Immagine a base di Citometria a flusso Tecnica per valutare le variazioni Granulocyte Funzione In Vitro

Summary

Questo metodo dimostra una tecnica per valutare la funzione dei granulociti misurando simultaneamente la fagocitosi dei batteri e lo scoppio ossidativo. La citometria a flusso basata su immagini ha permesso l'identificazione di tre sottogruppi distinti di granulociti attivati che differivano tutti nella loro capacità funzionale relativa.

Abstract

I granulociti svolgono un ruolo chiave nella risposta immunitaria innata del corpo alle infezioni batteriche e virali. Sebbene esistano metodi per misurare la funzione dei granulociti, in generale questi sono limitati in termini di informazioni che possono fornire. Ad esempio, la maggior parte dei test esistenti fornisce semplicemente una percentuale del numero di granulociti attivati dopo una singola incubazione di durata fissa. A complicare le cose, la maggior parte dei test si concentra su un solo aspetto della funzione a causa delle limitazioni della tecnologia di rilevamento. Questo rapporto dimostra una tecnica per la misurazione simultanea della fagocitosi dei granulociti dei batteri e del burst ossidativo. Misurando entrambe queste funzioni contemporaneamente, sono stati identificati tre fenotipi unici di granulociti attivati: 1) Bassa attivazione (fagocitosi minima, nessun burst ossidativo), 2) Attivazione moderata (fagocitosi moderata, un po' di burst ossidativo, ma nessuna co-localizzazione dei due eventi funzionali) e 3) Alta attivazione (alta fagocitosi, alto burst ossidativo, co-localizzazione di fagocitosi e burst ossidativo). È stata identificata anche una quarta popolazione costituita da granulociti inattivati. Utilizzando incubazioni di 10, 20 e 40 minuti, è stato valutato l'effetto della durata dell'incubazione del saggio sulla ridistribuzione dei fenotipi dei granulociti attivati. Una quarta incubazione è stata completata su ghiaccio come controllo. Utilizzando incubazioni seriali a tempo, il test potrebbe essere in grado di rilevare come un trattamento influisce spazialmente sulla funzione dei granulociti. Tutti i campioni sono stati misurati utilizzando un citometro a flusso a immagini dotato di un'opzione di imaging quantitativo (QI), autocampionatore e laser multipli (488, 642 e 785 nm).

Introduction

Granulociti costituiscono una componente di sistema immunitario innato del corpo, che fornisce la prima linea di difesa contro gli antigeni invasori. I metodi precedenti per valutare la funzione dei granulociti concentrati sulla capacità di fagocitosi o burst ossidativo con metodi diversi, il che rende difficile accertare collettivamente come granulociti sono cambiati ^1-4. I progressi nel campo della citometria a flusso hanno portato alla produzione di strumenti da banco capaci di alta risoluzione, multicolore imaging cellule in maniera high throughput ^5. La capacità di coniugare l'imaging con il flusso tradizionale rappresenta citometria un avanzamento che fornisce la piattaforma tecnologica necessaria per innovare nel flusso esistenti citometria metodi ed estrarre nuove informazioni sul sistema immunitario.

Negli ultimi dieci anni, il nostro laboratorio, tra gli altri, è stato acutamente focalizzata sull'effetto di vari patte nutrizionale e trattamenti eserciziorns sulla funzione immunitaria innata ^6-9. Il metodo illustrato in questo manoscritto ha implicazioni pratiche nel campo della immunologia clinica. Il presente metodo sfrutta la potenza di image-based citometria a flusso per misurare simultaneamente la fagocitosi di particelle batteriche e burst ossidativo. Usando questo approccio, si è in grado di separare granulociti attivati ​​utilizzando variabili forniti dalla parte dell'immagine basata dell'analisi. Questi sottoinsiemi erano identificabili solo dopo aver valutato le immagini cellulari sui singoli granulociti. Ulteriore tempo di incubazione test influenzato la transizione tra i tre sottoinsiemi di attivazione ^10. Così, è plausibile che uso di più tempi di incubazione può autorizzare un metodo per testare l'cambiamento nella funzione granulociti seguendo un trattamento sperimentale specifica. Lo scopo di questo manoscritto era di dimostrare un metodo di valutazione della funzione dei granulociti utilizzando un'immagine basata citometria a flusso per misurare simultaneamente fagocitosi con oxidative scoppiare.

