FIM Imaging e FIMtrack: due nuovi strumenti che ad alta produttività e costo effettivo Locomotion Analysis

Sommario

FIM è un nuovo sistema, il costo di imaging efficace progettato per monitorare piccoli oggetti in movimento, quali C. elegans, planaria o Drosophila larve. Il programma FIMTrack di accompagnamento è stato progettato per fornire analisi dei dati veloce ed efficiente. Insieme, questi strumenti permettono analisi high-throughput di tratti comportamentali.

Abstract

L'analisi della funzione di rete neuronale richiede una misura affidabile di tratti comportamentali. Poiché il comportamento degli animali liberi di muoversi è variabile in una certa misura, molti animali devono essere analizzati per ottenere dati statisticamente significativi. Questo a sua volta richiede un computer assistita quantificazione automatizzata di modelli locomozione. Per ottenere immagini ad alto contrasto di oggetti in movimento quasi traslucidi e piccoli, è stata sviluppata una tecnica di imaging romanzo basato sulla riflessione interna totale chiamato FIM. In questa configurazione, gli animali sono illuminate solo con luce infrarossa nella posizione molto specifico di contatto con la superficie sottostante scansione. Questa metodologia si traduce in immagini molto alto contrasto. Successivamente, queste immagini ad alto contrasto vengono elaborate utilizzando algoritmi di monitoraggio contorno stabiliti. Sulla base di questo, abbiamo sviluppato il software FIMTrack, che serve ad estrarre un numero di caratteristiche necessarie per descrivere quantitativamente una grande varietà di locomozioneCaratteristiche. Durante lo sviluppo di questo pacchetto software, abbiamo concentrato i nostri sforzi su un'architettura open source che permette la facile aggiunta di ulteriori moduli. Il programma funziona piattaforma indipendente ed è accompagnata da un interfaccia grafica intuitiva che guida l'utente attraverso l'analisi dei dati. Tutti i valori di parametro locomozione sono espressi in forma di file CSV, per permettere ulteriori analisi dei dati. Inoltre, un visualizzatore Risultati integrato nel software di monitoraggio fornisce l'opportunità di rivedere in modo interattivo e regolare l'uscita, come potrebbe essere necessario durante l'integrazione di stimolo. Il potere di FIM e FIMTrack è dimostrato studiando la locomozione di Drosophila larve.

Introduzione

Maggior parte degli animali hanno la capacità di muoversi in modo altamente sofisticato e controllato. Per decifrare la base sottostante di controllo locomozione genetico è obbligatorio valutare quantitativamente modelli comportamentali diversi. A questo proposito, Drosophila può servire come un modello ideale. Monitoraggio di volare liberamente Drosophila è allettante ^1-4 ma strisciare di Drosophila larve avviene in due dimensioni a velocità relativamente bassa e può quindi essere controllato facilmente. Setup basato su telecamera in combinazione con un'illuminazione adeguata vengono utilizzati per acquisire immagini ^5. Entrambi incidente o la luce trasmessa è impiegato in esperimenti comportamentali ^6,7. Tuttavia, a causa del corpo semi-trasparente delle larve e possibili riflessi di luce della superficie di scansione registrazione fedele dei movimenti larvali può essere difficile. Per superare tali problemi, sono stati ideati alcuni metodi complessi. Recentemente, illuminazione campo scuro è stato introdotto per migliorare in primo piano / sfondo contRAST ^8. In alternativa alla registrazione basato su telecamera, imaging ottico lente-meno e image-sensore-less on-chip sono state introdotte tecniche di acquisizione ^9-11.

