Microscopia a forza atomica di Red-Light Fotorecettori Uso della mappatura PeakForce Quantitative nanomeccanico Proprietà

Summary

In questo articolo viene descritto un metodo per studiare la struttura di un fotorecettore proteico utilizzando la microscopia a forza atomica (AFM). Il PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) rivela dimeri proteici intatti su una superficie di mica.

Abstract

Microscopia a forza atomica (AFM) utilizza una punta piramidale collegata ad un cantilever per sondare la risposta forza di una superficie. Le deviazioni di punta possono essere misurati a ~ 10 pN da un laser e rivelatore sectored, che può essere convertito in immagine topografia. Modulazione di ampiezza o AFM "tapping mode" comporta la sonda il contatto intermittente con superficie mentre oscilla alla sua frequenza di risonanza per produrre un'immagine. Utilizzato in combinazione con una cella di fluido, toccando modalità AFM permette l'imaging di macromolecole biologiche come le proteine ​​in condizioni fisiologicamente rilevanti. Toccando modalità AFM richiede la sintonizzazione manuale della sonda e frequenti aggiustamenti di una moltitudine di parametri di scansione, che può essere difficile per gli utenti inesperti. Per ottenere immagini di alta qualità, queste regolazioni sono il momento più consumo.

PeakForce quantitativa nanomeccanico Property Mapping (PF-QNM) produce un'immagine misurando un respon forzacurva se per ogni punto di contatto con il campione. Con il software ScanAsyst, PF-QNM può essere automatizzato. Questo software consente di regolare il set-point, frequenza di azionamento, velocità di scansione, i guadagni, e altri importanti parametri di scansione automatica per un dato campione. Non solo questo processo proteggere entrambe le sonde fragili e campioni, riduce significativamente il tempo richiesto per ottenere immagini ad alta risoluzione. PF-QNM è compatibile per l'imaging AFM in liquido; Pertanto, esso ha una vasta applicazione per l'imaging di materiali biologicamente rilevanti.

Il metodo presentato in questo articolo descrive l'applicazione del PF-QNM per ottenere immagini di un fotorecettore batterica a luci rosse, RpBphP3 (P3), da fotosintetico R. palustris nel suo stato-luminosa adatta. Usando questo metodo, i singoli dimeri proteici di P3 e aggregati di dimeri sono stati osservati su una superficie mica in presenza di un buffer di imaging. Con opportuni adeguamenti per superficie e / o concentrazione della soluzione, questo metodopuò essere generalmente applicato ad altre macromolecole biologicamente rilevanti e materiali morbidi.

Introduction

Microscopia a forza atomica (AFM) è diventato uno strumento molto importante per indagare le proprietà strutturali e meccaniche delle superfici, film sottili, e le singole molecole dalla sua invenzione nel 1986 (Figura 1). ^1-3 Utilizzo di una cella liquido, il metodo ha diventa particolarmente utile negli studi di macromolecole biologiche e cellule anche che vivono in un ambiente fisiologicamente rilevanti. ^4-10 Toccando modalità AFM è stato tradizionalmente usato per l'imaging materiali morbidi o molecole debolmente legate alla superficie, poiché il contatto-mode AFM è in genere inadatto dovuto per i danni causati dalle forze laterali esercitate sul campione dal cantilever. ¹¹ Tapping modalità AFM riduce sostanzialmente queste forze avendo la punta intermittenza toccare la superficie piuttosto che essere in costante contatto. In questa modalità, il cantilever è oscillato in corrispondenza o in prossimità della sua frequenza di risonanza normale alla superficie. Allo stesso modo di contattare modalità AFM, topografia è analeyzed tracciando il movimento dello z-piezo come funzione di xy (distanza).

La dinamica a sbalzo possono essere molto instabili o in prossimità di risonanza; Pertanto, essi sono molto impegnativo per automatizzare al di fuori di una situazione di "steady-state". In particolare, queste dinamiche dipendono sia dalle proprietà del campione e ambiente di scansione. Per una molecola adsorbita morbida per un (er) superficie dura, un ciclo di feedback ben sintonizzato per la molecola può portare a risposte di oscillazione per la superficie. Operazione nel liquido complica ulteriormente la messa a punto del cantilever. Le variazioni di livelli di temperatura o fluidi richiedono costante adeguamento del set point, guadagni, e altri parametri di imaging. Queste regolazioni tendono ad essere molto in termini di tempo e stimolante per gli utenti.