Protocol

NOTA: Tutte le procedure di raccolta del sangue descritte in questo metodo sono state condotte in accordo con la Dichiarazione di Helsinki e approvati dal Comitato Etico UNT (IRB) per i soggetti umani. Tutti i soggetti hanno dato il consenso scritto per la raccolta del sangue, che è stato utilizzato nel metodo attuale per garantire che essi erano apparentemente sani, di peso corporeo normale, e libero da malattia.

1. reagente Fonte & Preparazione

1. Utilizzare CD66b-APC (clone # G10F5; DF = 1: 50) e CD45-APCeFluor780 (clone # 2D1; DF = 1: 50) per questo test.
   NOTA: Prima dello studio, gli anticorpi CD45 e CD66b sono stati titolati per determinare la diluizione ottimale che granulociti chiaramente risolti (CD45 + / 66b +) da altri leucociti (CD45 + / 66b-) ^11. Dopo aggiunta dell'anticorpo diluita per colorazione diluizione finale nel tubo era 875.
2. Acquisto e disgelo stock S. aureus bioparticelle etichettato con pHrodo colorante rosso. Sospensione ad una concentrazione di 1 mg di bioparticelle per ml in PBS sterile. Aliquota bioparticelle diluite e conservare congelati a -20 ° C fino al momento del test.
3. Sciogliere dihydroethidium (DHE), che viene convertito in etidio bromuro di fluorescenza in presenza di radicali liberi di ossigeno (cioè, burst ossidativo), in DMSO ad una concentrazione finale di 10 g / ml.
4. Mescolare N-etilmaleimmide (usato per prevenire fagocitosi supplementare dopo la durata dell'incubazione dosaggio specificato) con PBS sterile in una diluizione 2 step di 200 mg / ml e 17,5 mg / ml. Nel saggio, utilizzare una concentrazione finale di 15 mM. Quando scongelamento N-etilmaleimmide, utilizzare un blocco di calore a 37 ° C, come N-etilmaleimmide non rimane in soluzione.
5. Dopo la fase di fissazione finale, utilizzare 7AAD a macchiare DNA nucleare. Prima Inoltre, diluire magazzino 7AAD 1:10 con PBS sterile.

2. Campione di sangue Collection

1. Fare soggetti ad arrivare al laboratorio a seguito di un O / N veloce (> 8 ore) e abstentisu dall'attività fisica (> 12 ore).
2. Dopo aver pulito la pelle con un panno imbevuto di alcol preparazione, inserire una sterile raccolta del sangue ago in un braccio vena periferica.
3. Prelevare il sangue in tubi sottovuoto che sono in commercio pieni di eparina sodica.
4. Dopo la raccolta, applicare un bendaggio adesivo al braccio del soggetto.
5. Capovolgere i tubi del sangue di mescolare per 10 volte e poi posto su una sedia a dondolo fino al momento dell'analisi.

Tecnica 3. Fagocitosi Assay

1. Bioparticelle Thaw S. aureus (RT), DHE (RT), e N-etilmaleimmide (37 ° C).
2. Aggiungere 20 L di bioparticelle S. aureus a 4 singoli 1,2 ml provette durante il lavoro nella cappa sterile.
3. Aggiungere 40 L di DHE ad ogni provetta contenente le bioparticelle.
4. Battere delicatamente i tubi sul banco di lavoro per raccogliere i reagenti nel fondo della provetta.
5. Aggiungere 100 L di sangue intero misto di ogni tubo che è stato riempito con bioparticelle e DHE.
6. Pulire il bordo interno dei tubi con un applicatore con punta di cotone per rimuovere il sangue contaminante.
7. Mescolare il sangue e reagenti con una pipetta elettronico impostato mescolare il sangue e reagenti per tre cicli dopo aggiunta di sangue.
8. Mettere le provette in un secchio di ghiaccio e coprire al riparo dalla luce.
9. Incubare le provette per 10, 20, e 40 min. Iniziare con il tubo 40 min a garantire tutte le provette terminano contemporaneamente.
10. Scongelare N-etilmaleimmide in 37 ° C bagno tallone.
11. Pipettare 15 L di N-etilmaleimmide (descritto in 1.4) in ogni provetta, incubare per 30 minuti.
12. Dispensare 10 L di CD66b-APC e 10 L di CD45-APCeFluor780 anticorpi diluiti (sopra descritti in 1.1), incubare per 60 min.
13. Dispensare 750 L di fix soluzione Lyse / RBC WBC in ciascuna provetta, incubare per 60 min.
14. Centrifuga (10 min a 400 xg) provette per raccogliere il pellet.
15. Vacuum aspirare la soluzione lyse WBC / RBC fix, lasciando un residuo flVolume UID (100 L) sopra il pellet di cellule.
16. Dispensare 10 L di soluzione diluita 7AAD (descritto in 1.5) e 50 L di PBS in ogni provetta test.
17. Aggiungere una goccia di perline di taratura (~ 25 L) a ciascuna provetta, luogo tappi sulle provette, tubi avvolgere in un foglio, e posto in frigorifero.
18. Caricare la provetta nel flusso basato su immagini citometro e raccogliere un minimo di 3.000 eventi granulociti utilizzando parametri predefiniti: Autocampionatore, blu (488 nm; 60 mW), rosso (640 nm, 100 nW), SSC (785 nm; 8,5 mW) laser (Figura 1).