Sono stati introdotti di recente diversi programmi di monitoraggio, includendo in commercio software ¹² e personalizzate soluzioni. Esempi di programmi di monitoraggio ad elevato throughput sono il Worm Tracker Multi (MWT) ¹³ e Multianimal deambulazione e Track (Magat) ^8. Entrambi hanno in comune, che più gli animali possono essere monitorati in un unico un'arena aperta campo in modo che gli animali in collisione portano a molteplici nuove identità degli animali. Per superare questo limite, una configurazione multi-pozzo è stata introdotta la separazione 12 animali in singoli pozzetti ^14. Quantificazione precisa di locomozione di singoli individui può essere ottenuto utilizzando una fase mobile di inseguimento in combinazione con un microscopio ^15. Tuttavia, tutti questi approcci sono o costo inefficienti, mancanza sufficienti resoluzione o troppo tempo per alta fenotipizzazione produttività.

Per superare le limitazioni di cui sopra, abbiamo sviluppato FIM (Metodo Imaging basato FTIR) basato su Frustrated Total Internal Reflection (FTIR) ¹⁶ (Figura 1). Questo nuovo approccio di imaging offre un elevato contrasto senza precedenti e permette anche la registrazione multi-colore di strisciare animali ^16. Il principio alla base di questo metodo pratico ed efficace è facile. Un piatto di vetro acrilico è inondato di luce (ad esempio, 875 nm infrarosso). A causa dei diversi indici di rifrazione di vetro acrilico e aria, la luce viene riflessa totalmente al confine vetro / aria. Nessun riscaldamento del vetro acrilico è notato ^16. Solo se gli oggetti con un indice di rifrazione più alto toccare il tavolo luminoso, può illuminare entrare in questi oggetti. Se gli animali toccano la superficie, luce viene riflessa e può essere catturato dal basso (Figura 1). Di conseguenza, solo il contattozona degli animali appare come un punto luminoso, che permette l'imaging dettagliato con uno sfondo nero globale. Così, FIM imaging consente di registrare filmati perfetti per gli algoritmi di visione artificiale. L'utilizzo semplice e robusto di FIM ora porta dettagliata analisi high throughput del comportamento animale complesso in mano e può essere utilizzato per studiare le informazioni di trasformazione: ad esempio, l'olfatto ^{8, 16;} visione ¹⁷ o thermosensation ^18.

Figura 1. configurazione FIM con integrazione di calore-stimolo e principi fisici sottostanti. (A) L'impostazione FIM. Intensità di illuminazione può essere regolata dal pannello frontale. (B) Per fornire uno stimolo termico, una piastra di alluminio verniciato nero, perfusi con acqua calda e fredda su entrambi i lati, è disposto 2 mm dalla superficie di agar chesé è spessore 2 mm. Il gradiente è stabilito sulla piastra radiatore di calore e l'agar dalle differenze di temperatura (C) Il principio fisico della riflessione interna totale. Una lastra di vetro acrilico viene illuminato da luce infrarossa. θ _1, θ _2, θ e ₃ indicano gli angoli di riflessione della luce. n _A, n _1, n ₂ e n ₃ indicano gli indici di rifrazione dell'aria, vetro acrilico, agar e la larva rispettivamente e compiere la disuguaglianza n _A 1 2 3. A causa rifrazione, l'angolo di riflessione cambia durante la transizione. Se l'angolo è sotto l'angolo critico, la luce non si riflette più, può passare attraverso gli strati e può essere catturato da sotto. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

La spectrum di processi che possono essere analizzati da FIM è ampio. Senza ulteriori aggiustamenti, immagini FIM può essere utilizzato per monitorare tutte le fasi larvali di Drosophila (Figura 5B) o può essere usato per seguire le impronte di piede-adulto Drosophila ^19. Analogamente, le traiettorie di C. elegans o il movimento di vermi piatti planaria può essere facilmente registrati (Figura 5C). Anche l'analisi della crescita ifa o radice dei capelli fungina appare fattibile ^19. Nella nostra attuale configurazione FIM, 4 x 16 diodi emettitori di luce infrarossa (IR LED) sono integrati in un cm ² lastra di vetro acrilico 32 x 32, chiamata tabella di rilevamento (Figura 1). L'intensità del IR-LED viene regolata in funzione del peso degli oggetti sulla tabella di rilevamento, che può essere fatto facilmente da un microcontrollore collegato al circuito tramite modulazione di larghezza di impulso (PWM). FIM produce immagini molto alto contrasto su una vasta gamma di intensità di illuminazione. Importante, gennomiche ottimi risultati a già basso irridation infrarossi generale.