Peak Forza quantitativa nanomeccanico Property Mapping (PF-QNM), come tapping mode AFM, evita interazioni laterali dal intermittenza contattando il campione (Figura 2). ^{12-15 <}/ Sup> Tuttavia, PF-QNM funziona in modalità non-risonante e frequenze molto più basse rispetto toccando modalità AFM. Questo elimina i problemi di sintonia di maschiatura modalità AFM, in particolare quelli aggravato dalla presenza di fluido. Con PF-QNM, le immagini sono raccolte prendendo una curva di risposta forza in ogni punto di contatto. Con l'aggiunta di software ScanAsyst, ¹⁵ regolazione dei parametri di scansione può essere automatizzato e un'immagine ad alta risoluzione ottenuta in pochi minuti anche gli utenti inesperti. Una volta che l'utente diventa più familiarità con l'AFM, uno o tutti i parametri automatizzati potrebbero essere disattivate in qualsiasi momento, che permette di sperimentalista per ottimizzare la qualità dell'immagine manualmente. Fin dalla sua istituzione, PF-QNM è stato applicato per mappare batteriorodopsina, una proteina di membrana, e di altre proteine ​​native a livello submolecolare. ^16-18 Per batteriorodopsina, c'è una correlazione diretta tra flessibilità proteine ​​e raggi X delle strutture cristallografiche. PF ¹² -qnM è stato utilizzato per studiare le cellule viventi con alta risoluzione. ^19,20 connessioni importanti, inoltre, i dati PF-QNM ha chiariti tra struttura e la meccanica all'interno della membrana eritrocitaria che sono critici per l'integrità e la funzione delle cellule. ²¹

Abbiamo impiegato microscopia a scansione di sonda (SPM) metodi, tra cui ²² AFM, ²³ per studiare la struttura dei fotorecettori a luci rosse chiamato bacteriophytochromes (BphPs). ^24,25 Sono costituiti da un modulo di rilevamento della luce covalentemente legato ad un modulo di segnalazione-effector tale come istidina chinasi (HK). ²⁶ Il modulo luce di rilevamento contiene tipicamente un cromoforo bilin che subisce una trasformazione strutturale su assorbimento di un fotone, con una serie di modifiche strutturali che raggiungono il modulo di segnalazione-effettore e portano ad una trasformazione globale della proteina intera . ^24,27-29 Sulla base di questa trasformazione, ci sono due distinti assorbente la luce stati di BphPs, una luce che assorbe stato rosso e rosso lontano, indicati come Pr e Pfr. Pr è termicamente stabile, stato adattato al buio per la maggior parte BphPs. ²⁸ Le basi molecolari della Pr / Pfr fotoconversione non è del tutto compreso a causa della limitata conoscenza strutturale di queste proteine. Con l'eccezione di una struttura da D. radiodurans, ³⁰ tutti pubblicati a raggi X delle strutture cristallografiche di queste proteine ​​sono in stato adattato all'oscurità e mancano dominio effettore. I BphPs intatti sono troppo grandi per essere efficacemente studiato da Risonanza Magnetica Nucleare (NMR) e sono notoriamente difficili da cristallizzare nella loro forma intatta (in particolare nello stato di luce-adattato) per la cristallografia a raggi X. BphPs Recentemente sono stati progettati come marcatori proteici fluorescenti infrarossi (di IFP). ³¹ Caratterizzazione strutturale di queste proteine ​​può ulteriori aiuti in efficace progettazione IFP. ^32-36

Il focus di questo articolo è quello di presentare una procedura perimaging BphPs utilizzando AFM liquido-cell tramite PF-QNM. Il metodo è dimostrato da studi dello stato luce-adattata del RpBphP3 bacteriophytochrome (P3) dal batterio fotosintetico R. palustris. La procedura di AFM qui presentata è l'approccio pratico e diretto per l'imaging di proteine ​​e altre macromolecole biologiche. Con questo metodo, i dettagli strutturali di singole molecole possono essere raccolti in un breve periodo di tempo, simile ad un corso di scienze sessione di laboratorio di livello superiore. Attraverso la misurazione sezioni e completando ulteriori analisi dimensionali, i dati sperimentali possono essere paragonati a modelli computazionali utili. ^37-42

