Realizzazione substrati di coltura complessi utilizzando robotica microcontact stampa (R-μCP) e sequenziale Sostituzione nucleofila

Summary

I substrati di coltura cellulare funzionalizzati con modelli su microscala di ligandi biologici hanno un'immensa utilità nel campo dell'ingegneria tissutale. Qui, dimostriamo la produzione versatile e automatizzata di substrati di coltura tissutale con spazzole multiple di poli(glicole etilenico) microstrutturate che presentano sostanze chimiche ortogonali che consentono l'immobilizzazione spazialmente precisa e sito-specifica di ligandi biologici.

Abstract

Nell'ingegneria tissutale, è auspicabile esibire il controllo spaziale della morfologia dei tessuti e del destino cellulare in coltura su scala micron. Per raggiungere questo compito possono essere utilizzati substrati di coltura che presentano spazzole innestate di poli(glicole etilenico) (PEG) creando regioni su microscala, non incrostate e resistenti all'adesione cellulare, nonché regioni in cui le cellule partecipano a interazioni biospecifiche con ligandi legati covalentemente. Per ingegnerizzare tessuti complessi utilizzando tali substrati, sarà necessario modellare in sequenza più spazzole PEG funzionalizzate per conferire bioattività differenziali e allineate in orientamenti su microscala che imitano nicchie in vivo. La stampa a microcontatto (μCP) è una tecnica versatile per modellare tali spazzole PEG innestate, ma la μCP manuale non può essere eseguita con precisione su microscala. Pertanto, abbiamo combinato la robotica avanzata con tecniche di litografia morbida e reazioni chimiche di superficie emergenti per sviluppare un metodo assistito da stampa robotica a microcontatto (R-μCP) per la fabbricazione di substrati di coltura con modelli complessi, su microscala e altamente ordinati di spazzole PEG che presentano sostanze chimiche ortogonali "a clic". Qui descriviamo in dettaglio il flusso di lavoro per la produzione di tali substrati.

Introduction

La capacità delle superfici PEG-innestate per visualizzare leganti biochimici un legame covalente al tempo stesso mantenendo intrinseche proprietà non-fouling li rendono la scelta ideale per gli ambienti di microscala ingegneria personalizzate su substrati di coltura ^1,2,3 fare. Le interazioni biospecifici mediate da ligando coniugata spazzole PEG consente l'analisi riduzionistica degli effetti di segnali biochimici si trovano all'interno del complesso in microambienti tessuto vivo su fenotipi di cellule singole. Inoltre, chimiche "click" bio-ortogonale possono essere utilizzati per facilitare l'immobilizzazione direzionale di ligandi in modo che siano presentati in conformazioni native ^4-6. Così, microscala patterning spaziale di PEG spazzole è uno strumento versatile per creare design in nicchie in vitro per studiare la segnalazione cellulare indotta da stimoli biochimici immobilizzati ^6,7.

Un metodo comune per la generazione di modelli spaziali di cu biochimicaes comporta stampa microcontact (μCP) substrati d'oro rivestite con modelli di PEG alkanethiols coniugati. Poi, i monostrati auto-assemblati micropatterned (SAM) di alkanethiols PEG-ylated limita adsorbimento fisico di molecole biochimiche, ad esempio, le proteine, solo per le regioni non fantasia del substrato ^8,9. Tuttavia, i SAM generati da questa tecnica sono sensibili all'ossidazione a lungo termine mezzi di coltura cellulare. Così, μCP'd alkanethiol SAM sono spesso ulteriormente innestate con PEG spazzole polimero con trasferimento atomo-superficie avviato polimerizzazione radicalica (SI-ATRP) per aumentare non sporcare la stabilità della regione ^10. In particolare, μCP della iniziatore di polimerizzazione alkanethiol, ω-meraptoundecyl bromoisobutirrato, su superfici d'oro rivestite seguite da SI-ATRP di poli (etilene glicole) metacrilato metil etere (PEGMEMA) monomeri genera superfici con micropatterned a lungo termine, stabile, e non fouling PEG spazzole. Inoltre, questi sono in grado di essere ulteriormente modificato per presentare frazioni chimiche diverse ^11.