Una fotocamera con un filtro a infrarossi è posto sotto la tabella di monitoraggio, che consente l'integrazione di altri stimoli nel setup. Stimoli di calore possono essere facilmente applicati da una piastra radiatore di calore e stimoli luminosi sono applicati da un proiettore LCD. Anche odoranti possono essere contenuti in gradienti da coperchi semplici ^8. Per gli esperimenti gradiente di calore, la piastra radiatore di calore è perfuso con acqua calda e fredda su entrambi i lati rispettivamente e disposto 2 mm dal larve (Figura 1B).

La generazione di alto contrasto, filmati di alta qualità apre la possibilità per sofisticate analisi delle immagini computer basato, quindi abbiamo implementato il software FIMTrack per estrarre un grande insieme di caratteristiche da immagini (Figura 2). Primi sei caratteristiche principali sono definite dal contorno dell'animale (Figura 3A). Queste caratteristiche forniscono la linea di baseper ulteriori calcoli di sei caratteristiche secondarie che descrivono la forma animali e la sua posizione in determinati stimoli in un dato punto di tempo (Figura 3B). Attualmente, nove funzioni terziarie sono calcolati che sono integrando aspetti temporali e quindi caratterizzano la locomozione dell'animale insieme con le caratteristiche primarie e secondarie (Figura 3C).

Figura 2. Panoramica FIMTrack, il flusso di lavoro e la rappresentazione algoritmica larvale. (A) Come utilizzare FIMTrack. Le immagini vengono caricate. Grigio soglia di valore e limiti numerici larvali definiscono solo le larve devono essere impostati. L'area larvale deve essere in [min-size, max-size]. Monitoraggio viene avviato dal pulsante evidenziato. Workflow (B) di inseguimento. Dopo il pulsante di avvio si fa clic, l'immagine di sfondo è calculated (intensità minima nel tempo). Finché ci sono fotogrammi di sinistra, le larve sono segmentati in base alla soglia grigio e il MIN e soglia di max-size. Per tutte le segmentazioni le rappresentazioni larvali sono calcolati (confrontare (C)). Ogni nuovo modello è associato ad una determinata traiettoria se una traccia valido è disponibile. Se si raggiunge l'ultimo fotogramma, finalizzando la post-elaborazione viene eseguita seguita dalla generazione di uscita. (C) rappresentazione larvale. L'animale è costituito da una testa e un punto di coda (h e t). Tra questi punti un arbitrario numero dispari di punti della colonna vertebrale s _i può essere impostato con un raggio r _i. Inoltre, il centro di massa m ed il corpo principale piegatura γ angolari sono calcolati. Diversi parametri di movimento correlati sono delineati da linee viola. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Caratteristiche calcolati da FIMTrack. (A) le caratteristiche primarie basata sul contorno degli animali. (B) le caratteristiche secondarie, sulla base di caratteristiche primarie. (C) funzioni terziarie, sulla base di caratteristiche primarie in fotogrammi consecutivi e ulteriori ingressi Cliccate qui per vedere una versione più grande di questo figura.

Protocollo

NOTA: Qui, l'uso di FIM è presentato per pratico analisi ad alta velocità di locomozione larvale per lo screening in condizioni di assenza di movimento e sotto l'influenza di uno stimolo termico. Altre applicazioni quali l'analisi degli stimoli olfattivi locomozione dipendente o alta risoluzione per immagini di comportamenti di laminazione o di altri potrebbe aver bisogno di piccole modifiche al protocollo, che sono disponibili su richiesta.

