Arto Remote ischemica precondizionamento: una tecnica neuroprotettivo nei roditori

Summary

Precondizionamento ischemico remoto (RIP) è un metodo di tessuti condizionamento contro lo stress dannoso. Abbiamo stabilito un metodo di ischemia telecomando verso l'arto posteriore, gonfiando un bracciale sfigmomanometro per 5-10 min. Le capacità neuroprotettive del RIP sono stati dimostrati in un modello di degenerazione retinica nei roditori.

Abstract

Ischemia subletali protegge i tessuti contro successiva, ischemia più gravi attraverso la aumenta i meccanismi endogeni nel tessuto colpito. Ischemia subletali è stato anche dimostrato di upregulate meccanismi protettivi nei tessuti remoti. Un breve periodo di ischemia (5-10 minuti) nella arto posteriore dei mammiferi induce risposte auto-protettivo nel cervello, polmoni, cuore e retina. L'effetto è noto come precondizionamento ischemico remota (RIP). E 'un modo terapeutico promettente per proteggere organi vitali, ed è già in fase di sperimentazione clinica per il cuore e il cervello lesioni. Questa pubblicazione illustra un metodo minimamente invasivo controllato di fare un arto - specificamente dell'arto posteriore di un ratto - ischemico. Un sfigmomanometro sviluppato per l'uso nei neonati umani è collegato ad un misuratore di pressione manuale e utilizzato per applicare pressione 160 mmHg attorno alla parte superiore degli arti posteriori. Una sonda progettato per rilevare la temperatura della pelle è utilizzato per verificare l'ischemia, registrando il calo della temperatura della pelle causata da occlusione indotta pressione delle arterie delle gambe, e l'aumento della temperatura che segue rilascio del bracciale. Questo metodo di RIP offre protezione alla retina topo contro i danni indotti luce brillante e degenerazione.

Introduction

La sopravvivenza di più, forse tutti, i tessuti a fronte di stress metabolico può essere migliorata prima condizionata con un periodo di ischemia subletale ^1,2. Precondizionamento ischemico (IP) in termini pratici è l'esposizione del tessuto di ischemia subletali, prima che le esperienze tessuto stressanti più gravi, ad esempio un successivo insulto ischemico. In modelli animali, IP fornisce una protezione notevole al cervello, retina, cuore e polmoni ^3-6. Di conseguenza, le osservazioni in pazienti colpiti da ictus hanno mostrato un legame tra precedenti attacchi ischemici transitori e migliori risultati clinici ^7,8. IP protegge anche fotorecettori retinici di infortuni non ischemiche ^9.

L'efficacia di IP in diversi tessuti e lesioni suggerisce che sta attivando un meccanismo innato della sopravvivenza cellulare presente in tutti i tessuti. Precondizionamento ischemica del miocardio è stato suggerito di avere effetti protettivi attraverso upregulationdell'ipossia fattore inducibile (HIF), noto per regolare molte vie metaboliche attraverso il rilascio di adenosina o attraverso l'apertura di canali del potassio ATP mitocondriale ^10,11. Canali di rilascio di adenosina e ATP potassio sono implicati in ischemia cerebrale ma, le indagini sui meccanismi neuroprotettivi di condizionamento ischemico fino ad oggi si sono concentrati su modifiche anti-eccitotossicità, anti-apoptotici e anti-infiammatori percorsi ^12,13. Nel complesso, la comprensione del processo molecolare di condizionamento ischemico per proteggere i neuroni è limitata.

Remote tentativi ischemici precondizionamento per condizionare organi lontani criticamente importanti (cuore, cervello, polmoni) generando ischemia nei tessuti meno critiche. Precondizionamento ischemico remoto (RIP) utilizzando l'arto posteriore è stato dimostrato di essere neuroprotettivi in modelli di roditori di ictus ^14-17. Il metodo descritto da noi fornisce un prot semplice, affidabile e non invasivaocol per indurre RIP.

La stragrande maggioranza dei protocolli RIP comporta dell'arto posteriore, presumibilmente perché l'arteria femorale trova nella arto posteriore superiore può essere facilmente individuabile ed accessibile per il bloccaggio chirurgici e applicazione del laccio. In arto invasiva studi ischemici per lo studio di cervello e protezione della pelle, ischemia viene indotta separando l'arteria femorale dai legamenti all'inguine e bloccaggio dell'arteria femorale ^2,15,18.

