Alta Tecnica Throughput fluorometrica per la valutazione dei macrofagi fagocitosi e polimerizzazione

Sommario

Qui presentiamo un protocollo per quantificare la fagocitosi delle particelle fluorescenti da parte di una linea cellulare di macrofagi aderenti utilizzando un metodo fluorimetrico. Questo metodo facilita una quantificazione ad alto rendimento dell'internalizzazione delle particelle e della conseguente polimerizzazione dell'actina.

Abstract

L'obiettivo dell'analisi fluorimetrica è di servire come un efficiente, economico, metodo ad alta velocità di analisi di fagocitosi e di altri processi cellulari. Questa tecnica può essere utilizzata in una varietà di tipi di cellule, sia aderenti e non aderenti, per esaminare una serie di proprietà cellulari. Quando si studia la fagocitosi, tecnica fluorimetrica utilizza tipi di cellule fagocitiche come i macrofagi, e le particelle opsonizzati fluorescente cui fluorescenza può essere spento in presenza di blu trypan. Dopo la placcatura dei macrofagi aderenti in piastre a 96 pozzetti, particelle fluorescenti (verde o rosso) sono amministrati e le cellule sono autorizzati a fagocitare per vari periodi di tempo. Dopo internalizzazione delle particelle fluorescenti, le cellule vengono lavate con trypan blu, che facilita estinzione di segnale fluorescente dai batteri che non sono internalizzati, o sono semplicemente aderendo alla superficie cellulare. Al termine del lavaggio trypan, le cellule sono lavate con PBS, fisso, unnd colorati con DAPI (etichetta nucleare fluorescente blu), che serve a etichettare nuclei delle cellule. Con una semplice quantificazione fluorimetrico attraverso la lettura piatto di nucleare (blu) o particella (rosso / verde) di fluorescenza si può esaminare il rapporto tra unità di fluorescenza relativi di verde: blu e determinare un indice di fagocitosi indicativa della quantità di batteri fluorescenti interiorizzato per cella. La durata del test utilizzando un metodo e multicanale 96 pozzetti pipette per il lavaggio, da fine fagocitosi a fine acquisizione dati, è inferiore a 45 min. Citometria a flusso potrebbe essere utilizzato in modo simile, ma il vantaggio di fluorometria è la sua alta produttività, rapida metodo di valutazione con minima manipolazione dei campioni e veloce quantificazione di intensità fluorescente per cella. Strategie simili possono essere applicati a cellule non aderenti, batteri vivi etichettati, actina polimerizzazione, e sostanzialmente qualsiasi processo che utilizza fluorescenza. Pertanto, fluorimetria è un metodo promettente per il suo basso costo, alta throughpcapacità ut nello studio dei processi cellulari.

Introduzione

Quantificazione del segnale fluorescente è stato ampiamente utilizzato in una moltitudine di metodi scientifici che vanno dalla PCR, citometria a flusso, microscopia confocale e FRET analisi multiplex ELISA. Fluorescenza imaging e quantificazione ha una vasta applicazione e può essere un ottimo strumento per l'analisi quantitativa dei vari processi cellulari. L'uso di marcatori fluorescenti e il loro segnale è stato rivoluzionato negli ultimi dieci anni, e la comparsa di lettori di piastre fluorescenti ha facilitato l'alta quantificazione throughput fluorescenza emessa durante i processi cellulari.

Analisi fluorimetrica può se....

Protocollo

NOTA: Questo protocollo può essere utilizzato per più applicazioni come la quantificazione della fagocitosi e polimerizzazione usati nel nostro lavoro precedentemente pubblicato ^12. Il protocollo si presta ad una varietà di modifica e tipi e particelle Tabella 1 elenca cellulari impiegato con successo in studi precedenti. Uso standard di questo protocollo per la quantificazione di fagocitosi o polimerizzazione è illustrato in Figura 1.

Risultati

Due modi principali di quantificare fagocitosi e la successiva polimerizzazione actina attraverso l'utilizzo di questo protocollo è di osservare la fagocitosi continua o sincronizzato.

Analisi microscopica (Figura 1B) mostra immagini fluorescenti paragonabili a ciò che il fluorimetro sta registrando (vedi anche Figura 1). Nella Figura 1B sono fluorescenza rossa di actina, verde 268 fluorescenza FITC etichette HKOP E. coli, macchia D.......

Discussione

I principali limiti della tecnica fluorimetrica sono varianza sperimentale nonché perdita cellulare associata con ampio lavaggio e l'uso di cellule non aderenti.

Variance si osserva soprattutto a causa della variazione di particelle fluorescenti come pesatura e pipettaggio durante la preparazione della soluzione madre non è un modo esatto di mantenere numeri identici di particelle da esperimento per esperimento. Per affrontare il problema della varianza tra esperimenti, i dati possono es.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1 μ m Fluo-Sfere fluorescenti giallo-verdi;	Sonde molecolari	F8852	combinano 50μ L con 50μ l reagente opsonante per 30 minuti a 37oC prima dell'uso
Calore ucciso E. coli BioParticles fluoresceina coniugato	Sonde molecolari	E2861	ricostituire (5 mg) in 50 μ l di PBS e combinare con 50 μ l. reagente opsonante per 30 min a 37 gradi C prima dell'uso
Reagente Opsonizzante	Sonde molecolari	E2870
Sonde molecolari	rodamina falloidina	R415
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Trypan blue	Gibco	15250-061
Gli articoli seguenti sono disponibili in molte marche, ma gli articoli che abbiamo utilizzato in questo studio provengono dai seguenti produttori:
Terreni di crescita cellulare RPMI	Gibco		Integrato con il 10% di FBS e l'1% di penniccia/streptomicina; caldo in 37 gradi C prima dell'uso
Lettore di piastre fluorescenti - Fluostar Omega	BMG Labtech
Paraformaldeide (16%)	Fischer Scientific	AA433689M	diluire al 4% prima dell'uso
Piastre a 96 pozzetti	Greiner	655097	trasparente o fondo nero o trasparente - piastre nere Pipetta
multicanale (8 - 12 canali)
Serbatoi di
1x Provette per
(0,6 ml)
Conicole (10 ml)