Approfittando di questa proprietà, Sha et. al. messo a punto un metodo per progettare substrati di coltura con spazzole PEGMEMA più componenti presentano ortogonali chimiche "clic". In questo metodo, si avvalgono di una serie di passaggi μCP / SI-ATRP intervallati da sodio azide sequenziale, etanolammina, e propargylamine sostituzioni nucleofile per creare substrati di coltura che presentano modelli di microscala di più ligandi immobilizzati ^6. Mentre la prospettiva di utilizzare tali sostanze chimiche in collegamento con μCP manuale per progettare nuovi substrati di coltura è immenso, è limitata dalla precisione e accuratezza con cui più passaggi μCP possono essere allineate su un unico substrato. Un alto livello di precisione e accuratezza sarebbe necessario per la fabbricazione riproducibile complesso in nicchie vitro utilizzando queste tecniche versatili.

e_content "> Per affrontare questa limitazione, sono stati generati diversi sistemi μCP automatici e semi-automatici. Chakra et. al., messo a punto un sistema di μCP in cui timbri personalizzati sono posti su un sistema ferroviario e messi in contatto conforme con scivoli d'oro rivestite con un attuatore pneumatico controllato da computer. Tuttavia, questo metodo richiede la realizzazione precisa dei disegni provvisorie personalizzati e riporta una precisione di 10 micron con nessuna relazione della precisione ottenuta durante l'esecuzione multipla μCP passaggi ^12. Più recentemente, un metodo che utilizza un sistema di accoppiamento cinematico integrato precisione sotto riportato 1 micron utilizzando un singolo modello, ma non erano in grado di allineare con precisione più pattern a causa della mancanza di un controllo preciso delle caratteristiche provvisorie da stampo per stampo ^13. Inoltre, entrambi i metodi precedenti richiedono il substrato a rimanere fisso tra passi patterning , con ciò limitando sensibilmente la diversità dei chimici la modifica della superficie che possono essereutilizzata. Qui, descriviamo un sistema R-μCP automatizzato in grado di allineamento accurato e preciso di molteplici passaggi μCP pur consentendo la massima flessibilità nella progettazione e fabbricazione di bollo. Inoltre, i substrati modellati possono essere ripetutamente rimossi dal sistema tra frantumi, permettendo così l'uso di diverse sostanze chimiche modifica substrato, incluse sostituzioni nucleofile sequenziali. Substrati ingegnerizzati l'utilizzo di tali sostanze chimiche sono state utilizzate per colture cellulari in precedenza sia da noi ^6,14 e altri ^7. Così, abbiamo unito R-μCP e reazioni di sostituzione nucleofila sequenziali per sviluppare un metodo per la produzione scalabile di substrati di coltura con segnali biochimici complessi e micropatterned.

Protocol

1. Generazione elastomerici Francobolli

1. Per generare padroni di silicio del timbro PDMS, di design dispongono di modelli del fotomaschere utilizzando il software computer-aided design.
   1. Progettare il primo modello come 20 x 20 serie di corone circolari con 300 micron di diametro interno (ID) e 600 micron OD con 1.200 micron da centro a centro spaziatura.
   2. Progettare il secondo pattern come 20 x 20 serie di corone circolari con ID 600 micron e 900 micron OD con 1.200 micron da centro a centro di spaziatura.
   3. Inoltre, mettere 1 x 1 mm ² tacche di riferimento quadrati a tutti i quattro angoli di ogni disegno di matrice distanziati 1.200 micron da centro a centro del modello di angolo in un angolo di 45 °.
   4. Realizzare i maestri di silicio per l'uso in questo esperimento con 1: 1 proporzioni, correlando ad una profondità di 300 micron funzione utilizzando tecniche di litografia norme definite altrove ¹⁵ o in collaborazione con una fonderia microfluidica.
      NOTA: Caratteristica Profondità inferiore a 100 micron possono portare a deformazioni anormali di francobolli prima del contatto con le superfici del substrato.
      NOTA: Questo protocollo inizia con avere maestri di silicio già ottenuti con i modelli descritti di fotoresist, che richiede attrezzature specializzate e camere pulite per creare. E 'meglio consultare un costruttore o nucleo possibilità di creare questi maestri fantasia.
2. Maestri di silicio silanizzare O / N mediante incubazione con (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydroocty) vapore triclorosilano.
   NOTA: silano vapore è altamente tossico e deve essere maneggiato solo in una cappa.
3. Creare repliche inversa dei maestri silicio curando un rapporto 10: 1 di PDMS pre-polimero e PDMS induritore in cima maestri silicio silanizzato in una capsula di Petri O / N a 60 ° C.
4. Rimuovere le PDMS francobolli dai maestri di silicio, e legare i timbri acrilonitrile-butadiene-stirene (ABS) supporti o qualsiasi altro materiale rigidos utilizzo di colla.
   NOTA: il materiale di scelta non deve essere trasparente o biocompatibile. Tuttavia, si deve fornire una superficie piana per l'interfaccia con l'attrezzatura robotizzata e maggiore rigidità rispetto PDMS.

