Articolo metodologico

Una procedura di impianto del Camera spinale per longitudinale In Vivo Imaging del cavo del mouse spinale

14.6K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/52196

⸱

3 dicembre 2014

 , 
1Department of Neurobiology and Behavior, Cornell University, 2Department of Biomedical Engineering, Cornell University

In questo articolo

Sommario

In questo video, si descrive un procedimento per impiantare una camera di imaging ottico cronica nel midollo spinale dorsale di un topo vivo. La camera, procedura chirurgica, e di imaging cronica sono rivisti e dimostrati.

Abstract

Gli studi sulla neocorteccia dei mammiferi hanno permesso una risoluzione senza precedenti della struttura corticale, dell'attività e della risposta agli insulti neurodegenerativi mediante ripetute immagini in vivo time-lapse in roditori vivi. Questi studi sono stati resi possibili da semplici procedure chirurgiche, che hanno consentito l'accesso ottico per un periodo di tempo prolungato senza ripetere le procedure chirurgiche. Al contrario, studi analoghi del midollo spinale sono stati precedentemente limitati a poche sessioni di imaging, ognuna delle quali ha richiesto un intervento chirurgico invasivo. Come descritto in precedenza, abbiamo sviluppato una camera spinale che consente l'accesso ottico continuo per un massimo di 8 settimane, preserva la stabilità meccanica della colonna vertebrale, è facilmente stabilizzabile esternamente durante l'imaging e richiede un solo intervento chirurgico. Qui, viene rivisto il design della camera spinale con i relativi strumenti chirurgici e viene dimostrata in dettaglio la procedura chirurgica. In breve, questo video dimostrerà la preparazione dell'area chirurgica e del topo per l'intervento chirurgico, l'esposizione della vertebra spinale e l'appropriato sbrigliamento dei tessuti, la consegna dell'impianto e il clampaggio vertebrale, il completamento della camera, la rimozione del sistema di rilascio, la sigillatura della pelle e, infine, la cura post-operatoria. Verrà inoltre dimostrata la procedura per l'imaging cronico in vivo mediante microscopia non lineare. Infine, vengono discussi i risultati, le limitazioni, la variabilità tipica e una guida per la risoluzione dei problemi.

Introduzione

Time-lapse in microscopia vivo negli organismi intatti permette la visualizzazione diretta di processi biologici complessi che sono inaccessibili ad un'analisi tradizionale unico punto-tempo, come immunoistochimica. In particolare, la microscopia multi-fotone (MPM) 1 permette l'imaging in dispersione tessuti, come la neocorteccia roditore, dove è stato raggiunto immagini fino a 2,3 e in eccesso su 4 1 mm. Quando combinato con preparazioni chirurgiche 5-7 in cui un singolo procedimento consente accesso ottico al cervello per settimane o mesi, questi approcci microscopia sono stati utilizzati per studiare processi dinamici nel cervello in stati sani e malati 8-11. Inoltre, sono stati sviluppati protocolli 12,13 che prevedono l'imaging in vivo in sveglio (cioè, non anestetizzati) animali, consentendo cellulari risoluzione imaging funzionale durante saggi comportamentali. Questi protocolli sono stati utilizzati per comparisons di correlata attività neuronale 14, astrociti calcio segnalazione 15 in animali anestetizzati e sveglio, l'identificazione di specifici task-clusters neuronali 16, e la capacità dei neuroni di discriminare posizione dell'oggetto su baffo stimolazione 17.

Dato il potenziale di questo approccio per chiarire i meccanismi sani e patologici, time-lapse imaging in vivo è stato applicato al midollo spinale del mouse (SC), consentendo l'identificazione di degenerazione assonale acuta (AAD) come meccanismo malattia 18. Studi successivi effetti di lesioni periferiche su gangli spinali (DRG) assone rigenerazione 19, il ruolo dei vasi sanguigni in assonale rigenerazione 20, chemiotassi gliali in risposta al danno 21, la migrazione delle cellule T in encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) 22, l'attività indagati di microglia 23,24 e astrociti 25 in risposta a amyotrophsclerosi ic laterale (ALS), il ruolo di STAT-3 in sprouting assonale dopo la lesione SC (SCI) 26, e un meccanismo di perdita di assoni e recupero in EAE 27. Nonostante il successo di questi approcci, tutti questi studi sono stati limitati a una singola sessione di imaging, limitando così gli studi di dinamica a breve termine, o altrimenti richiesto ripetute aperture chirurgiche dell'animale in ogni punto di tempo di imaging, limitando il numero di punti di tempo accessibili e aumentando la probabilità di artefatti sperimentali confondenti. Protocolli per questi interventi sono stati pubblicati in precedenza 28,29.