1. Set-up of Experiments

1. Utilizzare circa 100 larve per genotipo in totale (tempo di 1 ora richiesto) per ottenere valori statisticamente significativi. NOTA: Nel caso di più genotipi devono essere confrontate e registrato in giorni diversi, registrare lo stesso numero di larve per genotipo al giorno.
2. Per la maggior parte delle applicazioni, record a 10 Hz per l'analisi dei parametri. Per le applicazioni di imaging ad alta risoluzione, variare la velocità delle immagini, se necessario.
3. Per il monitoraggio di terzo stadio larve, condurre esperimenti circa 120 ore dopo la deposizione delle uova. Fai sure che le culture resa abbastanza larve nel periodo sperimentale (vedi 4.3).
4. Per le applicazioni non-stimolo, preparare una superficie di scansione contenente agar traslucido (vedere paragrafo 2). Per contenere le larve nella gamma di stimolo per l'applicazione del gradiente termico, circondare il campo visivo con una avversiva barriera di agar sale (vedi sezione 3).
   NOTA: Altre applicazioni possono richiedere diverse superfici.
5. Assicurarsi di utilizzare una camera con condizioni costanti ambientali (temperatura, luce, flusso d'aria, umidità dell'aria, ecc).

2. Crawling Preparazione della superficie (Translucent Agar)

NOTA: Nella configurazione FIM si aggiunge una superficie agar per fornire una superficie crawling umida. Inoltre, migliora anche proprietà di illuminazione.

1. Far bollire 0,8% commestibile agar in acqua ultrapura deionizzata. Per applicazioni di screening preparare 400 ml.
2. Versare agar a 50 ° C (a mano caldo) su un separato 33 centimetri x 33 cm acPiastra rylic-vetro. La tensione superficiale della agar e quindi la temperatura definiranno lo spessore della lastra agar. A 50 ° C, spessore 2 mm lastre di agar sono ottenuti. Non agitate dopo l'ebollizione e versare costantemente per evitare le bolle. Preparare lastre freschi agar per ogni periodo di imaging di circa 4 ore.
3. Riempire piatti standard 6 centimetri di Petri con il restante soluzione agar 0,8% per ordinare, pulito e abituare le larve prima dell'esperimento (1 piatto per genotipo).
4. Nel caso in cui è necessaria una barriera agar avversiva per l'applicazione, passare alla sezione 3.
5. Tagliare circa 2 cm del perimetro della lastra agar per ottenere una superficie piana quadrata per la registrazione. Rimuovere l'agar in eccesso.
   NOTA: La dimensione dipende dall'applicazione.
6. Trasferire la lastra agar al setup FIM subito dopo il raffreddamento spingendo delicatamente l'agar deltaplano sopra il bordo della lastra di vetro acrilico.

3. Opzionale: Aggiunta di un avversivo Agar Barriera al Crawling Surface (Salt Agar)

1. Far bollire 2,5% commestibile agar con 3 M NaCl in acqua ultrapura deionizzata. Per lo screening in un gradiente termico di preparare 200 ml.
   NOTA: Il volume dipende dall'applicazione.
2. Tagliare una tacca di 2 cm in precedenza versato strisciando superficie circostante il campo di vista (22 x 22 cm).
   NOTA: Diverse forme barriera e campi di visualizzazione possono essere necessarie a seconda dell'applicazione.
3. Riempire la tacca con agar sale 0.1-0.3 cm rispetto alla superficie di rilevamento.

4. Fly Handling

1. Posteriore vola in 25 ° C incubatore con la luce 12 ore / buio ciclo adeguato per il tempo dell'esperimento sul cibo standard di volo al 65% di umidità dell'aria.
2. Per croci, anestetizzare 30 vergini mosche femmine e 8 maschi con CO ₂ ed attraversarle in 130 flaconi di coltura ml con 35 ml di cibo.
   NOTA: One 130 ml cultura flacone con 35 ml cibo produrrà circa 20-30 lmangiato terzo instar larve nel giro di imaging di 4 ore. Imaging e monitoraggio opere per tutte le fasi stadio larvale.
3. Eliminare un po 'd'acqua in flaconi di coltura di guidare in ritardo al terzo stadio larvale movimento e raccogliere il maggior larve dalle pareti della fiala con un piccolo pennello.
4. 2-5 min prima della registrazione, trasferimento larve per un video a una piastra di Petri contenente 0,8% commestibile agar in acqua ultra pura deionizzata per abituare e pulirli.