2. Coprioggetto Preparazione

1. Coprioggetto microscopio risciacquo (24 x 50 mm # 1) in toluene, metanolo e ultrasuoni in acetone per 1 min prima del risciacquo con etanolo ed essiccamento sotto lieve corrente di azoto.
   NOTA: Maneggiare toluene e acetone solo in una cappa.
2. Coprioggetto cappotto con ~ 3.5 nm titanio (Ti), seguita da 18,0 nm oro (Au) con un mirato evaporatore a fascio elettronico.
   NOTA: Questa procedura è compatibile con una varietà di substrati oro rivestite compreso silicio e polistirene. Mentre è possibile generare questi in loco, substrati oro rivestite sono disponibili tramite fornitori commerciali anche.
   NOTA: i livelli di Ti deve essere di almeno 3 nm di spessore, mentre Au strati su supporti dovrebbe essere unt almeno 5 nm di spessore e può variare fino a 1 mm di spessore a seconda delle proprietà ottiche ideali del substrato finale ^16,17. Substrati non sono tenuti ad essere otticamente trasparente per la fabbricazione; tuttavia, facilita l'analisi microscopica di substrati fabbricati.
3. Risciacquare Coprioggetto oro rivestite con etanolo e secco sotto azoto delicato immediatamente prima dell'uso.

3. R-μCP di anello esterno

1. Prima di R-μCP con il sistema selettivo conforme braccio del robot articolato (SCARA), calibrare gli effettori degli strumenti robotici e sistemi dual telecamere di accompagnamento utilizzando il software del sistema.
   NOTA: Questi strumenti sono raffigurati nella figura 1.

Figura 1. R- μCP sistema e Braccio robotico Tooling. (A) vista su larga scala del sistema di R-μCP con tutte le attrezzature e arredi, (a) mandrino a vuoto, (b) bagno reagente, (c) fotocamera rivolta verso il basso, (d) apparecchio timbro nidificazione, (e) robotica utensile. (B) Attrezzature per robotica braccio raffigurante (f), strumento di incisione a punta di diamante e (g) strumento pneumatiche aspiranti in possesso di un (h) ABS-backed PDMS bollo.