Figura 1. Metodo & Template Acquisition. I campioni sono stati acquisiti su un flusso basato su immagini citofluorimetro (A). Durante l'acquisizione, dot plots di brillante campo Proporzioni vs. CD66b-APC sono stati generati per granulociti separati dal spillo perline calibrazione usinsoftware g INSPIRE v. 100.2.292.0 (B). Un minimo di 5.000 granulociti sono stati acquisiti per ogni campione utilizzando un campionatore automatico, blu (488 nm; 60 mW), rosso (640 nm, 100 nW), SSC (785 nm; 8,5 mW) laser. Si prega di notare che un certo numero di istogrammi sono presenti durante l'acquisizione di controllare le impostazioni di laser e altri aspetti dei dati raccogliere. Tutti questi istogrammi sono opzionali e necessaria solo se le procedure operative standard di laboratorio li richiede il controllo della qualità. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

4. Acquisizione e Sample Analysis

1. Utilizzare la procedura guidata automatica compensazione software del software IDEAS di applicare una matrice di compensazione per i file di immagine grezzi (RIF) e creare compensare i file immagine (CIF).
2. Caricare singoli file CIF in software IDEAS e generare i seguenti complotti per identificare i sottoinsiemi granulociti:
Stabilire porte iniziali per identificare le cellule che sono state considerate a fuoco utilizzando un istogramma per RMS di gradiente di campo luminosi (Figura 2a). Rendere questa determinazione per ciascun campione usando il controllo non stimolato come standard di riferimento.
3. Utilizzare trame secondarie alle cellule singoletto separati da detriti e doppiette utilizzando un diagramma a punti di brillanti proporzioni settore (rapporto tra altezza della cella vs larghezza) vs. zona di campo luminoso (Figura 2B). Rendere questa determinazione per ciascun campione usando il controllo non stimolato come standard di riferimento.
4. Una volta che una popolazione di cellule pulita era stato identificato, creare un diagramma a punti di CD45 vs. CD66b (Figura 2C) per identificare positivamente granulociti (CD45 + / 66b +). Creare una trama figlia (Figura 3) della brillante intensità dettaglio per S. aureus (asse x) vs. brillante intensità dettaglio per burst ossidativo (DHE, asse y) per identificare sottogruppi di granulociti attivati. Raccogliere brimmagini campo ight del Canale 1 e 9, bioparticelle a Channel 2, DHE a Channel 4, 7AAD in Canale 5, CD66b in Channel 11, e CD45 in Channel 12.

Figura 2. Analisi del modello. Questa figura la serie di trame che sono stati generati per identificare le cellule che erano a fuoco (A), celle singole (B), granulociti (C). Trame supplementari sono stati usati per identificare i tre sottoinsiemi di granulociti attivati ​​contro granulociti inattive. Tutte le analisi di file di immagini acquisite è stato completato utilizzando il software IDEAS v.6. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Results

Utilizzando basato su immagini citometria a flusso ha permesso di separare una popolazione omogenea di granulociti attivati ​​in tre diversi sottoinsiemi di attivazione (Figura 3). In questo metodo, il modo più efficace per risolvere i tre sottoinsiemi di attivazione è tracciando luminoso intensità dettaglio per fagocitosi (S. aureus) vs. burst ossidativo (DHE) (Figura 3; la figura 4). Inoltre, l'utilizzo della procedura guidata co-localizzazione in software IDEAS consentirà la quantificazione della presenza di fagocitosi simultanea e burst ossidativo, che è un segno distintivo di granulociti altamente attivati.