Recentemente, abbiamo pubblicato una tecnica 30 per l'impianto di una camera spinale cronica che ha permesso time-lapse MPM immagini nel topo SC su più settimane senza la necessità di interventi di ripetizione. Brevemente, questa preparazione chirurgica inclusa eseguendo laminectomia nella colonna toracica inferiore e l'impianto di una camera di quattro parti. La camera inclusotre parti in acciaio inox custom-lavorati che serrate le vertebre che circonda la laminectomia, ed un vetrino di vetro posto sopra la SC e fissato con elastomero siliconico. Questa tecnica ha permesso per l'imaging di routine ad più di 5 settimane dall'intervento in stati sani e feriti, senza la necessità di interventi di ripetizione. Il numero di punti di tempo di imaging è stato limitato soltanto dalla frequenza alla quale l'animale può tollerare induzione anestetica. Imaging durata era limitata dalla crescita di una fitta, tessuto fibroso sulla superficie del SC. Inoltre, abbiamo verificato che l'impianto chirurgico non ha avuto effetto a lungo termine sulla funzione motoria.

Dato che la nostra prima pubblicazione, approcci alternativi che consentano anche di imaging a lungo termine nella SC sono stati descritti altrove 31-33. Questo protocollo dimostra la nostra procedura per impiantare la camera di midollo abbiamo sviluppato.

Protocollo

NOTA: La cura e la manipolazione sperimentale di tutti i topi in questo documento è stato approvato dal Institutional Animal Care and Use Committee Cornell University.

1. Impostazione di Chirurgia

  1. Sterilizzare tutti gli strumenti necessari tramite autoclave o procedure di sterilizzazione approvate. Come minimo, includere un bisturi, forbici, forbici Vanna, pinze, cacciavite del gioielliere, tamponi di cotone, un insieme di divaricatori, l'impianto (Figura 1A) e il suo sistema di erogazione (Figura 1D, E).
  2. Pulire tutte le superfici, comprese le manopole stereoscopio, con il 70% di etanolo e / o disinfettanti idonei.
  3. Creare un campo sterile sovrapponendo il stereotax personalizzato (Figura 1D) e da banco circostante con teli sterili. Una piastra elettrica (preferibilmente retroazione controllata) deve essere posto sulla parte superiore della stereotax e sotto i teli sterili.

2. Preparazioneil mouse di Chirurgia

  1. Anestetizzare un topo sotto 5% isoflurano / ossigeno in una camera di induzione fino tasso di respirazione rallenta a circa 1 respiro / sec.
  2. Trasferimento del mouse in un'area intermedia di distanza dal campo sterile, con un cono di continuare l'esposizione isoflurano. Ridurre isoflurano al 2%. Applicare collirio per evitare l'essiccazione della cornea.
  3. Somministrare glicopirrolato (un farmaco anticolinergico) a 0.05 mg / 100 g del mouse intramuscolare nelle arti posteriori utilizzando 29 - 30 aghi G e 3/10 siringa cc, fornendo circa il 50% del volume di iniezione per ogni arto.
    NOTA: Glicopirrolato serve per evitare l'accumulo di liquido nei polmoni, mentre il mouse è sotto anestesia.
  4. Utilizzando tagliatori elettrici, radere una porzione della faccia dorsale del mouse, lunga circa 3 cm di 2 cm di larghezza e centrate sull'arco toracica. Pulire tutti i capelli tagliati ben lontano dalla zona rasata.
  5. Amministrare i seguenti iniezioni sottocute e distale al rasatapatch con 29 - 30 aghi G e 3/10 siringhe cc: 1 ml / 100 g di mouse 5% di glucosio in soluzione salina (per l'idratazione), 5 mg / kg ketoprofene mouse (un FANS per analgesia), 0,2 mg / kg di mouse desametasone ( uno steroide antinfiammatori per ridurre l'infiammazione).
  6. Utilizzando tamponi di cotone, effettuare tre lavaggi alternati di iodio e il 70% di etanolo, in attesa 1 min tra lavaggi.
  7. Somministrare 100 ml di 0,125% bupivacaina (un blocco nervoso periferico) per via sottocutanea con 29-30 aghi G e 3/10 cc siringa al centro della patch rasata per ridurre il dolore al sito di incisione.
  8. Trasferimento del mouse al stereotax personalizzato (Figura 1D), inserire termometro rettale, e attendere circa 10 minuti per bupivicaina abbia effetto.