Protocol

1. Computer e Microscopio Set Up

1. Aprire la valvola della bombola N ₂ e regolare le manopole per assicurare la tabella aria è mobile e livello.
2. Accendere il computer, controller e luce a fibre ottiche in questo ordine.
3. Impostare lo scanner alla modalità / LFM AFM e centrare la telecamera sopra la testa AFM.
4. Software Open. Seleziona una categoria esperimento "Proprietà nanomeccaniche", "Quantitative nanomeccanico Mapping" nel gruppo esperimento, e "PeakForce QNM in Fluid" sotto esperimento. Fare clic su Carica Esperimento e quindi il programma di installazione.
5. Mettere a fuoco la fotocamera con l'obiettivo Z per vedere la superficie del palco. Utilizzando il grossolano su / giù piezo spostare il palco ca. 1 mm sotto la superficie dell'apertura testa AFM.

2 Preparazione di Mica Surface

1. Premere un autoadesivo adesivo sulla faccia di un disco pulito di supporto del campione (diametro 15 mm, spessore 0,8 mm). Spingere una mica V-4disco di grado (25 x 25 x 26 mm) sull'adesivo fino saldamente collegato.
2. Strofinare un pezzo di nastro adesivo trasparente sul mica assicurandosi che sia pienamente rispettato con bolle d'aria. Estrarre il nastro largo della mica da un lato per fendere uniformemente esso. Ripetere se necessario per assicurare la mica è piatta.
3. Afferrare il disco di supporto, lato mica pulizia, con un paio di pinzette circolari (pinze disco), e posizionare sullo scanner. La mica deve essere inferiore al livello dell'apertura di testa AFM.

3. fluido Assemblea cellulare e imaging di Mica Surface

1. Risciacquare la cella del fluido, O-ring, adattatore per siringa, l'adattatore del tubo, e il tubo di espulsione in 100% etanolo. Risciacquare la cella del fluido in acqua deionizzata. Che tutti parti di aria completamente asciutto.
2. Spingere l'adattatore del tubo nella porta sulla cella fluido pulito. Premere delicatamente l'O-ring nella rientranza centro della cella liquido utilizzando una pinzetta piatta diretti.
3. Premere la molla leggermente sulla clip sonda fermo e girare lontano dalla Groove per la punta.
4. Afferrare la sonda sul lungo termine lontano dalla punta piatta con una pinzetta a capo. Inserire la sonda nella scanalatura con la punta rivolta verso il centro della cellula. Spingere la molla in e regolare il fermo sopra la sonda per fissarlo (Figura 1B).
5. Controllare il morsetto sul AFM per assicurarsi che sia completamente retratto (Figura 1C).
6. Inserire la cella fluido, O-ring e sonda verso il basso, sulla parte superiore del campione mica. Lasciare che la cellula liquido di riposare sui perni della AFM. Abbassare il morsetto per stabilizzare la cella fluido sulla scena. Premere l'interruttore verso il basso sul microscopio fino un'ispezione visiva mostra l'O-ring saldamente compressa tra il disco di supporto e la cella fluido.
7. Mentre si guarda il monitor, concentrare la manopola di regolazione grossolana per visualizzare la parte superiore della cella fluido sullo schermo.
8. Spostare il microscopio fino a quando vi è una chiara immagine della punta utilizzando le manopole di regolazione X / Y e Z l'obiettivo. La punta si apporecchio come un metallico, triangolo d'oro. Spostare la punta più vicino alla superficie del campione usando la leva piezo giù sul microscopio. Focus sulla riflessione della punta. Tenere traccia del cantilever effettiva in relazione alla sua riflessione. In questa fase, devono essere strettamente allineati, ma non completamente sovrapposte.
9. Collegare l'adattatore ad una siringa sterile siringa da 1 ml. Attaccare un'estremità del tubo di espulsione all'adattatore siringa e posizionare l'altra estremità del tubo nel contenitore di soluzione tampone. Estendere completamente lo stantuffo della siringa.
10. Collegare il tubo flessibile per l'adattatore del tubo sulla cella fluido. Premere delicatamente il pistone finché il liquido riempie completamente la camera centrale. Controllare la cella per assicurare non vi siano bolle d'aria. Verificare che non vi è alcun liquido fuoriuscita dalla cellula liquido sul microscopio. Posizionare la siringa su un supporto solido sollevato.
11. Utilizzare il feed fotocamera e X / Y manopole di traduzione per individuare il laser sullo schermo (un punto rosso diffusa). Utilizzando il movem lasermanopole di controllo ORL, spostare il laser sulla punta.
12. Finemente regolare i controlli laser e specchi fino a quando il segnale somma visualizzata sul microscopio è massimizzato (valore = 4 - 6).
13. Regolare l'angolo del diodo quadranti utilizzando le manopole sul lato posteriore sinistro e il lato superiore sinistro della testa di scansione per ridurre le deformazioni verticali e orizzontali visualizzate sul microscopio il più vicino possibile allo zero (± 0,1).
14. Nel software, selezionare le opzioni di acquisizione. Come minimo, selezionare l'altezza (trace e ritracciamento), errore di picco di forza e deformazione. Le altre opzioni sono a carico dell'utente e possono essere personalizzati in base alle informazioni specifiche voluta dal sperimentalista.
15. Selezionare "linea" per RT Aereo Fit in ogni finestra di acquisizione. Selezionare "none" per l'OT Piano Fit nelle finestre di altezza. Impostare il X e Y offset e angolo di scansione a zero, se non già fatto.
16. Impostare la velocità di scansione di 1 Hz, il campione per linea a 256, il controllo automatico ScanAsysta individuo, e la ScanAsyst auto Z limite off. Modificare il limite Z a 500 nm. Impostare formato di scansione a 1 micron.
17. Fare clic impegnarsi. A questo punto, la punta si avvicina alla superficie. Mentre la punta si avvicina, osservare Z variazione di tensione piezo nell'angolo in basso a sinistra dello schermo. Se la punta va al di fuori della gamma, ritirare la punta e ri-approccio. Se questo non riesce, la punta può avere bisogno di essere modificato in modo da avere un approccio di successo. Una volta che la punta è impegnato, le linee inizieranno a comparire su ciascuna delle finestre di acquisizione che comporranno un'immagine.
18. Prendete le immagini di mica a 1 x 1 micron e zoom lentamente per assicurare che la superficie mica è pulita e piatta. Clicca cattura continua per salvare le immagini come appaiono. Zoom in e muoversi intorno alla superficie, se lo desideri.