2. Inserire manualmente un timbro PDMS con 600 ID micron e 900 micron OD sporgente annuli a faccia in giù nel dispositivo timbro di nidificazione. Inserire manualmente un coverslide oro rivestite appena pulita sopra il mandrino a depressione, mostrata in Figura 1A, e immobilizzarlo con il laboratorio vuoto collegata.
3. Utilizzando i controlli robot, allineare la fotocamera rivolta verso il basso sopra il punto centrale della coverslide rivestita d'oro, come in Figura 2A.
   NOTA: Questo punto può essere inizialmente definita mediante ispezione visiva e non richiede grande precisione, come il timbro PDMS è molto larger quanto la slitta rivestita d'oro.
4. Istruire il braccio robotico per incidere quattro riferimento "X" marchi di cui i vertici di un quadrato di dimensioni 3,8 millimetri di 3,8 millimetri centrati sul coverslide oro rivestite utilizzando lo strumento di incisione a punta di diamante attaccato al braccio robotico. (Illustrato nella figura 2B; processo automatizzato)
   NOTA: In questo modo tutti e quattro i punti di riferimento sono all'interno di un quadro visivo della telecamera rivolta verso il basso.
5. Utilizzando i robot attrezzature pneumatiche aspiranti, pick-up e tenere premuto il PDMS Timbro 1 mm sopra il dispositivo timbro nidificazione come in Figura 2C. (Processo automatizzato)
6. Utilizzando la fotocamera rivolta verso l'alto e l'anello illuminazione a LED nella Figura 2D ed E, visualizza indici di riferimento quadrata del timbro e identificarli con il software della fotocamera 10 volte per determinare X medio del timbro, Y e offset angolare dal centro della asse robot utensili. (Processo automatizzato)
7. Come in NOTA: un calcolo interno è svolto dal software del sistema robotico per allineare con precisione la X del coprioggetto, Y località del centro e offset angolari nelle future fasi R-μCP di timbro e.
8. 3.8) Posizionare il timbro in un bagno di alkanethiol iniziatore ATRP, ω-mercaptoundecyl bromoisobutirrato (2 mM in etanolo), come illustrato nella Figura 2F. (Processo automatizzato)
9. Rimuovere il timbro dalla soluzione alkanethiol e porlo sul flusso di azoto pressurizzato a 0,48 bar (5 psi) per far evaporare l'etanolo come in Figura 2G. Dopo 1 min aumentare la pressione del flusso di azoto è di 1,03 bar (15 psi) per garantire la secchezza uniforme. (Processo automatizzato)
   NOTA: asciugatura incompleta comporterà la perdita totale o parziale del modello di fedeltà.
10. Dopo l'essiccazione, spostare il timbro sulla posizione centro calcolato della slitta rivestita d'oro e abbassarlo a 100 micron incrementi monitorando forza motore asse Z come illustrato nella Figura 2H.
    NOTA: Questo viene comunicato come torsione subita dal motore asse Z e visualizzato nel software guida robot. (Processo automatizzato)
11. Arrestare abbassando il timbro una volta raggiunta la pressione prestabilita di 79,2 kPa, e mantenere il contatto con la slitta rivestita d'oro per 15 sec. (Processo automatizzato)
    NOTA: I valori di pressione qui sono ottimizzati per la progettazione timbro e funzionalità altezza corrente. Se il disegno di bollo viene modificato, in particolare per alto rapporto di aspetto francobolli, sintonizzare questi di conseguenza un processo di tentativi ed errori.
12. Rimuovere lentamente il timbro dalla diapositiva oro rivestite e mettere il timbro di nuovo nel dispositivo timbro di nidificazione. (Processo automatizzato)

4. SI-ATRP di PEGMEMA su micropatterned Coprioggetto

1. Rilasciare la pressione di vuoto tenendo il coverslide micropatterned, e trasferirla in un pallone da 50 ml Schlenk. Seal e Degas la Schlenk pallone di utilizzare una pompa a vuoto.
2. Aggiungere 5,5 ml di miscela di reazione contenente la ATRP macromonomero PEGMEMA (208.75 mmoli), acqua (34,4 ml), metanolo (43,8 ml), rame (II) bromuro (1 mmol), e 2 ', 2-bipiridina (3 mmol) di la beuta Schlenk.
3. Aggiungere 0,5 ml di ascorbato di sodio L-(454,3 mM) in acqua per iniziare l'attacco, e lasciarlo proseguire per 16 ore a temperatura ambiente sotto gas inerte.
   NOTA: Dopo l'aggiunta di L-ascorbato di sodio, colore reazione si sposterà dal verde chiaro al marrone scuro, come mostrato nella Figura 3A-B.
   NOTA: La reazione può continuare oltre 16 ore, ma non aumenta significativamente la lunghezza delle spazzole PEG.