3. Esporre e pulire la Dorsale lamine 3 Adiacente Vertebra toracica

  1. Usando il bisturi, creare un piccolo (5 mm o meno) incisione sopra le vertebre di interesse (Figura 2A).
  2. Utilizzando sia pinze o inserendo la punta di forbici chirurgiche e diffondere le maniglie, aumentare la dimensione della apertura nella pelle per dissezione.
  3. Usando un bisturi o forbici chirurgiche, dissociare delicatamente fascia connettivo tra la pelle e il muscolo sottostante.
  4. Utilizzare divaricatori per trattenere la pelle, consentendo la più ampia area di lavoro possibile (Figura 2B). Evitare di aumentare il carico sul petto e quindi ostacolare la respirazione.
  5. Utilizzando un paio di pinze, afferrare il rostrale-più vertebra che sarà esposto attraverso il muscolo sovrastante. Usando un bisturi, tagliare tessuti distanza su entrambi i lati del processo dorsali da ogni 3 vertebre (figura 2c).
  6. Usando una combinazione di un bisturi, tamponi di cotone, e / o raschietto osso, rimuovere tutto il tessuto sovrastante dal lamine dorsale (Figura 2D).
  7. Utilizzando le forbici chirurgiche, accuratamente tagliato via i tendini collegati alle vertebre su entrambi Lateral bordi della colonna vertebrale (Figura 2E).
  8. Usando il bisturi, rimuovere delicatamente più tessuto dai bordi laterali della colonna vertebrale possibile al fine di fornire una superficie di bloccaggio pulita.
  9. Sbrigliare delicatamente le vertebre di un tessuto molle rimanente con un raschietto osseo e / o tampone di cotone. Tagliare via qualsiasi tessuto incongrua altrove con le forbici chirurgiche (Figura 2F).
    NOTA: E 'essenziale sia per il bloccaggio e l'esecuzione della laminectomia dorsale che le vertebre sono esposti in modo pulito. Un cauterizer può essere utile nel controllo successiva sanguinamento.
  10. Spostare divaricatori per trattenere il tessuto circostante la colonna vertebrale in aggiunta alla pelle (Figura 2F).
  11. Fissare le barre laterali di impianto per le punte sui posti di consegna e caricare questi in post-titolari (come in Figura 1E).
  12. Bloccare il 3 vertebre utilizzando le barre laterali, applicando una pressione sufficiente per tenere securely (Figura 2G, H). Utilizzare pinze per contribuire a garantire un livello di bloccaggio del 3 vertebre. Si noti che diversi tentativi possono essere necessarie. Assicurarsi che le barre laterali sono sia di livello e parallelamente prima di eseguire la laminectomia.
  13. Pulire e asciugare la superficie dorsale delle vertebre bloccato utilizzando tamponi di cotone.

4. Eseguire una dorsale laminectomia

  1. Inserire le punte delle forbici Vännäs nello spazio epidurale della vertebra bloccato mediale e stringere le impugnature leggermente; se l'osso è asciutto, dovrebbe crepa lungo la lunghezza della lamina dorsale. Ripetere questa procedura sul lato controlaterale per rilasciare la lamina.
  2. Presa delicatamente la lamina sciolto dal processo dorsale con una pinza, tagliare attentamente tutta tessuto connettivo alle estremità rostrale e caudale della lamina e toglierlo.
  3. Usando 0,9% soluzione salina e / o artificiale cerebrale liquido spinale (ACSF), lavare via ogni overlyi sangueng il midollo spinale. Usare tamponi di cotone per assorbire il liquido in eccesso.
  4. Utilizzando forbici Vännäs, ritagliare con attenzione i bordi laterali della spina dorsale alle barre laterali della protesi. Anche in questo caso, lavare via e controllare il sanguinamento con tamponi di cotone e saline / ACSF.
  5. Nel caso in cui una porzione di periostio è staccato e sovrasta il midollo spinale, rimuovere delicatamente questo tessuto utilizzando tamponi di cotone e / o un 29 - ago G 30. Fare attenzione a non danneggiare il midollo spinale in questa parte della procedura. Non confondere il periostio sciolto con la dura madre strettamente avvolto.
  6. Cautela, sigillare i bordi rimanenti esposte della osso con uno o entrambi acrilico e cianoacrilato dentale (Figura 2I). Fare attenzione a non consentire le colle di scorrere sul midollo spinale esposto.