5. Regolazione del Setup FIM Imaging per Recordings (non Stimolo condizioni)

1. Regolare la macchina fotografica messa a fuoco dell'obiettivo e il diaframma, se necessario. Impostare il tempo di esposizione per la rispettiva telecamera.
   NOTA: Queste impostazioni non hanno bisogno di essere cambiato nel corso di un esperimento.
2. Regolare intensità di illuminazione per ottenere un buon contrasto creando l'immagine larva.
3. Mantenere le condizioni ambientali in costante stanza durante le registrazioni. Oscurare la stanza per non disturbare le larve con luce direzionale.

6. Opzionale: Regolazione della Setup FIM Imaging per Recordings (Graduale Temperatura stimolo Condizioni)

NOTA: Il dispositivo di gradiente termico è un cm ³ piastra di alluminio 42 x 42 x 0,2 con una vernice nera opaca e materiale isolante sul sito principale. La piastra è perfuso con acqua da due diversi circuiti collegati ai bollitori / refrigeratori e pompe ad entrambe le estremità (vedere Figura 1B). Le temperature possono essere regolate da -5 a +50 ° C.

1. Accendere il gradiente termico dispositivo 1 ora prima degli esperimenti e posizionarlo sopra l'installazione per consentire l'elaborazione del profilo di temperatura desiderata e componenti per equilibrare.
2. Trasferire la scansione agar superficie con una barriera di sale al setup.
3. Posizionare la piastra del radiatore sulla agar e regolare la distanza tra la piastra e la superficie di scansione 2 mm (~ 1 mm sopra larve).
4. Stabilire un gradiente lineare dialmeno 0,8 ° C / cm da 34 ° C (circa. 2 cm dalla barriera nel campo visivo) a 18 ° C (circa. 2 cm dalla barriera al lato opposto del campo visivo) regolando la temperatura dei circuiti idrici a 1 ° C e 45 ° C.
   NOTA: Different proprietà gradiente della piastra metallica richiedono diverse temperature che devono essere accertata empiricamente. Queste impostazioni non devono essere cambiate durante gli esperimenti.
5. Regolare le impostazioni come descritto nella sezione 5.
6. Lasciare la superficie strisciando per equilibrare nel gradiente prima degli esperimenti per 20 min. Testare il gradiente di temperatura con un pirometro.
7. Procedere con la sezione 8.

7. Imaging FIM (non Stimulus Condizioni)

1. Utilizzare un piccolo pennello bagnato per raccogliere delicatamente 15 larve dalle piastre di Petri assuefazione e trasferirli al centro della superficie di tracking. Non trasferire cibo rimane o troppoacqua (vedi 7.8).
2. Record 1-50 larve su un 22 centimetri x 22 centimetri zona di monitoraggio. Utilizzare 15 animali per video per la maggior parte delle applicazioni di screening (per ragioni statistiche utilizzano almeno 100 individui per genotipo).
3. Separare delicatamente larve e attendere per circa 10-20 secondi fino a quando tutte le larve ha iniziato a muoversi subito prima della registrazione.
4. Registrare locomozione larvale per 2 minuti a 10 fotogrammi al secondo per le condizioni non di stimolo. Usare le immagini tif non compresse come formato di output.
5. Durante la registrazione, raccogliere le larve per il prossimo video da flaconi per abituare loro Critical:. Non disturbare larve registrata con la luce.
6. Dopo la registrazione, rimuovere le larve con un grande pennello e gettarli in conformità alle norme di sicurezza e la legislazione locale.
7. Dopo aver tolto le larve, utilizzare il pennello per pulire e idratare la superficie strisciante con ultra acqua deionizzata pura.
8. Critico: Mantenere la superficie umida in ogni momento, ma evitare un'eccessiva moisture, che può essere visto come aloni o gocce larve nelle registrazioni circostanti e disturbare il monitoraggio.