4. proteine ​​Deposizione e Preparazione del campione per Imaging

1. Ottenere proteico purificato del campione ³⁸ e tenere su ghiaccio. Se conservato in un congelatore, scongelare campioneghiaccio per 5 min.
2. Diluire la proteina a 0,0010 mg / ml di soluzione tampone di imaging utilizzando refrigerato. Il buffer di imaging usata qui è 15 mM Tris-HCl (pH = 8,0), 150 mM NaCl, e MgCl 15 mM _2.
3. Riempire un 4 camera (100 x 15 mm) piastra di Petri con una soluzione tampone di imaging refrigerato. Riempire ciascuna camera con almeno 5 ml di soluzione. Mescolare delicatamente la soluzione proteica diluita con la punta attaccata alla micropipetta.
4. Applicare 200 microlitri della soluzione proteica diluita alla superficie della mica già preparato. Dopo 30 sec, prendere la superficie proteica / mica con le pinzette circolari (pinze disco). Tenere il campione parallelo al banco di laboratorio.
5. Tenendo il campione, immergere immediatamente il campione nella soluzione tampone contenuta nel primo quadrante della piastra Petri (fase 4.2) accertando che il campione sia parallelo al bacino della scatola di Petri. Dopo 1 sec, rimuovere il campione.
6. Continuando a premere il campione parallelo al bacinodella piastra Petri, ripetere il passaggio 4.5 per i restanti tre quadranti.
7. Posizionare il disco su un panno polvere asciutto per assorbire l'umidità in eccesso e trasferire il disco sul palco del microscopio. Non toccare la superficie effettiva con il panno. Non lasciare che il campione si asciughi.
8. Ripetere i passaggi 3,6-3,16.