5. Seal la Camera

  1. Posizionare la piastra superiore con attenzione in modo che i 4 slot si allineano con i 4 fori sulle barre laterali e l'apertura sovrappone lo spin espostoal cavo (Figura 1B e 2J).
  2. Utilizzando un cacciavite il gioielliere, avviare accuratamente la prima vite, stabilizzando l'albero del cacciavite con un altro paio di pinze. Non serrare la vite in questa fase, ma inserirla in modo che i primi fili vengono impegnati. Ripetere questa procedura per gli altri 3 viti.
    NOTA: È utile usare titanio o altre pinze non magnetizzabili per posizionare le viti in questa fase.
  3. Con tutti i 4 viti in atto, serrare ogni vite turno dalla stessa quantità di piccoli incrementi fino viti sono saldamente fissate (Figura 2K). Si noti che non è insolito per la piastra superiore di flettersi durante questo processo. Fare attenzione a non stringere le viti troppo, come la testa della vite può rompere e l'eccessiva pressione al ribasso sloggiare il morsetto e / o provocare lesioni del midollo spinale.
  4. Utilizzare un elastomero siliconico per riempire lo spazio tra il midollo spinale e la finestra di vetro. Perché does non producono acido acetico durante la polimerizzazione, utilizzare KwikSil marca elastomero e punte di miscelazione. Applicare una porzione abbondante di silicone al midollo spinale esposto. Fare attenzione a sbarazzarsi di qualsiasi silicone contenente bolle d'aria dalla punta di miscelazione prima dell'applicazione al midollo spinale.
  5. Lavorando in fretta, premere delicatamente a 5 mm # 0 coprioggetto nel riquadro nella piastra superiore. Applicare una pressione sufficiente a comprimere gradualmente l'elastomero liquido circondare il midollo spinale, ma non provocare compressione midollare (Figura 2L). Tempo di presa per l'elastomero è di circa 90 sec, in modo da assicurarsi il vetrino viene applicato rapidamente.
  6. In caso di tenuta fallito, attendere che l'elastomero ha fissato, rimuovere delicatamente dall'impianto con una pinza, e ripetere 5,4-5,5.
  7. Coprire i bordi di elastomero agglomerato con dentale acrilico / cianoacrilato e rispettare l'osso circostante il più possibile per evitare l'elastomero sposti sulla superficie del midollo spinale.
  8. Rimuovere divaricatori e tirare la pelle attorno al bordo dell'impianto. Utilizzando cianoacrilato, aderire alla pelle ai bordi dell'impianto (Figura 2M, N).
  9. Inserisci # 0-80 - 1/4 "set viti nelle ali della piastra superiore (Figura 1C e 2 O).
  10. Utilizzando acrilico dentale, sigillare eventuali lacune nelle fessure delle viti della piastra superiore (Figura 2P).

6. Cura postoperatoria

  1. Rimuovere animali da anestesia e posto in una grande gabbia pulita. Assicurarsi che la gabbia è sufficientemente grande che la camera non intoppo su nulla (come il dip a V per una bottiglia di acqua e / o cibo) nel corso del normale locomozione tutta la gabbia.
    NOTA: Una gabbia di ratto standard è l'ideale.
  2. Posizionare la gabbia su una superficie riscaldata mentre l'animale recupera. Non restituire il mouse per la compagnia di altri animali fino a quando non ha pienamente recuperato.
  3. Controllare Beha animaliVior entro 1 - 2 ore postoperation per i segni di dolore o angoscia e l'integrità dell'impianto.
    NOTA: In condizioni normali, l'animale deve essere in grado di deambulare con modeste perturbazioni al movimento.
  4. Continuare a controllare animale ogni 8-12 ore per il primo 72 ore, misurare il peso e il comportamento di monitoraggio. Verificare che gli animali sono attivi e mobili durante la notte. Cibo umido in forma di terra Chow mescolato con acqua o gel nutrizionali, pellets Chow, e l'acqua potabile dovrebbe essere fornita a livello del suolo. Ulteriori idratazione con iniezioni sottocutanee o intraperiotoneal dovrebbe essere fornita, se necessario.
  5. Somministrare 5 mg / kg del mouse ketoprofene e 0,2 mg / kg per via sottocutanea del mouse desametasone a 24 e 48 punti di tempo ora, dopo l'intervento. Inoltre, ,005-,010 mg / 100 g mouse deve essere somministrato ogni 8 ore per iniezione sottocutanea per 72 hr.

