Grazie al collegamento drastica e negativa tra obesità e altre patologie concomitanti, la ricerca sul adiposo giochi di ruolo nella malattia e la salute generale è garantito. Presentiamo un protocollo per l'isolamento e l'escissione di depositi adiposi consentano lo studio della adiposo usare in situ e metodi in vitro.
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Articolo metodologico
Localizzazione, identificazione, e l'escissione dei Depositi Murine adipose
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'obesità è aumentata drasticamente negli ultimi decenni e colpisce oltre un terzo della popolazione adulta degli Stati Uniti. L'effetto economico dell'obesità nel 2005 ha raggiunto l'incredibile cifra di 190,2 miliardi di dollari solo in costi medici diretti. L'obesità è un importante fattore di rischio per una vasta gamma di malattie. Storicamente, si sapeva poco sull'adiposo e sulle sue funzioni principali ed essenziali nell'organismo. L'adiposo bruno e il bianco sono i due principali tipi di adiposo, ma la letteratura attuale ha identificato un nuovo tipo di grasso chiamato brite o adiposo beige. La ricerca ha dimostrato che i depositi adiposi hanno profili metabolici specifici e alcuni depositi consentono una propensione all'obesità e ad altri disturbi correlati. L'obiettivo di questo protocollo è quello di fornire ai ricercatori la capacità di identificare e asportare depositi adiposi che consentiranno l'analisi di diversi effetti fattoriali sul tessuto adiposo; così come il ruolo benefico o dannoso che l'adiposo svolge nella malattia e nella salute generale. L'isolamento e l'escissione dei depositi adiposi consente agli investigatori di esaminare i cambiamenti morfologici grossolani e i cambiamenti istologici. L'adiposo isolato può essere utilizzato anche per studi molecolari per valutare il cambiamento trascrizionale e traduzionale o per la sperimentazione in vitro per scoprire bersagli di interesse e meccanismi d'azione. Questa tecnica è superiore ad altre tecniche pubblicate grazie al design che consente l'isolamento di più depositi con semplicità e contaminazione minima.
Introduzione
Adiposa fatto un'apparizione notevole sotto i riflettori dei media, a causa della notevole aumento di obesità negli ultimi decenni del 20 ° secolo. L'obesità colpisce attualmente più di un terzo degli adulti e il 17% di bambini e adolescenti negli Stati Uniti (US) 1. Spanning tutti i gruppi etnici, ricerca statistica che circonda l'epidemia di obesità ha mostrato che i neri non ispanici hanno il tasso aggiustato per età più alta di obesità (49,5%) rispetto ai messicani americani (40,4%), tutti gli ispanici (39,1%), e non bianchi ispanici (34,3%) 2. L'effetto economico di obesità è anche una preoccupazione crescente per il sistema sanitario. Nel 2012, è stato stimato che il costo medico annuale delle cure per l'obesità negli Stati Uniti nel 2005 è stato di 190,2 miliardi dollari, quasi il 21% del bilancio complessivo di spesa medica. Purtroppo, l'obesità infantile è stata stimata essere responsabile a $ 14 miliardi di dollari in costi medici diretti da solo. Statisticamente, è stato determinato che il costo medio di medicaindividui con obesità è stato $ 2741 superiore di un anno rispetto a quelli senza questa morbosità 3-5.
L'obesità è un importante fattore di rischio per una serie di condizioni, quali: diabete di tipo 2, dislipidemia, malattie cardiovascolari, cancro, disturbi muscolari e scheletrici infiammazione cronica. L'obesità è profondamente legata alla patogenesi della sindrome metabolica e di altre malattie croniche 6-8. Con tali connessioni drastiche e negativi tra obesità e altre patologie concomitanti, la ricerca scientifica si è concentrata l'attenzione per capire meglio l'epidemia attuale e le diverse e cardine ruoli adiposo.
Storicamente, il tessuto adiposo è stato considerato irrilevante ed è stato considerato solo come un semplice tessuto di riempimento. Attualmente, adiposo ha dimostrato di giocare molti ruoli essenziali nella funzione del corpo in: metabolismo, regolazione ormonale, l'infiammazione, la protezione e l'isolamento 9. Il tessuto adiposo è composto principalmente daadipociti, ma contiene anche periciti, le cellule endoteliali, monociti, macrofagi e cellule staminali pluripotenti 8. Il tessuto adiposo è distribuito in tutto il corpo in depositi distinti. I principali depositi si trovano subdermally, per via sottocutanea, intramuscolare, e visceralmente 10. Depositi adiposi hanno dimostrato di avere deposito specifici profili metabolici, che hanno mostrato una predisposizione specifica depot di obesità e disturbi correlati 8.
Tradizionalmente, il tessuto adiposo è stata classificata in due tipi principali: tessuto adiposo bianco (WAT) e tessuto adiposo bruno (BAT); anche se recente letteratura indica le presenze di un terzo gruppo battezzato brite o beige adiposo 11. Il tessuto adiposo è stato dimostrato di avere colori diversi, morfologie, funzioni metaboliche, le caratteristiche biochimiche e modelli genetici di espressione 10. Gli adipociti in WAT hanno un unico, grande goccia di lipidi e di quantità variabili di mitocondri. WATsi trova in località prevalentemente sottocutaneo e viscerale del corpo. Funzioni WAT principalmente come un sito di stoccaggio di energia e di protezione d'organo. Gli adipociti in BAT hanno una morfologia multiloculare e mitocondri abbondanti. BAT si trova principalmente nel collo e grandi vasi sanguigni del torace, nonché le scapole 12. BAT funzioni principalmente a comportamenti dispendio energetico che regolano la termogenesi 7. Adiposo Brite o beige ha dimostrato di condividere una morfologia analogo ed espressione BAT, ma è stato trovato per essere originato da adipociti bianchi 11.
Il metodo chirurgico descritto in questo manoscritto fornisce ai ricercatori con la capacità di analizzare diversi effetti che fattori quali: l'ambiente, i prodotti farmaceutici, e la genetica, hanno sulla adiposo; così come il ruolo adiposo benefico o dannoso gioca nella malattia e la salute generale. Inoltre, fornendo un modo per identificare e isolare diversi tipi di tessuto adiposopermettere una migliore comprensione delle relazioni biochimiche e le differenze tra depositi. Questo può aiutare a determinare il rapporto tra posizione, la funzione, e tipi di grassi nel corpo. Questo metodo descritto realizza questo fornendo i mezzi per la visualizzazione lordo, analisi di espressione genica, analisi di espressione della proteina, l'esame istologico, e l'isolamento di linee cellulari primarie per studi in vitro. Attualmente non ci sono molti articoli che forniscono informazioni sul comportamento metabolico dei diversi depositi adiposi, nonché le loro sedi anatomiche; ma non forniscono un metodo di approfondimento su come localizzare in particolare, di identificare e isolare questi depositi. Questo metodo fornisce una tecnica chirurgica precisa che permette l'isolamento di più depositi con una quantità minima di dissezione e la contaminazione rispetto ad altri metodi progettati per l'isolato di uno o due depositi 13-14.
L'obiettivo di questo protocollo è quello di fornireun metodo preciso per l'identificazione e l'isolamento di diversi tipi di depositi di grasso di molteplici posizioni anatomiche.
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Protocollo
NOTA: Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite con l'approvazione della Cura e uso Comitato Animal Istituzionale (IACUC) dell 'Università di Cincinnati ed in conformità con la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio dal National Institutes of Health (NIH Publication No . 85-23, Revised 1996).
1. Euthanize e sterilizzare il mouse
- Posizionare il mouse in un set contenente una dose supratheraputic di isoflurano e permettono di inalare a effetto. Una volta che il mouse è eutanasia, rimuoverlo dalla scatola.
- Cervicale dislocate come un secondo mezzo di eutanasia.
- Sterilizzare la superficie esterna del mouse dalla pulizia del animale con etanolo al 70%.
2. Identificazione e isolamento di tre diversi Depositi adipose
- Brown Tessuto adiposo (BAT) Isolamento:
- Assicurarsi che il pelo è bagnato dalla pulizia alcol per facilitare il taglio attraverso la epidermico e dermico Layers.
- Posizionare il mouse in posizione supina con la schiena contro il tavolo.
- Afferra la pelle appena sotto il diaframma con una pinza, ascensore e incidere con le forbici.
- Tagliare trasversalmente attorno alla circonferenza del mouse per esporre il peritoneo.
- Rivela il deposito BAT a forma di farfalla dal degloving la metà superiore del mouse. Tenere le appendici inferiori e dell'addome in una mano e tirando la pelle verso la testa.
- Orientare il mouse, in modo che sia posizionato prono sul tavolo. Fare attenzione a non contaminare il deposito a vista con i capelli.
- Strumenti chirurgici pulite e cambiamento per un nuovo paio di guanti.
- Individuare le scapole e deposito corrispondente. Rimuovere con cautela qualsiasi adiposo bianco superficiale in cima la farfalla e poi sezionare la farfalla di interscapolare grasso bruno. Fare attenzione a evitare il muscolo strettamente associato con il grasso marrone.
NOTA: L'uso di un microscopio dissezione è raccomandato per la rimozione del white adiposo, così come nella separazione del adiposo marrone dal scapole. - Rimuovere deposito di grasso e trasferire in una provetta 2 ml.
- Se RNA o proteina deve essere estratta, congelare il tessuto mediante immersione in azoto liquido e conservare a -80 ° C. Congelare il campione in una sola volta per evitare il degrado. Se coltura, coprire il tessuto in DMEF-12 e impostare su ghiaccio fino a che tutti i campioni vengono raccolti per la cultura (info supplementare).
- Isolamento di sottocutaneo tessuto adiposo (SQ), un bianco Tessuto adiposo Depot (WAT):
- Mettere su un nuovo paio di guanti per non contaminare tra depositi di grasso.
- Rivela il inguinale, depositi SQ triangolari da DE-guanto la metà inferiore del mouse. Tenere le appendici superiori e torace in una mano e tirando la pelle verso i piedi con l'altra mano.
- Orientare il mouse in posizione supina facendo attenzione a non contaminare il deposito a vista con i capelli.
- Clean surgicastrumenti l e passare a un nuovo paio di guanti.
- Sezionare con cura i triangoli di grasso SQ. Fare attenzione a non contaminare il campione con il muscolo, la vicina di grasso, ghiandole mammarie o tagliando le navi e contaminare il campione di sangue.
NOTA: L'uso di un microscopio dissezione è consigliata se i confini non sono chiaramente definiti. - Rimuovere depositi di grasso e trasferire a 2 ml microprovette.
- Se RNA o proteina deve essere estratta, congelare il tessuto mediante immersione in azoto liquido e conservare a -80 ° C. Congelare il campione in una sola volta per evitare il degrado.
- Per la colorazione, correggere o incorporare in ottobre Se coltura, coprire il tessuto in DMEF-12 e impostare su ghiaccio fino a che tutti i campioni vengono raccolti per la cultura (info supplementare).
- Isolamento di gonadica Fat un tessuto adiposo viscerale (VAT) e Bianco Tessuto adiposo (WAT) Depot:
- Mettere su un nuovo paio di guanti per non contaminare tra depositi di grasso.
- Con scissors, tagliate il peritoneo trasversalmente, direttamente sotto il diaframma. Tagliare il peritoneo dal diaframma alla metà del retto coronale per esporre gli organi addominali.
- Individuare i testicoli o delle ovaie e identificare il tessuto adiposo bianco attaccato, noto come il adiposo epididimale nei maschi o adiposo gonadica nelle femmine.
- Strumenti chirurgici puliti e cambiare per un nuovo paio di guanti
- Sezionare con cura entrambi i depositi di grasso dell'epididimo dal testicoli, epididimi, e vasi deferenti. Oppure, se femmina, sezionare accuratamente entrambi cuscinetti di grasso gonadici dalle ovaie.
- Rimuovere i depositi di grasso e trasferirli a 2 tubi ml microcentrifuga.
- Se RNA o proteina deve essere estratta, congelare il tessuto mediante immersione in azoto liquido e conservare a -80 ° C. Congelare il campione in una sola volta per evitare il degrado.
- Per la colorazione, correggere o incorporare in ottobre Se coltura, coprire il tessuto in DMEF-12 e impostare su ghiaccio fino a che tutti i campioni vengono raccolti per la cultura (info supplementare).
3. Isolamento di Perivascolare Tessuto adiposo (PVAT)
- Isolamento del Cuore:
- Disporre il mouse in posizione supina con appendici superiori e inferiori estesi verso l'esterno.
- Appendici protetta tramite nastro chirurgico.
- Dopo aver posizionato il mouse, come riportato sopra, creare tensione sollevando il processo xifoideo con una pinza. Tagliare orizzontalmente attraverso la membrana, esponendo la parte inferiore della cavità toracica.
- Pur mantenendo la tensione, sollevando il processo xifoideo, tagliare la gabbia toracica superiormente verso la testa, appena a lato dello sterno.
- Sollevare la gabbia toracica appena inferiore alla clavicola, e tagliare lungo la lunghezza inferiore della clavicola verso il cavo ascellare in entrambe le direzioni. La cavità toracica e il suo contenuto (cuore, polmoni, ecc) ora dovrebbero essere chiaramente visibili.
- Pulire la cavità toracica di sangue estraneo e fluido usando ga sterileuze di assorbire il liquido. Se gli organi di raccolta o navi sono sicuri profusa (info supplementare).
- Una volta che la superficie è eliminato da fluido, tagliare i vasi bronchi e connessi per rimuovere i polmoni, permettendo una migliore esposizione del cuore.
- Localizzazione e Asportazione di aortica Perivascolare Tessuto adiposo (PVAT):
- Rimuovere i seguenti organi per identificare meglio le parti inferiori della aorta: fegato, stomaco, milza, pancreas, intestino, e colon.
- Prima iniziare con l'identificazione dello stomaco e dell'esofago. Tagliare dell'esofago alla giunzione gastro-esofageo per liberare lo stomaco dal corpo.
- Avanti, individuare l'intestino e mesentere circostante. Tagliare superficialmente attraverso mesentere, in quanto si trova molto vicino alla parte renale dell'aorta, poi "eseguire l'intestino."
- Tagliare il colon liberare il più vicino al retto possibile. Così, liberando lo stomaco, intestino e colon dal mouse.
- Respostare lo stomaco, intestino, colon, pancreas e milza tagliando attraverso il mesentere Collegamento e vasi. Il pancreas e la milza dovrebbe venire gratis con lo stomaco, intestino e colon.
- Rimuovere il fegato tagliando attraverso le vene epatiche e allegando mesentere, rimuovere tutti i lobi.
- Tagliare via lo strato di grasso viscerale e circondano i reni. Lasciare i reni allegate all'aorta in vivo per servire come marcatori geografiche per diversi segmenti dell'aorta.
- Risciacquare la zona con 1x PBS sterile e rimuovere tutto il fluido per assorbimento con una garza sterile.
- Utilizzando micro-forbici e micro-pinza, separare l'aorta dal suo attaccamento dorsale per la colonna vertebrale e il suo attaccamento ventrale all'esofago.
- Isolare l'aorta seguendo e staccando l'aorta la lunghezza dell'aorta discendente dall'origine nel cuore alla biforcazione della regione iliaca.
- Identificare e isolare i vasi succlavi. Isolare questi vasidal collo alla radice aortica per esporre meglio la giunzione aortica e la radice nel cuore.
- Rimuovere il timo poi tagliare l'arteria brachiocefalico, l'arteria carotide comune sinistra, e succlavia sinistra, permettendo il movimento del cuore.
- Con l'aiuto di un microscopio dissezione, visualizzare il tessuto adiposo (PVAT) strato perivascolare che circonda l'aorta.
- Facendo molta attenzione a non schiacciare o spremere il PVAT, tirare delicatamente il modo PVAT dall'aorta con micro-pinza. Tagliare delicatamente il fissaggio del PVAT all'aorta con micro-forbici a partire regione toracica appena superiore al punto in cui si trova il diaframma.
NOTA: Si consiglia un microscopio a dissezione. - Ripetere questo processo l'intera lunghezza dell'aorta, terminando a regione aortica sottorenale, che si trova appena superiore alla biforcazione iliaca del vaso aortico.
- Se aortico PVAT è desiderato, utilizzato lo stesso metodo per rimuovere il PVAT dalla minore curvature dell'arco.
- Posizionare i campioni PVAT in 2 ml provetta (s).
- Se RNA o proteina deve essere estratta, congelare il tessuto mediante immersione in azoto liquido e conservare a -80 ° C. Congelare il campione in una sola volta per evitare il degrado. Se coltura, coprire il tessuto in DMEF-12 e impostare su ghiaccio fino a che tutti i campioni vengono raccolti per la cultura (info supplementare).
NOTA: ulteriori depositi adiposi da considerare se interessati in una completa analisi depot adiposo includono: retroperitoneale, mesenterica, omentale, pericardico e poplitea.
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Risultati
Identificazione e localizzazione delle adiposo sottocutaneo inguinale, interscapolare adiposo bruno, viscerale adiposo epididimale (figura 1), nonché la aortico adiposo perivascolare arco, toracica adiposo aortica, suprarenal adiposo aortica e dell'aorta infrarenale adiposo (Figura 2) è stata ottenuta con successo usando il metodo chirurgico descritto. L'esame istologico e la differenziazione tra i campioni BAT e Wat sono stati positivamente valutati usando ematossilina e eosina (H &...
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Discussione
L'obesità può portare a una grande serie di morbilità e la piena comprensione del ruolo che svolge adiposo non è pienamente compreso; ricerca pertanto continuato nel campo della adiposo è necessaria. I modelli animali, in particolare i modelli murini sono ideali per la ricerca iniziale nella progressione delle malattie e la sperimentazione di potenziali trattamenti farmaceutici. Utilizzando questi modelli, isolamento precisa e escissione di depositi adiposi è uno strumento estremamente importante e necessario nello ...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti o altri conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Gli autori non hanno riconoscimenti.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Isoflurane | Med-Vet International | #RXISO-250 | |
| 70% Etanolo | Fisher | 07-678-001 | |
| DMEF-12 | Sigma Aldrich | D-6421 | Riscaldare a bagnomaria prima di applicare il fazzoletto. |
| Provette per microcentrifuga da 2 ml | Midsci | MCT-200-C-S | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato | Sigma | Aldrich P5368-10PAK |
Riferimenti
- Ogden, C. L., Carroll, M. D., Kit, B. K., Flegal, K. M. Prevalence of obesity in the United States, 2009-2010. NCHS Data Brief. 82, 1-8 (2012).
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Ristampe e permessi