5. Imaging Proteine ​​in Mica

1. Clicca sulla casella dei parametri di controllo sul lato sinistro dello schermo. Dimensioni Primavera e raggio della punta devono essere impostati basa sul utilizza la punta.
2. Fare clic impegnarsi. Analogamente al processo di imaging mica (passo 3.17), osservare la finestra di z-piezo con l'avvicinarsi punta.
3. Lasciare lo scanner per l'immagine stessa zona per almeno due passaggi consecutivi. Clicca cattura continua per salvare ogni immagine raccolta.
4. Spostare lo scanner ad una nuova regione e / o modificare le dimensioni dell'immagine, se lo desideri.
5. Dopo che il software automatizzato ha terminato di regolare l'parametri di scansione per una particolare dimensione dell'immagine, girare il software off.
6. Regolare manualmente velocità di scansione, limite z, il numero di linee, e la tensione al fine di ottimizzare la messa a fuoco dell'immagine. Se l'immagine diventa troppo fuori fuoco, girare il software di nuovo su per tornare alla posizione di partenza. Per aumentare la risoluzione di un'immagine durante lo zoom su una proteina, diminuire la frequenza di scansione e aumentare il numero di linee proporzionalmente.
7. Dopo l'esperimento, pulire la cella liquido con il 100% di etanolo e risciacquare con DI H ₂ O. Lasciare la cella liquido per asciugare completamente.
8. Aprire il software di dati per elaborare le immagini di dati grezzi. In primo luogo, appiattire l'immagine cliccando sull'icona Spiana. Selezionare Zero ^° ordine e fare clic su Esegui. A seconda dell'immagine, vestibilità aereo può essere necessaria per ottenere un'immagine in modo appropriato piatta. In questo caso, selezionare l'icona del piano in forma e disegnare un piano di una zona pianeggiante dell'immagine con il cursore. Fare clic su Esegui. Ripetere se necessario
9. Select scheda sezione per misurare le dimensioni della proteina. Disegnare una linea con il cursore sposta sopra la molecola o la zona da analizzare. Ripetere per più aree e il software genererà un overlay. Esportare l'immagine o dati utilizzati per generare un'immagine in un formato compatibile con altri programmi software e di disegno.

Results

Immagini AFM rappresentativi di una proteina fotorecettore, P3, nel suo stato adattato-luce sono presentati nelle figure 3 e 4. Un substrato di mica appena spaccati (Figura 3A) è una superficie piatta adatta per delle proteine. Raccolta un'immagine di mica pulito come controllo negativo è importante per diverse ragioni. In primo luogo, essa assicura la cella liquido è pulito e senza materiali residui da precedenti esperimenti sarà contaminare la superficie. In secondo l...

Discussion

AFM è una scansione di sonda metodo di microscopia pienamente in grado di immaginare proteine ​​e altre macromolecole biologiche in condizioni fisiologicamente rilevanti. In confronto a cristallografia a raggi X e NMR, una limitazione di AFM è la sua incapacità di raggiungere la stessa risoluzione, risoluzione particolarmente laterale. Quando si utilizza AFM per analizzare una molecola su qualsiasi superficie, l'impatto della superficie e la sonda sull'immagine della molecola devono essere considerati anche quan...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris-HCl	Fisher Scientific	O4997-100
NaCl	Acros Organics	7647-14-5
MgCl2	Acros Organics	7791-18-6
Multimode 8 AFM	Bruker-Nano	492-008-011	dotato di controller Nanoscope V e scanner J
Sonda	Bruker-Nano	SNL-10, ScanAsyst-Fluid+
Modalità di maschiatura Cella fluida	Bruker-Nano	MTFML
Mica V-4 Grade	SPI fornisce	1150503	25 x 25 x 25 x 0,26 mm
Disco di supporto del campione	nanoSurf	BT02236
Piastra di Petri	Plasta-Medic, Inc.		100 mm x 15 mm
micropipettatori	Denville Scientific	XL 3000i
RpBphP3			Preparato secondo i riferimenti citati
Software Nanoscope	Bruker-Nano
Fiber Optic Light	Digital Instruments Inc.	F0-50
Pinza a disco Pelco AFM	Ted Pella Inc	1668	da 12 mm
da 1 ml	McKesson	102-ST1C
Provette Eppendorf	Denville Scientific	C2171
Il sistema grafico molecolare Pymol v.1.5.0.1	Schrodinger, LLC