Figura 3. Apertura di SI-ATRP. (A) Avvio di reazione e (B) dopo il cambiamento di colore in seguito all'aggiunta di ascorbato di sodio L-. (C) Microscopio immagine di micropatterned superficie coverslide seguente procedura SI-ATRP. Bar Scala 1 mm.

4. Rimuovere il coverslide micropatterned dal pallone Schenk e risciacquare con etanolo, acqua e etanolo e secco sotto flusso di azoto dolce.
   NOTA: A seguito di SI-ATRP, modificazioni della superficie dovrebbe essere visibile a occhio e può essere ripreso e analizzato al microscopio come in figura 3C.
   NOTA: Questo è il metodo più semplice per testare la precisione del processo in quanto evita la necessità di immunostain substrati.

5. Funzionalizzazione azide delle Catene micropatterned PEGMEMA

1. Posizionare il coverslide micropatterned in 20 ml di reazione flaconcino di vetro.
2. Aggiungere 6 ml di N, N -dimethylformamide (DMF) contenente 100 mM sodio azide nel flaconcino di reazione. Mantenere questa reazione a 37 ° C per 24 ore.
   NOTA: Maneggiare DMF solo in una cappa. Fare attenzione durante la pesatura fuori sodio azide.
3. Al termine, rimuovere il coverslide micropatterned dalla fiala di reazione e lavare con etanolo quindi acqua e asciugare in corrente di azoto.

6. passivazione delle Catene bromo funzionalizzati PEGMEMA

1. Mettere coverslide micropatterned in 20 ml fiale di vetro.
2. Aggiungere 6 ml di dimetilsolfossido (DMSO) contenenti etanolamina 100 mM e 300 mM trietilamina nel flaconcino di reazione. Mantenere questa reazione a 40 ° C per 24 ore.
   NOTA: Maneggiare DMSO, etanolammina, e trietilammina solo in una cappa.
3. Al termine rimuovere il coversl micropatternedide dal flaconcino di reazione, lavare con etanolo poi acqua e asciugare in corrente di azoto.

7. R-μCP di Annulus interne e SI-ATRP di PEGMEMA

1. Eseguire i punti R-μCP come precedentemente descritto nei passaggi 3,2 e 3,6-3,12, sostituendo un timbro PDMS con 300 micron e 600 micron ID annuli OD sporgenti, in modo che il annuli con le caratteristiche più piccole sono collocati all'interno delle corone circolari in precedenza micropatterned.
   NOTA: La soglia di pressione per questo francobollo è 132,0 kPa. Come accennato in precedenza, queste impostazioni di pressione sono ottimizzate per le caratteristiche provvisorie utilizzati in questo esperimento.
2. Eseguire i punti SI-ATRP come precedentemente descritto nei punti 4,1-4,4.

8. L'acetilene Funzionalizzazione di Catene micropatterned PEGMEMA

1. Mettere coverslide micropatterned in 20 ml di reazione flaconcino di vetro.
2. Aggiungere 6 ml di DMSO contenente 100 mMpropargylamine nel flaconcino di reazione. Mantenere questa reazione a temperatura ambiente per 24 ore.
   NOTA: Maneggiare DMSO e propargylamine solo in una cappa.
3. Al termine rimuovere il coverslide micropatterned dalla fiala di reazione e lavare con etanolo quindi acqua e asciugare in corrente di azoto.

9. rame-catalizzata "Click" biotinilazione di acetilene terminato Catene PEGMEMA

1. Mettere coverslide micropatterned in 20 ml di reazione flaconcino di vetro.
2. Aggiungere 6 ml di solfato di rame (15 mM) / Tris [(1-benzil-1H -1,2,3-triazol-4-il) metil] ammina (TBTA, 30 mM) (1: 1 v / v di acqua / DMF) contenente 562 mM azide-PEG ₄ -Biotin coniugato nel flaconcino di reazione. Aggiungere 1,2 ml di acido L-ascorbico (0,15 mM) in acqua alla miscela per inizializzare la reazione.
3. Bubble azoto attraverso la soluzione di reazione per 10 sec, sigillare la fiala con Parafilm e reagire per 24 ore a temperatura ambiente.
4. Su completion rimuovere coverslide micropatterned dal flaconcino di reazione, sciacquare con acqua e metterla in un piatto di polistirolo 12-bene.

