Presentiamo qui un protocollo ottimizzato per genotipizzare, colorare e preparare topi fetali per l'imaging di proiezioni di assoni nocicettori periferici nell'intero animale, come metodo efficace per valutare i fenotipi di crescita degli assoni sensoriali nello sviluppo di topi geneticamente modificati.
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Articolo metodologico
Whole-mount Imaging di embrione di topo Sensory Axon Proiezioni
In questo articolo
Sommario
Abstract
La visualizzazione del full-length proiezioni neuronali in embrioni è essenziale per acquisire una comprensione di come mammiferi reti neuronali si sviluppano. Qui si descrive un metodo per etichettare in situ un sottoinsieme di gangli delle radici dorsali (DRG) proiezioni assoni di valutare le loro caratteristiche fenotipiche con diverse linee di topi geneticamente manipolati. I neuroni TrkA-positivi sono neuroni nocicettori, dedicati alla trasmissione di segnali di dolore. Utilizziamo una linea di topi TrkA taulacZ etichettare le traiettorie di tutti assoni periferici TrkA-positivo nel topo embrione intatto. Abbiamo inoltre alleviamo la linea TrkA taulacZ su uno sfondo nullo Bax, che abolisce in sostanza l'apoptosi neuronale, al fine di valutare le domande di crescita relative indipendentemente possibili effetti delle manipolazioni genetiche sulla sopravvivenza neuronale. Successivamente, i topi geneticamente modificati di interesse sono allevati con il TrkA TaulLinea nullo ACZ / Bax e sono quindi pronti per lo studio utilizzando le tecniche qui descritte. Questa presentazione include informazioni dettagliate sui piani di allevamento del mouse, la genotipizzazione al momento della dissezione, preparazione del tessuto, colorazione e di compensazione per consentire la visualizzazione del full-length traiettorie assonali in tutto il montaggio di preparazione.
Introduzione
Creazione di precise reti neuronali è un complesso processo evolutivo essenziale per la funzionalità del sistema nervoso. Disturbi in questo processo porta a una disfunzione neuronale che è stato coinvolto in malattie neurologiche umane 1-3. Per studiare i meccanismi molecolari alla base della crescita degli assoni e di destinazione innervazione nei mammiferi, abbiamo sviluppato un protocollo per visualizzare le traiettorie assonali di TrkA-esprimere i neuroni sensoriali utilizzando una combinazione di due linee di topi geneticamente modificati.
TrkA è un recettore per il fattore di crescita nervoso NGF ed è un marcatore funzio....
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Protocollo
NOTA: Tutte le procedure sono conformi alla Guida NIH per l'uso e la cura di animali da laboratorio. Il protocollo animale è stato approvato dal IACUC al Weill Cornell Medical College.
1. Preparazione del tessuto
- Euthanize femmine scaduta a gravidanza per dislocazione cervicale 15. Sezionare embrionali E16 - E18 embrioni da femmine scaduta a gravidanza e posto embrioni singolarmente nei pozzetti di un piatto 6-bene, pieni di fosfato salino freddo tamponata (PBS).
- Sciacquare embrioni in PBS freddo.
- Rimuovere una piccola porzione della membrana amniotica dell'embrione e posto in una soluzion....
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Risultati
I genotipi di TrkA WT / taulacZ: Bax - / - e TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / - gli embrioni possono essere inequivocabilmente determinati dal genotipo normale PCR (Figura 1). Display colorazione X-gal dettagliate pergole assonale periferici per via sottocutanea in embrioni convenzionalmente macchiati (figure 2, 3 bis), e in tutto l'embrione dopo schiarimento del tessuto (figure 3b, 4).
Abbiamo alle.......
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Discussione
La procedura di colorazione X-gal sopra descritto di topi embrionali TrkA taulacZ permette la visualizzazione rapida e dettagliata delle proiezioni assoni lunga distanza nell'embrione fisso intatto. A causa del fondo nulla Bax questi topi permettono di sondare di meccanismi di segnalazione che possono contribuire sia alla crescita degli assoni e la sopravvivenza neuronale. Accoppiamento con transgenici o knockout mice di interesse consente per la valutazione complessiva di fenotipi asson.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano che non vi sono interessi concorrenti.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Louis Reichardt per i topi TrkA taulacZ e Dr. Annette Markus per la discussione penetranti e suggerimenti. Questo lavoro è stato sostenuto da fondi di avvio dalla Fondazione Burke e assegno di ricerca della Fondazione Whitehall 2010-08-61, un assegno di ricerca da Wings for Life Foundation (WFL-US-028/14), concedere ZB1-1102-1 dal Christopher e Dana Reeve Foundation, e le sovvenzioni 1R01EY022409 e 3R01EY022409-01S1 dal National Eye Institute, a JZ. KJO è un collega Goldsmith.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| PFA | Sigma-Aldrich | P6418 | |
| PBS | Life Tech | 10010-023 | |
| Soluzione di risciacquo per tessuti A | Millipore | BG-6-B | |
| Soluzione di risciacquo per tessuti B | Millipore | BG-7-B | |
| Soluzione di base per macchie di tessuti | Millipore | BG-8-C | |
| X-gal | Sigma-Aldrich | B4252 | |
| Fiala di scintilazione in vetro | Kimble Chase | 74500-20 | |
| Incubatrice | Labline | Modello 120 | |
| Perni per insetti | FST | 26000-30 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Piatto a 6 pozzetti | USA Scientific | CC7672-7506 | |
| Primer | IDT | primer DNA | |
| Takara dNTP miscela | Takara | 4030 | |
| Takara LA tampone | Takara | RR002A | |
| Takara LA Taq Takara | RR002A | ||
| PCR macchina | Bio-Rad | DNA Engine Dyad | |
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich | B-1042 | |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | B-6630 | |
| Microscopio da dissezione | Leica | M205A | |
| Fotocamera | Leica | DFC310FX | |
| Luce anulare | Leica | MEB110 | |
| Photoshop Adobe | Photoshop 4.0 |
Riferimenti
- Verze, L., et al. Cutaneous innervation in hereditary sensory and autonomic neuropathy type IV. Neurology. 55, 126-128 (2000).
- Sethna, N. F., Meier, P. M., Zurakowski, D., Berde, C. B. Cutaneous sensory abnormalities in children and adolescents wi....
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Ristampe e permessi