8. Opzionale: Imaging FIM (Graduale Temperatura stimolo Condizioni)

1. Dopo aver stabilito il gradiente di temperatura (vedi sezione 6), preparare il software di registrazione per la registrazione entro 20 sec istante dopo aver piazzato le larve sulla superficie strisciante (vedi 8.2), ad esempio, impostare il numero di fotogrammi al video e definire il percorso di salvataggio.
2. Sollevare la piastra del radiatore leggermente e posizionare le larve a 33 ° C 2 cm dalla barriera di sale. Fare riferimento a 6. e 7. per ulteriori istruzioni generali. Abbassare nuovamente la piastra radiatore e avviare la registrazione per 3-4 minuti subito dopo larve iniziato a muoversi subito.
3. Dopo la registrazione, rimuovere le larve direttamente, pulito e idratare la superficie. Non toccare l'agar sale per evitare la diffusione di NaCl.
4. Critico: Mantenere la superficie umida in ogni momento, ma evitareeccessiva umidità, che può essere visto come aloni o gocce larve nelle registrazioni circostanti e disturbare il monitoraggio.
5. Lasciare la superficie agar per equilibrare di nuovo dopo idratante per 1-2 minuti, mentre il salvataggio delle immagini e la raccolta di nuovi animali prima di preparare per il prossimo video. Controllare il gradiente di temperatura con un pirometro ogni 5 video e regolare dispositivo temperatura se necessario (temperatura dell'acqua, l'altezza e l'orientamento xy rispetto alla superficie di inseguimento).

9. Monitoraggio di larvale Locomotion

NOTA: Per ulteriori informazioni si veda il manuale allegato per FIMTrack (supplemento). Per un diagramma di flusso del programma vedi figura 2.

1. Regolare i parametri di monitoraggio per i rispettivi esperimenti utilizzando l'opzione di anteprima.
   1. Regolare pixel per cm secondo fotocamera e il campo visivo.
   2. Regolare fotogrammi al secondo in base alle impostazioni della fotocamera.
   3. Regolare soglie di luminosità così tha tutti gli animali vengono rilevati correttamente (le risposte sono date nell'anteprima).
   4. Regolare larvali soglie dimensionali dell'area. Nota l'opzione di feedback nell'anteprima: singoli animali sono evidenziate in giallo, scontrandosi larve sono evidenziati in rosso e l'area di ogni animale è dato in blu.
2. Inizia il monitoraggio utilizzando il pulsante in basso a destra.
   NOTA: Dopo il successo di monitoraggio, una immagine con tracce larvali e un file CSV contenente le caratteristiche di locomozione e postura calcolato viene memorizzato nella directory delle immagini.
3. Utilizzare il modulo viewer Risultati FIM (Modifica> Risultati Viewer ...) a rivedere e regolare manualmente i risultati di monitoraggio. Se necessario, definire regioni di stimolo per valutare i dati relativi al regime di stimolo ad esempio, strisciando orientamento rispetto al gradiente termico o la distanza di una sorgente odorizzante. Per una descrizione più dettagliata si prega di utilizzare il manuale (supplemento).