7. In Vivo Imaging

  1. Anestetizzare un topo sotto5% isoflurano / ossigeno in una camera di induzione frequenza respiratoria rallenta fino a circa 1 respiro / sec.
  2. Trasferire il mouse per il stereotax personalizzato (Figura 1D) con feedback controllato piastra elettrica e inserire il termometro rettale. Ridurre isoflurano al 2%.
  3. Somministrare glicopirrolato 0,05 mg / 100 g del mouse intramuscolare nelle arti posteriori utilizzando 29 - 30 aghi G e 3/10 siringa cc, fornendo circa il 50% del volume di iniezione per ogni arto.
  4. Somministrare 1 ml / 100 g del mouse 5% di glucosio (per idratazione sottocutanea) in soluzione salina volta per ora.
  5. Inserire i titolari camera filettati nei post-titolari utilizzati per la chirurgia (Figura 1F). Regolare l'altezza e girare i posti sulle viti nella piastra superiore.
  6. Con entrambi i supporti attaccati, elevare i titolari nel post-titolari fino al torace può espandersi liberamente su ispirazione.
    NOTA: Sia il fermo attaccamento dei titolari e la libera espansione della significan pettoTLY ridurre artefatti di movimento a causa di respirazione.
  7. Eseguire l'imaging come desiderato.
  8. Quando l'imaging è completo, posti più bassi, twist off titolari camera, rimuovere termometro rettale, e posto il mouse su una superficie riscaldata per recuperare. Non restituire il mouse per la compagnia di altri animali fino a quando non ha pienamente recuperato.

Risultati

Seguendo la procedura sopra, ogni fase della chirurgia dovrebbe imitare i risultati per ogni fase della chirurgia delineato nella Figura 2. Particolare cura deve essere presa quando si applica l'elastomero siliconico per eliminare le bolle d'aria sotto la lente, o almeno garantire che siano situato alla periferia dell'area di interesse (Figura 2L). Per un chirurgo esperto, le complicanze chirurgiche che richiedono l'eutanasia sia durante l'intervento chirurgico o entro il primo 24 ore dopo l'intervento chirurgico si verificano in circa il 20% delle operazioni. Queste complicazioni più frequentemente derivano dall'eccessiva emorragie tessuti molli o mancata fissare saldamente la camera alla colonna vertebrale.

In camere impiantati con successo, la finestra rimane tipicamente otticamente trasparente per più settimane (Figura 3). Nonostante gli sforzi, una opaca, fibrosa, la crescita neoplastica costituisce spesso entro pochi giorni, con conseguente parziale obscuring della finestra (Figura 3C - F, nero linea tratteggiata). Strutture fluorescenti sono difficili da vedere al microscopio 2PEF sotto questo tessuto fibroso. Troviamo una distribuzione bimodale dei risultati, con circa il 50% delle finestre impiantati con successo rimanendo chiaro per più di 5 settimane dopo l'intervento, e circa il 50% diventando offuscato entro 1 - 3 settimane. Per le finestre che rimangono chiare, la maggior parte dei posti all'interno della finestra di esperienza visiva solo un modesto grado di neovascolarizzazione in o al di sopra della dura (Figura 3D - F, asterischi verde), che non ostacola l'imaging 2PEF. Il nostro studio precedente 30 ha mostrato un aumento di microglia, ma non la densità astrocyte sotto la finestra e vertebre adiacenti, indicando lieve infiammazione analogo a quello visto in finestra preparati cranici 5.

Nei topi transgenici che esprimono la proteina fluorescente gialla (YFP) in un sottogruppo di dorsale radice Ganglia (DRG) neuroni (linea YFPH; Jackson Labs), gli assoni erano chiaramente distinguibili per settimane dopo l'intervento (Figura 4A e b), e fino a quattro mesi in un animale (dati non riportati). I vasi sanguigni (Figura 4A e B) sono stati resi visibili dal retro-orbitale iniezione fluorescente Texas Red etichettato destrano nel plasma sanguigno. Microglia sono stati visualizzati in topi che esprimono GFP in un CX3CR1 topo knock-in (CX3CR1-GFP; Jackson Labs) attraversato la linea YFPH (Figura 4C). Contrasto e risoluzione deteriorata modestamente nel tempo (Figura 4C) a causa della formazione di una proliferazione fibrosa 30 precedentemente descritto. Abbiamo regolarmente ripreso per 3 ore in una singola sessione, senza mortalità e come spesso come ogni 12 ore. La durata della sessione e frequenza è limitata dalla tolleranza dell'animale per l'induzione di anestesia, in concomitanza con le considerazioni etiche accompagnano dolore e disagio per animali da laboratorio.