10. immunofluorescenza Rilevamento di Biotinylated acetilene Gruppi

1. Bloccare coverslide micropatterned in DPBS (3% Donkey Siero) per 1 ora a temperatura ambiente. Colorazione per gruppi acetilene biotinilati con streptavidina-546 coniugato (2 mg / ml) in DBPs (3% asino siero in PBS) per 2 ore a temperatura ambiente.
2. Sciacquare coverslide micropatterned 5 volte con DPBS per 10 minuti e scuotendo con cautela.
   NOTA: Figura 4B illustra una immagine della diapositiva dopo questo passaggio è completato.

11. Rame esente "Click" biotinilazione di azoturo terminato Catene PEGMEMA

NOTA: Se lo si desidera, questa operazione modifica substrato può essere eseguita in situ durante la coltura cellulare.

1. Lascia coverslide micropatterned in 12 pozzetti ppiatto olystyrene seguente DBPs risciacqua.
2. Aggiungere 2 ml di DBPs (o cella di coltura) contenenti 20 mM DBCO-PEG ₄ -Biotin, e lasciare questa reazione di continuare per 24 ore a temperatura ambiente (o a 37 ° C in un incubatore).
3. Al termine, lavare coverslide micropatterned 5 volte con DPBS (o semplicemente eseguire un cambiamento media).

12. immunofluorescenza Rilevamento di Biotinylated azide Gruppi

1. Colorazione per gruppi azide biotinilati con streptavidina-488 coniugato (2 mg / ml) in 2 ml DPBS (3% asino siero) per 2 ore a temperatura ambiente.
2. Sciacquare coverslide micropatterned 5 volte in DPBS per 10 minuti e scuotendo con cautela.
3. Immagine micropatterned coverslide con microscopio confocale a fluorescenza. Figura 4A-C raffigura immagini della diapositiva dopo questo passaggio è completato.
   NOTA: Quando si utilizzano supporti per tessuti saggi di cultura, ignorare le sezioni 10 e 12 del presente protocollo. Dopo il degre desideratoe di funzionalizzazione, sterilizzare il coverslide ingegnerizzato risciacquando entrambi i lati con 100% di etanolo ed essiccamento in corrente di azoto. Trasferire i vetrini in una cappa di sicurezza biologica sterile e sciacquare il vetrino con PBS cinque volte prima di procedere con la semina e coltura cellulare.

Results

L'uso di tecniche di allineamento μCP manuali per ingegnere substrati di coltura con array di spazzole PEG-innestate funzionalizzati con ortogonali "click" chimiche è stata dimostrata in precedenti lavori ^6. Tuttavia, questo consente un controllo minimo dell'orientamento del modello e si traduce spesso in sovrapposizione delle aree funzionalizzati. Qui, un nuovo sistema R-μCP viene utilizzato per superare questa limitazione, e la sua capacità di precisione modello una serie di PEG pennello corone circolari co...

Discussion

Substrati ideali per l'ingegneria tissutale sarebbero bioispirati e quindi ricapitolano la distribuzione spaziale dei leganti critici bioattivi presenti all'interno dei tessuti nativi. Avrebbero anche possedere proprietà dinamiche che consentono regolazioni temporali dei leganti e dei modelli spaziali in cui sono presentati per consentire la morfogenesi dei tessuti diretto e spazialmente limitate induzione del destino cellulare. Fabbricazione di tali substrati richiede l'immobilizzazione di molteplici segnal...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
SCARA	Se	lo si desidera, sono disponibili modelli di fascia alta Epson	LS3-401ST
(Tridecafluoro-1,1,2,2-tetraidroottil)triclorosilano	Gelest	SIT8174.0	ATTENZIONE, Deve essere maneggiato solo in una cappa chimica. Quando si silanizzano i wafer, nessuno deve entrare nella cappa fino a quando tutto il silano non è stato evaporato.
Kit elastomero siliconico Sylgard 184	Ellsworth Adhesive Co NC9020938		Degassare accuratamente le soluzioni tramite esposizione al vuoto prima dell'uso. Sono accettabili kit alternativi come il Kit 182.
Vetrini di copertura #1 da 24 mm x 50 mm Fisher	Scientific	48393106	Questi possono essere acquistati da una serie di fornitori con dimensioni variabili in base alle esigenze.
CHA-600 Telemark Evaporatore a fascio di elettroni Telemark		SEC-600-RAP	richiede una formazione specializzata.
EPSON LS3 SCARA	EPSON	LS3-401ST
ω-mertcaptoundecil bromoisobutirrato	Prochimia	FT 015-m11-0.2	Conservare a -20 °C. Altri iniziatori ATRP possono essere utilizzati come questo R-μ La piattaforma CP è applicabile a tutte le modalità di micropatterning.
Schlenk Tubo Pallone 50 ml	Synthware	60003-078	Richiede tappi in gomma con diaframma.
Poli(glicole etilenico) metil etere metacrilato	Sigma Aldrich	447943	Spedito contenente inibitori readical liberi MEHQ e BHT.
Metanolo (certificato ACS)	Fisher Scientific	A412-4	ATTENZIONE, maneggiare solo in cappa chimica.
Bromuro di rame (II)	Sigma Aldrich	437867	ATTENZIONE, limitare l'esposizione con maschera chirurgica.
2,2'-Bipiridina	Sigma Aldrich	D216305	ATTENZIONE, limitare l'esposizione con maschera chirurgica.
Sodio L-Ascorbato	Sigma Aldrich	A4034
20 ml Fiale a scintillazione in vetro borosilicato	Fisher Scientific	03-340-4E
Sodio azide	Sigma Aldrich	S2002	ATTENZIONE, limitare l'esposizione con maschera chirurgica.
N,N-dimethyformamide	Sigma Aldrich	227056	ATTENZIONE, maneggiare solo in cappa chimica.
Etanolammina	Sigma Aldrich	398136	ATTENZIONE, maneggiare solo in cappa chimica.
Trietilammina	Sigma Aldrich	T0886	ATTENZIONE, maneggiare solo in cappa chimica.
Dimetilsolfossido	Sigma Aldrich	276855	ATTENZIONE, maneggiare solo in cappa chimica.
Propargylamine	Sigma Aldrich	P50900	ATTENZIONE, maneggiare solo in cappa chimica.
200 Proof Ethanol	University of Wisconsin Material Distribution Services	2292	ATTENZIONE, maneggiare solo in cappa chimica.
Azide-PEG3-Biotina	ClickChemistryTools	AZ104-100	Solubilizzato in DMF
Solfato di rame (II)	Sigma Aldrich	C1297	ATTENZIONE, limitare l'esposizione con maschera chirurgica.
Tris[(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil]ammina (TBTA)		Sigma Aldrich
Tampone	Sigma Aldrich	A7506
Soluzione salina	Invitrogen	14190144
Siero d'asina	Sigma Aldrich	D9663	articoli contaminati da siero d'asino sono considerati materiale a rischio biologico e devono essere smaltiti di conseguenza. Vari altri composti (ad es. BSA) sono disponibili e servono a questo scopo.
Piastra in Polistirene a 12 Pozzetti	Thermo Scientifit - NUNC	07-200-81	Le piastre possono essere acquistate da diversi fornitori con dimensioni variabili.
DBCO-PEG4-Biotina	Clickchemistytools	A105P4-10	Solubilizzato in DMF
Streptavidina, Alexa Fluor 488 Coniugato	Life Technologies	S-11223	Solubilizzato in PBS
Streptavidina, Alexa Fluor 546 coniugato	Life Technologies	S-11225	Solubilizzato in PBS
Nikon A1-R Microscopio confocale	Nikon	Nikon Eclipse Ti, A1R	Un microscopio a epifluorescenza è sufficiente per visualizzare substrati micropatternizzati funzionalizzati.