10. La valutazione dei dati

1. Importare il file CSV in Excel, Matlab o qualsiasi altro programma per ulteriori analisi statistiche.

Risultati

Per l'imaging più videocamere differenti con differenti caratteristiche di risoluzione sono stati testati (Figura 4). Tutte le telecamere dove dotati di un filtro IR adeguato. Secondo la bassa risoluzione della telecamera più basso costo in questa prova, il campo visivo è limitato a 10 cm x 10 cm. I migliori risultati sono stati ottenuti utilizzando una 4 megapixel (MP) della fotocamera. Questo porta ad una risoluzione di 100 pixel per terzo stadio larvale lunghezza e ha permesso di riconoscere facilmente strutture interne. Inoltre, la peristalsi dell'animale può essere facilmente estratto (Figura 4A). Tuttavia, si può ancora ottenere i film ad alto contrasto con fotocamere meno costosi, che possono anche essere analizzati da FIMTrack. Utilizzo di una fotocamera 1,4 MP con una profondità di 8 bit e una risoluzione di 1.392 x 1.040 pixel è circa metà del prezzo e permette una risoluzione di 45 pixel per terzo stadio larvale lunghezza nel campo visivo. La testa ma non altre strutture interne possono essere riconosciute (Figura 4B). Tracking e rilevamento della peristalsi è possibile, ma la precisione è ridotta (Figura 4B).

Con una più economica 0.8 MP con una risoluzione spaziale paragonabile alla fotocamera 1.4 MP, la testa larvale non può essere riconosciuto più fedelmente (Figura 4C). Il monitoraggio e l'analisi peristalsi è possibile, ma di cui più jitter sulla base della maggiore rumore. Sorprendentemente, anche a bassa risoluzione webcam USB offre film di qualità sufficienti per calcolare traiettorie larvali (0.3 MP fotocamera, sotto i 20 €, Figura 4D). La peristalsi può essere calcolata l'area misurazioni sono molto rumoroso.

Nella nostra messa a punto abbiamo abitualmente utilizza la fotocamera 4 MP. Per lo screening, questa fotocamera permette di monitorare un 22 centimetri x 22 centimetri arena, che offre ovviamente la possibilità di analizzare un gran numero di animali contemporaneamente, così che l'analisi ad alta velocità è possibile. Con questa impostazione, la lunghezza larvale is rappresentato da 40 pixel che consente ancora la registrazione e l'analisi della peristalsi. Un'immagine esemplare 15 traiettorie larvali in un gradiente termico è data in Figura 5A. Inoltre, l'uso di una lente macro immagine permette di larve con risoluzione molto elevata dove molti organi interni diventano visibili e riconoscimento della testa è ulteriormente migliorata (Figura 5B). Inoltre questi possono essere utilizzati per ulteriori analisi più dettagliate dei comportamenti di una vasta gamma ^20. La stessa configurazione può essere facilmente utilizzato per la scansione di immagini C. vermi elegans (Figura 5C).

Figura 4. di imaging e di monitoraggio dei risultati FIM per diverse fotocamere. (A) a sinistra: l'imaging FIM tre larve che striscia su un palco di monitoraggio 10 centimetri x 10 centimetri acquisite utilizzando una fotocamera a 4 MP con 10 fps. Mid:Clipping e centro di traiettoria massa di una singola larva. Viene indicata la zona dell'animale. A destra: Area della larva tracciato oltre 100 fotogrammi. La freccia rossa indica il punto ora dell'immagine ritagliata. (B) Equivalente a (A), ma catturato con una telecamera 1,4 MP. (C) Equivalente a (A), ma catturato con una telecamera 0,8 MP. (D) Equivalente a ( A), ma acquisite utilizzando una fotocamera 0.3 MP. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5. stimolo di calore, e ad alta risoluzione applicazioni. (A) applicazione stimolo termico (confrontare la Figura 1). Traiettorie calcolati via FIMTrack. Immagine applicazione ad alta risoluzione di un terzo, secondo e primo larva instar utilizzando un obiettivo macro (B). Il terzo stadio larvale lunghezza è rappresentata da 400 pixel in un campo di vista di 2,5 x 2,5 cm. (C) A C. elegans verme catturato utilizzando immagini FIM. Barre di scala sono indicati. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussione

In neuroscienze comportamentali è obbligatorio decifrare quantitativamente tratti comportamentali complessi. Sono necessari dunque, un gran numero di persone devono essere osservate ad alta risoluzione e automatizzate le procedure per l'analisi statistica. Qui, l'imaging FIM è descritto, un romanzo, l'installazione di immagini semplice e robusto, che fornisce i mezzi per monitorare locomozione di una vasta gamma di animali. L'efficacia del setup di imaging FIM è stata testata utilizzando Drosophila larve, vermi piatti planaria e C. vermi elegans. La tecnologia FIM fornisce intrinsecamente alto contrasto per rilevare anche strutture interne degli animali, come il cervello, trachea, l'intestino o proventricolo. È importante sottolineare che queste strutture interne robusto sono identificati in modo che possano servire per identificare automaticamente l'orientamento dell'animale ^19.

La qualità dei film può essere influenzata dalla quantità eccessiva di acqua sulla superficie di scansione. Pertanto, è fondamentalecontrollare l'umidità del agar. Troppo vecchio acqua agar o troppo sulla superficie può causare artefatti. Allo stesso modo, assicurarsi che non bolle d'aria sono compresi nella superficie scansione. In generale, una superficie agar ben preparato consente la registrazione di filmati per 4 ore.

A causa dei principi fisici alla base di imaging FIM genera quasi rumore registrazioni di immagini gratuito, con un conseguente qualità di immagine eccellente. Ciò consente la successiva analisi di immagini computer-based e consente un elevato throughput. Tuttavia, la metodologia è limitato all'analisi di animali che contattano direttamente la superficie agar. Il software di monitoraggio è sfidato da animali che forma una forma di ciambella. Anche se un indicatore binario riconosce la forma di ciambella, una spina errato potrebbe essere calcolato.

Grazie alla costruzione modulare del tavolo di monitoraggio dual e triple immagini a colori è a portata di mano. Inoltre, altri stimoli (luce, odori, stimoli elettrici o meccanici) possono facilmente essere delivered dall'alto. Il programma FIMTrack progettato per abbinare il potere delle immagini FIM può essere facilmente adottato per monitorare Drosophila larve, C. elegans o planarie. Così e grazie alla sua costruzione semplice ed economico (vedi http://FIM.uni-muenster.de), l'imaging FIM è fattibile per una vasta gamma di applicazioni biomediche e in particolare consente di urgenza studi elevati di throughput.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Configurazione FIM	Personalizzato		dettagli per la costruzione o l'acquisto di allestimenti è disponibile su richiesta
Lastra in vetro acrilico	Custom		Aggiuntivo per colata di agar
Piastra radiatore di calore	Custom		Piastra in alluminio (vernice in nero opaco) confondibile su siti opposti con montaggio regolabile
Pompe di riscaldamento/raffreddamento dell'acqua e tubi flessibili	Custom		basato su GE healthcare MultiTempIII (n.: 18-1102-78) e Dr Bruno Lange GmBH (Typ: LTG013)
Fotocamera standard (4 MP)	Basler	acA2040-25gm	Fotocamera utilizzata di default per la configurazione FIM
Fotocamera di prova (1,4 MP)	QImaging	1394 firewire (01- QIC-F-M-12 MONO)	Fotocamera utilizzata per il confronto
Fotocamera di prova (0,8 MP)	Punto Grey	Dragonfly 2 (DR2-13S2M/C-CS)Fotocamera	utilizzata per il confronto
Fotocamera di prova (0,3 MP)	Fotocamera Sony	PS Eye USB2.0	Fotocamera utilizzata per il confronto
Computer	Custom		dotato di almeno processore Intel i5 o superiore, 16 GB di RAM e spazio di archiviazione HDD sufficiente [>1 TB]
Standard Fly food	Custom
Standard Fly fiale 135 ml	Sarstedt AG& Co, Nü mbrecht, Germania	78.895
piastre di Petri 9 cm	Sarstedt AG& Co, Nü mbrecht, Germania	821.473
Acqua deionizzata ultrapura	Merck Millipore, Darmstadt, Germania	Synergy
NaCl	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germania	3957.2
Agar per uso alimentare	AppliChem GmbH, Darmstadt, Germania	A0917,5000
Pennello (piccolo e grande)	Milan	Aquarell 310 Pirometro misura 0 e 2
	Trotec	BP20