< p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "always"> figure-results-1
Figura 1. Una suite chirurgica personalizzata facilita consegna camera durante l'impianto e stabilizza la camera durante sessioni di imaging successive. Due barre laterali e una piastra superiore (A) sono montate (B) utilizzando piccole viti nella camera spinale (C). Un tavolo operatorio con posti estensibili (D) consente per la consegna ed il bloccaggio delle barre laterali per le vertebre con spine di tenuta (E). Sessioni di imaging successive invece utilizzano i messaggi filettati internamente per collegare alla camera tramite le viti di fermo sulle ali della protesi (F). Panel b di questa figura è stata modificata da Farrar et al., Nature Methods, 2012 30 con il permesso di Nature Publishing Group.96 / 52196fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figure-results-2
Figura 2. Un laminectomia dorsale è eseguito e una camera di imaging cronica è impiantato per fornire accesso ottico al midollo spinale. La procedura è descritta nel montaggio. Innanzitutto, la pelle (pannelli A, B; sezioni protocollo 3.1- 3.4 -) e muscoli (C; 3,5) vengono retratti per esporre tre vertebre sottostante. Il tessuto sovrastante questi tre vertebre viene rimossa (D, E, F; 3,6-3,10) ei processi laterali sono raschiati pulite prima di essere fissati su entrambi i lati (G, H, 3.12). Attenzione, la lamina dorsale della vertebra centrale è rimosso ei bordi dell'osso sigillato (I (J, 5.1) e le viti fissata in posizione (K; 5.3) per fissare la camera prima di sigillare la camera con elastomero di silicone e vetro di copertura (L; 5.5). Dopo che le spine di consegna sono rimossi (M; 5.8), la pelle è incollato ai lati della camera (M, N, 5,8) e le viti sono inserite nelle ali (O; 5.9). Infine, gli slot delle viti sono sigillati con materiale acrilico dentale (P; 5.10). E il mouse è posto in una gabbia pulita per recuperare Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figure-results-3

Figura 3. Una camera spinale cronica rimane ov otticamente trasparenteer più settimane. Immagini luce bianca del midollo spinale, che vanno da alcuni minuti (A) a tre settimane dopo l'intervento (F). Punti di riferimento vascolari sono identificabili in tutti i tempi (frecce gialle). Piccolo cambiamento è visto in un giorno dopo l'intervento chirurgico (B). Dense proliferazione fibrosa (C - F, delimitata da linea tratteggiata in basso a destra) è presente fin da tre giorni e risultati di offuscamento parziale l'area di esposizione. Neovascolarizzazione Mild (D, E, F, asterischi verdi) è presente, ma non oscura la vascolarizzazione originale in luce bianca o di imaging 2PEF. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figure-results-4

Figura 4. Una camera spinale cronica consente ripetuto l'imaging multi-photon senza la necessità di interventi di ripetizione. immagini ripetuta di topi transgenici esprimenti YFP in un sottoinsieme di assoni DRG (verdi) nelle funiculi dorsali del midollo spinale e vascolare (rosso) etichettati da intravascolare iniettabile colorante (A, B). L'attività di microglia (malva) può anche essere seguito nel tempo Thy1-YFP / CX3CR1-GFP doppio topi transgenici (C). Mentre assoni e microglia rimangono visibili, il contrasto e la risoluzione declino modestamente nel corso del tempo (C). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussione

La tecnica dimostrata qui consente ripetute, temporizzata, imaging in vivo del mouse dorsali SC ad molte settimane post operativamente senza la necessità di ulteriori interventi chirurgici. Questa procedura rappresenta un notevole miglioramento rispetto studi di imaging repeat-chirurgia o su approcci istologici portmortem, dove le informazioni sulle dinamiche cellulari è perso. Abbiamo già 30 hanno dimostrato il valore di questa tecnica per lo studio SCI patologia in vivo.

La portata massima longitudinale di imaging è stato determinato dalla crescita di un denso tessuto fibroso sulla superficie dorsale del SC. Nel tempo, questa crescita ha portato alla perdita di contrasto e risoluzione. Questa crescita è stata vista anche in preparazioni chirurgiche alternative 31. Aneddoticamente, abbiamo osservato che questa crescita può essere minimizzato lavando accuratamente la superficie dorsale SC per rimuovere i prodotti del sangue, tenuta la superficie dil'osso taglio con cianoacrilato, bordi della camera di tenuta bene con elastomero di silicone, e minimizzando lo spazio interstiziale tra la SC dorsale e il vetro di copertura.

Recentemente, un altro approccio simile alla nostra con una camera di policarbonato è stata dimostrata 32. L'uso di policarbonato è vantaggioso poiché è compatibile con X-ray e modalità di imaging acustiche, che non è il caso per i nostri parti in acciaio inossidabile. Tuttavia, con la tecnologia ormai onnipresente di stampanti 3D, parti della camera possono essere fabbricati da un'ampia varietà di materiali per soddisfare esigenze specifiche. Abbiamo recentemente stampato tutte le nostre parti in un chiaro fotopolimero.