Figura 3. Identificazione attivati ​​granulociti sottoinsiemi. Dopo l'identificazione di granulociti mediante marcatori della superficie cellulare (CD45 + / 66b +), un complotto figlia è stata generata con brillante dettaglio intensità di fagocitosi vs. brillante intensità dettaglio per burst ossidativo. Usando questo approccio, la percentuale di inattivi (viola), basso-attivo (rosso, A), moderata-attiva (blu, B), e (C, giallo) granulociti alto-attiva è stata determinata. Questa tecnica gating è stato anche utilizzato per valutare l'effetto del tempo di incubazione del test sulla abbondanza relativa dei vari sottogruppi granulociti attivati. La più alta percentuale di granulociti "alto-attiva" è stata presente dopo l'40 min di incubazione. Tutte le analisi di file di immagini acquisite è stato completato utilizzando il software IDEAS v.6. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Oltre a dimostrare la presenza di tre sottoinsiemi distinti di granulociti attivati, è stato dimostrato che il tempo di incubazione del test influenzato l'abbondanza relativa di ogni granulociti attivato sottoinsieme. In particolare, il 40 min incubation portato alla maggiore percentuale di granulociti "alto-attiva". Includendo almeno tre durate incubazione dosaggio può essere possibile determinare come un dato trattamento clinico altera lo stato di attivazione temporale dei granulociti. Questo è il primo metodo pubblicato utilizzando un'immagine basata citometria a flusso per identificare diversi sottoinsiemi granulociti attivati ​​in funzione di misurazione simultanea dello fagocitosi e burst ossidativo.

Figura 4. Immagini rappresentative della Cellular marcatori. Una galleria di immagini di cellule classificate come high-attiva (A), moderata-attiva (B), e basso-attivo (C) viene presentato in questa figura. Bioparticelle S. aureus sono in Ch03 , burst ossidativo è in Ch04, 7AAD per il nucleo è in CH05, scatter lato è in CH06, CD66b è inCH11, e CD45 è in CH12. Inoltre, viene visualizzata un'immagine di unione co-localizzata di fagocitosi (Ch03) vs. burst ossidativo (Ch04). Aree di giallo l'immagine di unione in denotano che la fagocitosi e burst ossidativo stanno verificando nello stesso spazio anatomica nello stesso momento. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussion

L'attuale metodo rappresenta un perfezionamento dei metodi esistenti per la valutazione della funzione dei granulociti citometria a flusso ^1,3,4,12-14. I passaggi critici di questo test tendono ad essere correlato alla corretta miscelazione del campione di sangue con i bioparticelle e DHE. Miscelazione incompleta si tradurrà in risultati imprecisi. Mentre la completa miscelazione è critica, il metodo di miscelazione deve essere dolce in natura. Si suggerisce che la miscelazione essere realizzato utilizzando una pipetta elettronico con una funzione di miscelazione piuttosto che un vortex. Un altro punto critico nel saggio è garantire sempre non c'è sangue contaminare la metà superiore della provetta. Questo sangue residuo può essere rimosso con un cotton fioc sterili. La rimozione completa è importante perché in caso contrario si potrebbe contaminare la preparazione finale del test con i globuli rossi non-lisato.

Prima di utilizzare questo metodo di adeguati controlli di compensazione dovrebbe essere aggiunto al controllo per spectral sovrapposizione tra i reagenti utilizzati per identificare i diversi aspetti della funzione di granulociti. Per questo metodo, controlli di compensazione comportano raccogliere campioni di sangue che sono stati suggeriti 40 min di incubazione dosaggio e poi etichettatura con un singolo marcatore (cioè, E. coli, DHE, ecc). Dopo l'etichettatura, i singoli eventi positivi vengono raccolti e una matrice di compensazione viene generato tramite un wizard automatico nel software di analisi IDEE. E 'fondamentale che se si utilizza questo test, adeguati controlli di compensazione sono stati completati per garantire prestazioni adeguate del dosaggio.

