3 replicare 0,33 g campioni per ogni campione ambientale individuo.
    4. Conservare i campioni a -20 ° C all'interno dei tubi conici matrice prima dell'estrazione, se necessario.
  3. Aggiungere 825 microlitri Sodium Phosphate Buffer e 275 ml di soluzione PLS per una provetta. Miscelare utilizzando un vortex per ~ 15 sec e poi centrifugare i campioni a 14000 xg per 5 min.
  4. Versare il Supernatant e aggiungere 700 ml di tampone ASL. Mescolare con un vortice per 5 sec.
    1. Assicurarsi che vi sia spazio di testa (~ 10% del volume totale) disponibili nel tubo conico a questo punto. Se non c'è spazio di testa, i tubi si hanno la tendenza a perdere durante l'omogeneizzazione successivo passo che potrebbe portare a contaminazione incrociata e / o perdita di campione.
  5. Porre i campioni in un FastPrep 24 Instrument, e omogeneizzare i campioni ad una velocità di 6,0 m / sec per 40 sec.
  6. Centrifugare il campione omogeneizzato a 14000 g per 5 min. Trasferire il surnatante in una sterile 2 ml provetta.
  7. Per massimizzare il recupero di DNA dal campione, ripetere i punti da 1.4 a 1.6, che combina il surnatante nella stessa provetta sterile, 2 ml.

2. enzimatica Inibizione di inibitori di omogenati campione

NOTA: Questo protocollo utilizza il kit QIAamp DNA Sgabello Mini.

  1. Incubare lasupernatante in un bagno d'acqua a 95 ° per 5 minuti per massimizzare il recupero del DNA da eventuali cellule rimanenti nel surnatante.
    1. Incubare a 70 ° C per i campioni contenenti organismi prevalentemente Gram-negativi. Tuttavia, se sono presenti (che è il caso con pollame campioni fecali) organismi Gram-positivi, incubare a 95 ° C.
    2. Utilizzare clip di plastica bloccaggio sui tubi microcentrifuga per assicurare che i tubi non "pop" aperto e potenzialmente perdere volume del campione come pressione può accumularsi in questi tubi microcentrifuga sigillati.
  2. Aprire ogni provetta per scaricare la pressione, ri-cap tubi microcentrifuga e miscelare con un vortice per 15 sec.
  3. Centrifugare il campione a 14000 g per 1 minuto, rimuovere 1,2 ml del surnatante e inserirlo in un nuovo sterile 2 ml provetta.
  4. Aggiungere 1 scheda Inhibitex per ogni campione, e mescolare con un vortice fino a quando il campione ha un / liquido bianco sporco uniformemente bianco.
    1. Evitare touching scheda Inhibitex mentre metterlo nella provetta contenente il campione. Per fare questo, inserire il blister contenente la scheda direttamente sopra la provetta aperta e spingere delicatamente la scheda dal blister e in provetta.
  5. Incubare il campione per 1 min a RT (~ 25 ° C) e centrifugare a 14.000 xg per 5 min.
  6. Trasferire tutto il liquido sterile 1,5 ml provetta e centrifugare a 14.000 xg per 5 min.
    1. Evitare eventuali particelle residue che possono essere pellet sul fondo della provetta al termine della fase 2.5 durante il trasferimento del liquido.

3. Automated Purificazione DNA Utilizzando il QIAcube Robotic Workstation

NOTA: Il numero di materiali di consumo di plastica, la disposizione degli adattatori rotore campione all'interno della centrifuga, ed i volumi richiesti dei buffer / soluzioni dipendono numBER di campioni che sono in esecuzione.

  1. Aggiungi provette di eluizione e tubi di filtro per gli slot all'interno delle schede del rotore. Per ciascun campione, aggiungere 400 microlitri al slot centrale dell'adattatore rotore. Posizionare gli adattatori del rotore nella centrifuga workstation nella disposizione corretta in base al numero di campioni purificato.
    1. Assicurarsi che tutti i coperchi provetta siano fissati correttamente all'interno dell'adattatore del rotore dal momento che un fallimento di farlo potrebbe comportare taglio durante una delle fasi di centrifugazione del protocollo di purificazione.
  2. Aggiungere il numero di 1.000 microlitri e 200 microlitri puntali con filtro alla workstation, e riempire le bottiglie tampone in dotazione con il volume di buffer.
    NOTA: I buffer necessari per questo protocollo di purificazione (AL, AW1, AW2, e AE) sono tutti contenuti all'interno del Kit DNA QIAamp Sgabello Mini. L'utente deve fornire l'etanolo 100% che è necessario per il bu AWffers e come soluzione utilizzata nel processo di purificazione.
  3. Aggiungere il volume richiesto di soluzione K proteasi fornito in una sterile 1,5 ml provetta e metterlo nella fessura A nella workstation. Inoltre, aggiungere il numero (pari al numero di campioni purificazione) di 2 ml sicuro bloccaggio provettoni microcentrifuga RB alla sezione shaker della workstation.
    1. Assicurarsi che i coperchi dei tubi di esempio sono inseriti saldamente nelle apposite fessure sulla workstation, dal momento che un fallimento di farlo si tradurrà in un errore quando la macchina esegue la scansione inizialmente la workstation per assicurarsi che tutte le materie plastiche ei liquidi necessari sono disponibili per la richiesta correre.
  4. Utilizzando il touch screen sulla workstation, selezionare la Stool DNA - Sgabello Umano - patogeni Rilevazione Protocollo, e leggere le schermate successive per assicurare che la workstation è stata caricata correttamente. Una volta che tutti gli schermi di controllo vengono passati, selezionare Avvia per eseguire questo protocollo.
    1. Se l'estrazione di DNA da più di 12 campioni, iniziare il processo di omogeneizzazione (Fase 1) per la prossima serie di campioni, dal momento che una corsa di 12 campioni richiede ~ 72 minuti per completare sulla workstation.
  5. Rimuovere i campioni dagli adattatori rotore, li cap, e posto a -20 ° C fino al momento per le successive analisi a valle.
    1. A questo punto, combinare le purificazioni 3 replicati per un singolo campione (totale analizzato quantità = 1 g) utilizzando un sistema di centrifugazione / basato evaporazione-. Unire le repliche e le ri-eluire ad un volume finale di 100 ml di tampone Tris-ETDA.

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Risultati

Per questo studio, escrementi fecali freschi e campioni di lettiera sono stati recuperati da una casa commerciale broiler (~ 25.000 uccelli) nel sud-est degli Stati Uniti. I polli da carne (Gallus gallus) erano Cobb-500 attraversa, ed erano 59 giorni di età al momento del campionamento. Freschi campioni di feci e lettiere sono stati recuperati da quattro aree distinte all'interno della casa (vicino a pad di raffreddamento, vicino alle linee waterer / alimentazione, tra le righe waterer / alimentazione, e nei pr...

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Discussione

Il metodo di estrazione del DNA usato effettuata totali stime comunità batteriche quantitativi e qualitativi sia per i campioni di feci e di lettiera, sostenendo l'analisi dei campioni natura dipendente di metodi di estrazione del DNA visto in precedenza 1,3,6. Per entrambi i campioni di feci e del disordine, l'ordine di esecuzione dei metodi di estrazione del DNA era diverso per il quantitativo (meccanica> Hybrid> enzimatica) e qualitativa (enzimatica> Hybrid> Meccanica) totali stime dell...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano Latoya Wiggins e Katelyn Griffin per la loro assistenza nell'acquisizione dei campioni, così come Laura Lee Rutherford per la loro assistenza nel campionamento e nelle analisi molecolari. Vorremmo anche ringraziare Sarah Owens dell'Argonne National Lab per la preparazione e il sequenziamento dei campioni microbiomici. Queste indagini sono state supportate in egual misura dal Servizio di Ricerca Agricola, dai progetti USDA CRIS "Pathogen Reduction and Processing Parameters in Poultry Processing Systems" #6612-41420-017-00 e "Molecular Approaches for the Characterization of Foodborne Pathogens in Poultry" #6612-32000-059-00.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Lysing Matrix E tuboMPBio6914-050Diverse misure disponibili e gli ultimi 3 numeri del cat. No. indicare la dimensione (-050 = 50 provette, -200 = 200 provette, -1000 = 1.000 provette)
Soluzione di fosfato di sodioMPBio6570-205Può essere acquistata singolarmente, oppure contenuta anche all'interno del FastDNA Spin Kit per feci (Cat. No. 116570200)
PLS BufferMPBio6570-201
Buffer ASL (560 ml)Qiagen19082
FastPrep 24 omogeneizzatoreMPBio11600450048 x 2 ml HiPrep adapter (Cat. N. 116002527) disponibile per raddoppiare la produttività della fase di omogeneizzazione meccanica
QIAamp DNA Stool Mini KitQiagen51504
QIAcube24 (110V)Qiagen9001292I risultati preliminari mostrano che QIAcube HT (Cat. No. 9001793) può essere utilizzato per migliorare la produttività, ma a questa macchina sono necessari diversi materiali di consumo ed è necessario svolgere un lavoro più comparativo.
Puntali con filtro, 1.000 ml (1024)Puntalicon filtro Qiagen 990352
, 200 ml (1024)Qiagen990332
QIAcube Adattatori per rotore (10 x 24)Qiagen990394Per le provette per microcentrifuga da 1,5 ml incluse nel kit adattatore per rotore c'è un'alternativa. Si tratta di Sarstedt Micro tubo 1,5 ml Tappo di sicurezza, Cat. No. 72.690
Provette per campioni RB (2 ml)Qiagen990381Alternativa: Eppendorf Safe-Lok micro provetta, Cat. N. 022363352

Riferimenti

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