Uno svantaggio fondamentale di una camera chiusa è l'incapacità di amministrare ripetuti dosaggi di farmaci o coloranti esogeni adatti per l'imaging SC 34. Tuttavia, capitalizzando sulla stabilità meccanica del nostro sistema attuale, abbiamo già usato la nostra camera presente per il successoly ancorare un catetere intratecale collegato ad una porta di iniezione sottocutanea impiantato, che ha permesso per la consegna della droga in diversi punti temporali anche in un sistema di camera chiusa (inedito). Inoltre, a causa della natura modulare della piastra superiore, versioni future di questa preparazione includeranno una camera richiudibile per consentire l'applicazione ripetuta di entrambi gli agenti terapeutici e etichette fluorescenti. È anche possibile prevedere piastre superiori con supporti per la registrazione di elettrodi, inserti ottici e porte per drug delivery. Tali integrazioni sarebbe probabilmente più difficile attuare utilizzando il sistema più minimalista Fenrich et al. 31. In conclusione, la nostra camera offre una piattaforma di gateway su cui diversi esperimenti possono essere basati.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare e non hanno interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

Ringraziamo il Dr. Joseph R. Fetcho per il suo contributo durante lo sviluppo della procedura. Ringraziamo il National Institutes of Health degli Stati Uniti (R01 EB002019 a C.B.S e DP OD006411 a Joseph R. Fetcho) e il National Science and Research Council of Canada (a M.J.F.) per il sostegno finanziario.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Forbici VannasFine Science Tools15000-04
pinze, forbici, bisturi, ecc.Strumenti di scienza finemultipli
kit divaricatore -fissatore magneticoFine Science Tools18200-02
kit divaricatore -divaricatoreFine Science Tools18200-09possono essere utilizzati anche altri divaricatori
kit divaricatore -elastomeroFine Science Tools18200-07
coperta riscaldante controllata dal feedbackCWE Inc.Modello: TC-1000 Mouse                          Codice 08-13000
stereotaxvedi Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplemento (online)
spinalevedi Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplemento (online)
camera spinalevedi Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplemento (online)
Colla cianoacrilicaLoctiteLoctite 495multiplo fornitori
Teets Cold Cure Coral Powder (polvere acrilica dentale)TeetsMfg. Parte: 8101fornitori multipli
Teets Cold Cure Liquid (liquido acrilico dentale)TeetsMfg. Parte: 8501fornitori multipli
GlicopirrolatoMWI Fornitura veterinariaMWI SKU: 29706 (Baxter 1001901602)
-(+)-GlucosioSigma-AldrichG5767
BupivacainaMWI Forniture veterinarieMWI SKU: 029841 (Hospira 116301)
KetoprofeneMWI Forniture veterinarieMWI SKU: 002800 (Pfizer 2193)
DesametasoneMWI Forniture veterinarie MWISKU: 501012 (VetOne 1DEX032)
KwikSil ElastomerWorld Precision Inc.KWIK-SIL
KwikSil Punte di miscelazioneWorld Precision Inc.KWIKMIX
camera supporti per D