L'analisi viene eseguita mediante la funzione Finder e co-localizzazione procedure guidate per identificare che brillante intensità dettaglio è il miglior variabile per separare le popolazioni ed anche identificare come esiste molta sovrapposizione tra burst ossidativo e segnali fagocitosi. In particolare, l'uso di immagini basato citometria disponibile la capacità di separare granulociti attivati ​​in tre sottoinsiemi. Tla sua ripartizione sottoinsieme è stato determinato utilizzando luminosa intensità dettaglio di fagocitosi vs. burst ossidativo. Oltre a esaminare queste funzioni cellulari singolari, cellule che mostravano entrambi gli eventi contemporaneamente nella stessa posizione anatomica (co-localizzazione) sono stati identificati. Granulociti che cadde nel sottoinsieme "high-attiva" erano l'unico che ha dimostrato fenotipo coerente co-localizzazione tra fagocitosi e burst ossidativo. Questa identificazione di sottoinsiemi granulociti attivati ​​è la più grande area in cui è necessaria la risoluzione dei problemi. E 'molto importante per un nuovo utente di prendere tempo per capire il workflow di processo del campione in idee e per capire i meccanismi di gating le popolazioni cellulari utilizzando il componente di imaging. Altre modifiche che un utente può cercare di rendere comprendono la selezione dei tempi alterni o ulteriori test di incubazione. Il metodo attuale suggerisce l'uso di una durata di 10-40 min; Tuttavia, a seconda del modello sperimentale in cui questo metodo èda utilizzare, può essere necessario selezionare durate dosaggio più. Tale modifica dovrebbe essere valutato su base individuale.

Inoltre è stato stabilito che la durata dell'incubazione dosaggio ha un effetto significativo sulla comparsa delle tre sottoinsiemi attivati. L'approccio descritto in questo rapporto rappresenta un ampliamento di quali informazioni possono essere ottenute in precedenza per quanto riguarda la funzione di granulociti ^3,4,13,15. Altri laboratori hanno dimostrato l'importanza di valutare i cambiamenti nella funzione dei granulociti nel quadro di una valutazione globale di immunità e malattia ^15-17. Nonostante il potenziale di questo test non è senza limitazioni. Una delle maggiori limitazioni è domanda Costi e tempi associati con elevata campione trasformazione produttività. Quando un disegno studio richiede un gran numero di campioni in un dato giorno, questi possono essere difficili da trattare. Il trattamento è semplificato dall'uso di pipette elettroniche e dispenser,ma queste tendono ad essere costosi e non sono necessariamente disponibili in ogni laboratorio.

La nostra area di ricerca si concentra su uno studio di come l'esercizio fisico e le abitudini alimentari influenzano la salute del sistema immunitario e la funzione ^{6,8-10,18-20.} Tali obiettivi hanno importanti implicazioni pratiche per una varietà di aree della salute umana. Oltre lo studio di esercizio e nutrizionali effetti il ​​metodo fagocitosi dimostrato in questo manoscritto potrebbe essere utile in altre zone del immunologia clinica dove il monitoraggio delle funzioni fagocitosi è fondamentale per i risultati del trattamento. Il presente saggio è il primo di molti che saggi immunologici con la possibilità di essere reinventate prendendo i vantaggi delle informazioni di imaging unica che può essere in grado da un flusso basato su immagini citometro.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vacutainers	BD Life Sciences		utilizzato per la raccolta del sangue
di lisi fissativa WBC / RBC	eBioscience	00-5333-57
CD66b-APC	clone eBioscience	G10F5
CD45-APCeFluor780	clone eBioscience	2D1
S. aureus bioparticelle	Life Technologies	A10010
diidroetidio	Sigma-Aldrich	D7008
N-etilmalemide	Sigma-Aldrich	4259
7AAD	EMD Millipore
Analizzatore ematologico	Mindray	BC-3200
pipetta a 96 canali	Integra Biosciences	ViaFlo
Bead Bath Incubator	LabArmour	BeadBath
Citometro a flusso per imaging	EMD Millipore	Amnis FlowSight
Software	INSPIRE EMD Millipore	Amnis INSPIRE
IDEAS Software	EMD Millipore	Amnis IDEAS
X-Pierce Sigillante per piastre per tralicci	Excel Scientific, Inc.	X-Pierce
Dell Precision Workstation	Dell Computer	vari	utilizzati per l'analisi IDEAS