L'ischemia derivante sia cuffing arto o femorale serraggio è stata confermata dai cambiamenti al lembo compresa una perdita di impulso, diminuzione della ossigenazione e un calo della temperatura cutanea. Ischemia remota può essere confermata dalla perdita del polso utilizzando laser Doppler o ultrasuoni Doppler ^17-19. La temperatura cutanea può essere utilizzata come alternativa al Doppler sebbene la relazione non è lineare ^20,21. Registrazioni accurate di temperatura sono comuni in laboratori e lattinaessere facilmente incorporato in studi ischemiche remoti.

Un'alternativa alla femorale serraggio chirurgia è l'induzione di ischemia utilizzando un laccio emostatico. Applicazione Tourniquet produce ischemia paragonabile a quella ottenuta con vaso di bloccaggio; Kutchner et al. rispetto invasiva arteria femorale di bloccaggio ad un laccio emostatico non invasiva e trovarono entrambi i metodi fermarono il flusso di sangue all'arto e danni alla pelle ridotta in un modello di chirurgia plastica del lembo cutaneo ischemia ^18. Ammanettamento o la gamba o il braccio e di aumentare la pressione del bracciale sopra la pressione sistolica è stato trovato per essere protettivo contro il danno ischemico nei suini e nell'uomo ^17,19,22.

Diverso laccio emostatico approcci per indurre a distanza ischemico include l'uso di un bracciale per la pressione arteriosa o una fascia elastica ^17,22,23. Tuttavia, l'uso di un elastico per indurre ischemia è un metodo sicuro, potenzialmente dando luogo a un importo non regolata di pressione nelarto, con aumenti pressione superiori a 500 mmHg in fase di registrazione negli esseri umani ^24. Inoltre, ischemia utilizzando un elastico porta a danno muscolare nei ratti dopo la rimozione del gruppo ^23, come valutato da Evans Blu Dye, un marcatore in vivo delle miofibre permeabilità ^25. Al contrario, la consegna di una pressione controllata per il laccio può essere raggiunto utilizzando una pressione sanguigna bracciale collegato ad un ^17,19,22,26 sfigmomanometro.

In questo studio, un modello di lesione luce fotorecettori degenerazione è stato utilizzato per dimostrare l'efficacia neuroprotettiva di distanza precondizionamento ischemico. Ischemia a distanza è stato indotto subito prima infortunio leggero, e ha impedito la successiva degenerazione dei fotorecettori, come confermato da test di funzionalità della retina. Il video che accompagna dimostrerà l'applicazione di ischemia a distanza non invasivo.

Protocol

Affermazione Etica: Il protocollo segue le linee guida per la cura degli animali dell'Università di Sydney, AEC # 5657. Anestesia è stato approvato dal comitato etico degli animali (Università di Sydney, AEC # 5657).

1. apparecchiature Preparazione

1. Utilizzare in tempo reale il monitoraggio della temperatura della pelle. Accendere computer e hardware di acquisizione dati.
2. Software di registrazione della temperatura aperta e regolare impostazione temperatura tra 30-35 ° C e la frequenza di campionamento per ogni 100 msec.
3. Opzionale: Inserire termometro rettale per garantire la temperatura interna rimane stabile a 37,5 ° C.

2. Taratura del sfigmomanometro manuale

1. Collegare neonatale bracciale a sphygmomanometer.Use un bracciale formato 2 per un 250-550 g topo. Un adattatore può essere necessario collegare il tubo del manicotto al sfigmomanometro.
2. Sgonfiare la cuffia da una allentando la valvola di sfiato o scollegare il tubo del bracciale dal adattarsio. Assicurarsi nessuna pressione rimane nel tubo e l'ago del manometro poggia a zero all'interno dell'ovale / rettangolo.
3. Controllare la pressione tra tubi, manometro e bracciale. Gonfiare la cuffia con pompe dolci del bulbo inflazione fino a quando si legge 100 mmHg sul manometro. Assicurarsi che la pressione rimane costante. Sgonfiare il bracciale aprendo lentamente il valore di cessione d'aria.