Riferimenti

  1. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  2. Theer, P., Hasan, M. T., Denk, W. Two-photon imaging to a depth of 1000 μm in living brains by use of a Ti: Al 2 O 3 regenerative amplifier. Optics Letters. 28 (12), 1022-1024 (2003).
  3. Kobat, D., Durst, M. E., Nishimura, N., Wong, A. W., Schaffer, C. B., Xu, C. Deep tissue multiphoton microscopy using longer wavelength excitation. Optics Express. 17 (16), 13354-13364 (2009).
  4. Horton, N. G., Kobat, D., Wang, K. In Vivo, Deep Tissue Three-Photon Imaging at the 1700-nm Spectral Window. Biomedical Optics. 7 (3), (2012).
  5. Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
  6. Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).
  7. Drew, P. J., et al. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nature methods. 7 (12), 981-984 (2010).
  8. Misgeld, T., Kerschensteiner, M. In vivo imaging of the diseased nervous system. Nature Reviews Neuroscience. 7 (6), 449-463 (2006).
  9. Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50 (6), 823-839 (2006).
  10. Kerr, J. N. D., Denk, W. Imaging in vivo: watching the brain in action. Nature Reviews Neuroscience. 9 (3), 195-205 (2008).
  11. Lichtman, J. W., DENK, W. The Big and the Small: Challenges of Imaging the Brain's Circuits. Science. 334 (6056), 618-623 (2011).
  12. Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging Large-Scale Neural Activity with Cellular Resolution in Awake, Mobile Mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
  13. Wienisch, M., Blauvelt, D. G., Sato, T. F., Murthy, V. N. Two-Photon Imaging of Neural Activity in Awake, Head-Restrained Mice. Neuromethods. 67 (18), 45-60 (2011).
  14. Greenberg, D. S., Houweling, A. R., Kerr, J. N. D. Population imaging of ongoing neuronal activity in the visual cortex of awake rats). Nature Neuroscience. 11 (7), 749-751 (2008).
  15. Thrane, A. S., Thrane, R. V., Zeppenfeld, D., Lou, N., Xu, Q., Nagelhus, E. A., et al. General anesthesia selectively disrupts astrocyte calcium signaling in the awake mouse cortex. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (46), 18974-18979 (2012).
  16. Dombeck, D. A., Graziano, M. S., Tank, D. W. Functional Clustering of Neurons in Motor Cortex Determined by Cellular Resolution Imaging in Awake Behaving Mice. Journal Of Neuroscience. 29 (44), 13751-13760 (2009).
  17. Connor, D. H., Peron, S. P., Huber, D., Svoboda, K. Neural activity in barrel cortex underlying vibrissa-based object localization in mice. Neuron. 67 (6), 1048-1061 (2010).
  18. Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nature Medicine. 11 (5), 572-577 (2005).
  19. Ylera, B., Ertürk, A., et al. Chronically CNS-Injured Adult Sensory Neurons Gain Regenerative Competence upon a Lesion of Their Peripheral Axon. Current Biology. 19 (11), 930-936 (2009).
  20. Dray, C., Rougon, G., Debarbieux, F. Quantitative analysis by in vivo imaging of the dynamics of vascular and axonal networks in injured mouse spinal cord. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (23), 9459(2009).
  21. Dibaj, P., et al. NO mediates microglial response to acute spinal cord injury under ATP control in vivo. Glia. 58 (9), 1133-1144 (2010).
  22. Kim, J. V., et al. Two-photon laser scanning microscopy imaging of intact spinal cord and cerebral cortex reveals requirement for CXCR6 and neuroinflammation in immune cell infiltration of cortical injury sites. Journal of Immunological Methods. 352 (1-2), 89-100 (2010).
  23. Dibaj, P., et al. In Vivo imaging reveals distinct inflammatory activity of CNS microglia versus PNS macrophages in a mouse model for ALS. Plos One. 6 (3), 17910(2011).
  24. Davalos, D., et al. Fibrinogen-induced perivascular microglial clustering is required for the development of axonal damage in neuroinflammation. Nature Communications. 3, 1227(2012).
  25. Dibaj, P., Steffens, H., Zschüntzsch, J., Kirchhoff, F., Schomburg, E. D., Neusch, C. In vivo imaging reveals rapid morphological reactions of astrocytes towards focal lesions in an ALS mouse model. Neuroscience Letters. 497 (2), 148-151 (2011).
  26. Bareyre, F. M., Garzorz, N., Lang, C., Misgeld, T., Buning, H., Kerschensteiner, M. In vivo imaging reveals a phase-specific role of STAT3 during central and peripheral nervous system axon regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (15), 6282-6287 (2011).
  27. Nikic, I., et al. A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Nature Medicine. 17 (4), 495-499 (2011).
  28. Misgeld, T., Nikic, I., Kerschensteiner, M. In vivo imaging of single axons in the mouse spinal cord. Nature Protocols. 2 (2), 263-268 (2007).
  29. Davalos, D., Akassoglou, K. In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy. J. Vis. Exp. 59, 2760(2012).
  30. Farrar, M. J., Bernstein, I. M., Schlafer, D. H., Cleland, T. A., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber. Nature. Methods. 9 (3), 297-302 (2012).
  31. Fenrich, K. K., Weber, P., Hocine, M., Zalc, M., Rougon, G., Debarbieux, F. Long-term in vivo imaging of normal and pathological mouse spinal cord with subcellular resolution using implanted glass windows. The Journal of Physiology. 590 (16), 3665-3675 (2012).
  32. Figley, S. A., et al. A Spinal Cord Window Chamber Model for In Vivo Longitudinal Multimodal Optical and Acoustic Imaging in a Murine Model. Plos One. 8 (3), 58081(2013).
  33. Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G. Implanting Glass Spinal Cord Windows in Adult Mice with Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. Journal of Visualized Experiments. 82, 50826(2013).
  34. Romanelli, E., Sorbara, C. D., cacute, I. N., Dagkalis, A., Misgeld, T., Kerschensteiner, M. Cellular, subcellular and functional in vivo labeling of the spinal cord using vital dyes. Nature Protocols. 8 (3), 481-490 (2013).

Ristampe e permessi

Tag

Impianto di camera spinaleProcedura chirurgicaMicroscopia multifotoneBloccaggio vertebraleLaminectomia dorsaleSigillatura con elastomero di siliconeImaging cronicoCure post operatorie
Una procedura di impianto del Camera spinale per longitudinale In Vivo Imaging del cavo del mouse spinale
Contattaci
Consiglia alla biblioteca

Privacy

Termini di utilizzo

Politiche

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati.