Qui descriviamo un semplice test per la quantificazione della risposta alimentare nell'idra indotta dalla forma ridotta di glutatione. Questo test si basa sulla misurazione della distanza tra l'estremità apicale del tentacolo e la bocca dell'idra.
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Articolo metodologico
Misurazione glutatione indotta risposta alimentazione a Hydra
In questo articolo
Sommario
Abstract
Hydra è tra gli organismi più primitivi che possiedono un sistema nervoso e una chemiosensazione per rilevare il glutatione ridotto (GSH) per catturare la preda. Il movimento degli organismi preda provoca la scarica meccanosensoriale delle cellule urticanti chiamate nematocisti dall'idra, che vengono inserite nella preda. La risposta alimentare in idra, che comprende l'arricciamento dei tentacoli per portare la preda verso la bocca, l'apertura della bocca e il conseguente inghiottimento della preda, è innescata dal GSH presente nel fluido rilasciato dalla preda ferita. Per essere in grado di identificare il meccanismo molecolare della risposta alimentare nell'idra che è finora sconosciuto, è necessario stabilire un test per misurare la risposta alimentare. Qui, descriviamo un metodo semplice per la quantificazione della risposta alimentare in cui viene misurata la distanza tra l'estremità apicale del tentacolo e la bocca dell'idra e viene determinato il rapporto di tale distanza prima e dopo l'aggiunta di GSH. Si è scoperto che il rapporto, chiamato diffusione relativa dei tentacoli, fornisce una misura della risposta alimentare. Questo test è stato convalidato utilizzando un modello di fame in cui l'idra affamata mostra una risposta alimentare migliorata rispetto all'idra alimentata quotidianamente.
Introduzione
Hydra è l'organismo più primitivo che possiede un sistema nervoso e una chemiosensazione per rilevare il glutatione ridotto (GSH) per catturare la preda1. Si nutre di una varietà di animali come nematodi, crostacei, larve di insetti, girini e pesci appena nati1. Il movimento di questi organismi preda provoca la scarica meccanosensoriale delle capsule urticanti chiamate nematocisti da idra, che vengono inserite nella preda2. Il GSH presente nel fluido rilasciato dalla preda ferita attiva successivamente la risposta alimentare in idra che comprende l'arricciamento dei tentacoli per portare la preda verso la bocca, l'apertura della bocca e il conseguente inghiottimento della preda. È stato dimostrato che diverse molecole, come la dopamina3, il glutammato4, il GABA, la glicina5, i recettori NMDA6 e l'allatotropina7, sono coinvolte nella risposta alimentare nell'idra. È stato anche dimostrato che la risposta chemiosensoriale indotta dal GSH è modulata dallo stato alimentare dell'animale in modo tale che l'idra affamata ha mostrato una risposta alimentare migliorata1. Un tale aumento della sensibilità al GSH è biologicamente rilevante poiché in condizioni di fame le idre hanno bisogno di trovare la loro preda a una sensibilità più elevata.
Sebbene la risposta alimentare indotta dal GSH possa essere chiaramente osservata al microscopio, i metodi tipicamente utilizzati per misurare le osservazioni della risposta alimentare non sono quantitativi. Nella maggior parte dei casi, il tempo durante il quale la bocca dell'idra rimane aperta è stato preso come misura della risposta alimentare8,9; mentre in un altro caso, la quantificazione si basava sul numero di idre su una popolazione che mostrava la risposta alimentare10. Tuttavia, osservare il tempo di apertura della bocca dei polipi dell'idra è macchinoso e soggetto a variazioni indotte da parametri incontrollabili come la direzione dell'orientamento della bocca durante le osservazioni. Allo stesso modo, poiché la risposta alimentare è un parametro quantitativo, gli approcci basati sulla popolazione sono soggetti a variazioni/errori causati dall'opinione o dal pregiudizio osservativo del singolo osservatore. Per aggirare questi problemi abbiamo sviluppato un metodo per la quantificazione relativa della risposta alimentare nell'idra (Hydra vulgaris Ind-Pune11) basata sulla distanza dell'estremità apicale del tentacolo dalla bocca del polipo dell'idra.
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Protocollo
1. Hydra Cultura e misura della risposta alimentazione
- Mantenere polipi idra in coltura somministrando loro giornalmente con artemia e tenerli in un mezzo (buffer 1 mM Tris-HCl, pH 7,6, 1 mM NaCl, 1 mM CaCl 2, 0.1 mM KCl, e 0,1 mM MgSO4) contenuta in un ciotola di vetro a 18 ° C in 12 hr luce-12 hr cicli scuri come descritto in precedenza 12.
- Per misurare la risposta di alimentazione, trasferire matura polipo Hydra avere da 5 a 6 tentacoli di un unico pozzetto di una piastra da 24 pozzetti. Rimuovere la quantità residua dal pozzo inclinandolo, e quindi aggiungere immediatamente 500 ml di terreno fresco.
- Preparare la soluzione glutatione 9 micron di media idra. Poiché la soluzione glutatione è incline all'ossidazione, utilizzare sempre soluzione glutatione appena preparata per ciascun esperimento.
- Trasferire la piastra alla piattaforma di imaging di un microscopio avente disposizioni per la registrazione di immagini. Utilizzare uno sfondo scuro in modo tale che il comportamento of polipo Hydra è chiaramente ripreso sullo sfondo contrastante.
- La sala utilizzata per l'osservazione e l'imaging del comportamento di idra privo di luci di intensità fluttuante, correnti d'aria e rumore. Tali disturbi possono anche causare il polipo idra per mostrare la contrazione dei tentacoli - anche in assenza di glutatione.
- Lasciare che il polipo per rilassarsi per 5 minuti.
- Assicurarsi che il polipo si trova lungo la regione centrale del pozzo in modo che il comportamento può essere ripreso in modo chiaro. Se il polipo è al bordo del pozzo, portarlo al centro irrigando il mezzo con una pipetta e ancora permettergli di rilassarsi.
- Scattare una foto di idra nello stato di rilassamento. Questo sarà il punto di osservazione zero tempo.
- Aggiungere rapidamente 9 mM soluzione glutatione per raggiungere una concentrazione finale di 3 micron nel pozzo. A seconda dello scopo dell'esperimento e la risposta dimostrato da idra, testare una gamma di diverse concentrazioni di glutatione e chooSE la concentrazione appropriata richiesta.
- Avviare il timer immediatamente dopo l'aggiunta di soluzione di glutatione e catturare immagini dopo ogni 15-30 secondi per 4-5 min. Non modificare le impostazioni di ingrandimento durante il time-lapse imaging.
- Aggiungere la soluzione glutatione delicatamente e con un flusso uniforme tale che la posizione dell'animale nel pozzo sarebbe minimamente disturbato nel campo visivo del microscopio. Tuttavia, se il polipo muove ampiamente dopo l'aggiunta di soluzione di glutatione, spostare la piastra delicatamente per portare il polipo nel campo di vista per la cattura delle immagini.
- Nell'esperimento di controllo, utilizzare mezzo privo glutatione mantenendo tutti gli altri parametri identici.
- Assicurarsi di eseguire tutte le fasi sperimentali di cui sopra durante la prima metà della giornata - prima di 1:00 per evitare il possibile effetto del ritmo circadiano del grado di risposta di alimentazione.
- Aprire ciascuna delle immagini acquisite utilizzando il GNU Image Manipulation Program (GIMP). Utilizzare lo strumento "Misura" disponibile dal Menu> Strumenti> Misura per determinare la distanza tra l'estremità apicale di ciascuno dei tentacoli e ipostoma. Se l'apertura della bocca è osservata in qualsiasi delle immagini, determinare la distanza tra il centro della bocca aperta e l'estremità apicale del tentacolo. Fare riferimento a questa distanza come la diffusione tentacolo.
- Calcolare lo spread medio tentacolo per ogni polipo prima e dopo l'esposizione glutatione. Calcolare il rapporto di spread medio tentacolo al punto zero tempo a quella in ciascuno dei successivi punti temporali. Questo rapporto si chiamerà relativa diffusione tentacolo.
- Ripetere le misurazioni per almeno 20 polipi.
2. Metodo di convalida utilizzando ilLa fame Modello
- Per fame, trasferire alcuni polipi Hydra in una ciotola di vetro separata e non dar loro da mangiare per 5 giorni. Inserire il gruppo di controllo di alcuni polipi al giorno con Artemia in una ciotola di dimensioni simili. Modificare il supporto sia sperimentale ciotole giorno per evitare la crescita di funghi nel mezzo.
- Il giorno dell'esperimento, alimentare il gruppo di controllo di idra con artemia per 1 ora e utilizzare questi hydra per gli esperimenti successivi dopo aver rimosso tutti artemia non consumati e morti dal mezzo.
- Misurare la risposta alimentazione del idra fame in confronto con l'idra dal gruppo di controllo con il metodo descritto in precedenza al punto 1. Per evitare qualsiasi distorsione dovuta al tempo di osservazione, alternare le misurazioni di ciascuno degli fame e controllare polipi idra.
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Risultati
Glutatione provoca idra esporre arricciamento dei tentacoli verso la bocca al fine di inghiotte la preda. Tale arricciatura di tentacoli porta estremità apicale dei tentacoli più vicino alla ipostoma. Ciò comporta la riduzione dello spread tentacolo, o la distanza lineare tra l'estremità apicale del tentacolo e ipostoma (Figura 1). La diffusione tentacolo relativa, o il rapporto tra tentacolo media si sviluppa prima e dopo l'aggiunta di glutatione, la media su più polipi riduce nel tempo. La diffusione ...
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Discussione
Comportamento alimentare in idra rappresenta uno dei sistemi chemosensoriali più ancestrali dei metazoi. Sebbene la presenza di GSH nel fluido crostaceo rilasciato dopo la cattura la preda nematocisti-assistita è stato rilevato da tempo 1, né la proteina GSHR né le putativo gene codifica / s sono stati caratterizzati da idra ad oggi. Alcuni tentativi sono stati fatti per caratterizzare GSH proteine leganti in idra 8, 14, 15. Tuttavia, l'identità di queste proteine recettori putativi rimane ...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Gli autori sono grati a K. P. Madhu, Nita Beliappa e allo staff del Media Centre dell'Indian Institute of Science Education and Research, Pune per il loro aiuto nella produzione del video. Il lavoro è stato sostenuto da finanziamenti nell'ambito del programma Centre of Excellence del Dipartimento di Biotecnologia, Governo dell'India a SG e da borse di studio post-dottorato da parte del Dipartimento di Scienza e Tecnologia, Governo dell'India a RK.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Incubatore raffreddato | Panasonic | Microscopio MIR-254-PE | |
| Leica | S8AP0 | ||
| Fotocamera per il microscopio | Leica | EC3 | |
| Glutatione ridotto | Sigma | G4251 | Conservato a 4 °C. Portare il flacone a temperatura ambiente prima di aprirlo per evitare l'ossidazione |
| Programma di modifica delle immagini | GIMP | Versione 2.8 |
Riferimenti
- Loomis, W. F. Glutathione control of the specific feeding reactions of hydra. Ann. Ny. Acad. Sci. 62, 209-228 (1955).
- Beckmann, A., Ozbek, S. The Nematocyst: a molecular map of the Cnidarian stinging organelle. Int. J. Dev. Biol. 56, 577-582 (2012).
- Venturini, G., Carolei, A. Dopaminergic receptors in Hydra. Pharmacological and biochemical observations. Comp. Biochem. Phys. C. 102, 39-43 (1992).
- Kass-Simon, G., Scappaticci, A. A. Glutamatergic and GABAnergic control in the tentacle effector systems of Hydra vulgaris. Hydrobiologia. 530-531, 67-71 (2004).
- Pierobon, P., Tino, A., Minei, R., Marino, G. Different roles of GABA and glycine in the modulation of chemosensory responses in Hydra vulgaris (Cnidaria, Hydrozoa). Hydrobiology. 178, 59-66 (2004).
- Pierobon, P., Sogliano, C., Minei, R., Tino, A., Porcu, P., Marino, G., Tortiglione, C., Concas, A. Putative NMDA receptors in Hydra: a biochemical and functional study. Eur. J. Neurosci. 20, 2598-2604 (2004).
- Alzugaray, M. E., Adami, M. L., Diambra, L. A., Hernandez-Martinez, S., Damborenea, C., Noriega, F. G., Ronderos, J. R. Allatotropin: An ancestral myotropic neuropeptide involved in feeding. PLoS ONE. 8, (2013).
- Bellis, S. L., Laux, D. C., Rhoads, D. E. Affinity purification of Hydra glutathione binding proteins. FEBS Lett. 354, 320-324 (1994).
- Lenhoff, H. M. The discovery of the GSH receptor in Hydra and its evolutionary significance. Glutathione in the Nervous System. Shaw, C. A. , Taylor&Francis. Bristol. 25-43 (1998).
- Venturini, G. The hydra GSH receptor. Pharmacological and radioligand binding studies. Comp. Biochem. Phys. C. 87, 321-324 (1987).
- Reddy, P. C., Barve, A., Ghaskadbi, S. Description and phylogenetic characterization of common hydra from India. Curr. Sci. 101, 736-738 (2011).
- Horibata, Y., et al. Unique catabolic pathway of glycosphingolipids in a hydrozoan, Hydra magnipapillata. Involving endoglycoceramidase. J. Biol. Chem. 279, 33379-33389 (2004).
- Koizumi, O., Maeda, N. Rise of feeding threshold in satiated Hydra. J. Comp. Physiol. 142, 75-80 (1981).
- Bellis, S. L., Kass-Simon, G., Rhoads, D. E. Partial characterization and detergent solubilization of the putative glutathione chemoreceptor from hydra. Biochemistry. 31, 9838-9843 (1992).
- Morita, H., Hanai, K. Taste receptor proteins in invertebrates - with special reference to glutathione receptor of hydra. Chem. Senses. 12, 245-250 (1987).
- Colasanti, M., Venturini, G., Merante, A., Musci, G., Lauro, G. M. Nitric oxide involvement in Hydra vulgaris very primitive olfactory- like system. Journal of Neurosci. 17, 493-499 (1997).
- Kuhn, A., Tsiairis, C. D., Williamson, M., Kalbacher, H., Grimmelikhuijzen, C. J., Holstein, T. W., Gründer, S. Three homologous subunits form a high affinity peptide-gated ion channel in Hydra. J. Biol. Chem. 285, 11958-11965 (2010).
- Wang, M., Yao, Y., Kuang, D., Hampson, D. R. Activation of family C G-protein-coupled receptors by the tripeptide glutathione. J. Biol. Chem. 281, 8864-8870 (2006).
- Ruggieri, R. D., Pierobon, P., Kass-Simon, G. Pacemaker activity in hydra is modulated by glycine receptor ligands. Comp. Biochem. Phys. C. 138, 193-202 (2004).
- Ramazani, R. B., Krishnan, H. R., Bergeson, S. E., Atkinson, N. S. Computer automated movement detection for the analysis of behavior. J. Neurosci. Meth. 162, 171-179 (2007).
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