3. Preparazione degli animali

Nota: Gli animali che devono subire lesioni luce richiede adattamento scuro la sera prima dell'ischemia a distanza. Animali sottoposti a danno luce richiedono allevamento (luce 12 ore: Ciclo scuro (5 lux)) scuro

1. Eseguire ischemia a distanza sia in roditori svegli o anestetizzati. Assicurarsi che gli animali hanno un tono muscolare sano. Garantire questo pizzicando dell'arto posteriore superiore per confermare che vi sia adeguata presente muscolare. Protezione RIP indotto da lesioni luce è stato testato nei ratti sedentari fino a 6 mesi di età.
2. Preparazione anestetizzati per RIP
   1. Iniettare ratti con una iniezione intraperitoneale di 60 mg / kg di ketamina e 5 mg / kg xilazina. Controllare la profondità dell'anestesia estendendo la gamba e pizzicando la pelle sulla parte inferiore del piede. L'animale non ha riflesso se è profondamente anestetizzati. Applicare lacrime artificiali per evitare secchezza della cornea mentre sotto anestesia.
   2. Posizionare ratti sia su un pad di calore o tubi di riscaldamento acqua circolante per mantenere una temperatura costante di 37,5 ° C corpo. Posizionare il topo in posizione prona con rilievi del piede degli arti inferiori verso l'alto. Sia a destra oa sinistra arto possono essere sottoposti a ischemia a distanza.
3. Preparazione Awake per RIP
   Nota: Awake sperimentazione animale sono necessarie due persone. Una persona trattiene l'animale e la seconda persona gestisce il sfigmomanometro manuale. Gli sperimentatori devono essere sicuri per eseguire la procedura di ritenuta aumenta il rischio di lesioni per i gestori. I ratti sottoposti a ischemia a distanza devono essere condizionati to moderazione manuale. A seconda delle indicazioni intuitive moderazione manuale dovrebbe essere progresso da 30 secondi a un massimo di 5 minuti per un certo numero di settimane. Animali timidi che non riescono ad acclimatarsi a moderazione manuale dovrebbero essere esclusi dalla sperimentazione sveglio. Infine, moderazione manuale può causare lo stress (e potenzialmente introdurre confonde allo studio) per gli animali e una coorte finzione (il posizionamento del bracciale senza infiammazione) deve essere utilizzato per interpretare con precisione i risultati dello studio RIP.
   1. Tagliare un asciugamano in 15 cm x 30-50 cm pezzo e posizionare il bordo corto perpendicolarmente alla colonna vertebrale del ratto, che copre la testa verso l'alto degli arti posteriori.
   2. Tuck il lato corto sotto il torso del ratto strettamente e cominciare ad avvolgere il topo con il lato lungo rimanente asciugamano. Fissare l'animale avvolto sotto il braccio in posizione supina. Se il ratto si svolge sotto il braccio sinistro, liberare arto destro del ratto dal telo.

4. Applicazione of Sonda temperatura cutanea

1. Estendere la gamba del ratto che deve subire ischemia e posizionare la sonda pelle sulla zampa. Posizionare la sonda pelle a massimizzare il contatto tra la sonda di temperatura e la pelle. Spingere la sonda nel zampa e apporre la sonda con nastro di carta.
2. Controllare la posizione della sonda pelle con il tracciamento della temperatura sul software di registrazione della temperatura. Assicurarsi che la temperatura della pelle è tra i 30-34 ° C e rimane stabile. Traccia la temperatura della pelle per 1-2 min. Regolare la sonda pelle se la temperatura è instabile o inferiore a 30 ° C.

5. Ischemia Remote

1. Sgonfiare il bracciale e garantire la valvola dell'aria viene chiusa. Estendere la gamba e vagamente circondare il bracciale sul arto posteriore superiore. Utilizzare l'indice e pollice per estendere la gamba e le cifre inferiori per mantenere il bracciale in posizione allentata.
2. Aumentare pressione della cuffia dell'animale anestetizzati a 160 mmHg, e in animali svegli increase la pressione del bracciale a 180 mmHg.
   Nota: La pressione sanguigna dei ratti anestetizzati varia 120-140 mmHg e sale a 160 mmHg se cosciente. Iniziare le registrazioni con il timer e temperatura del piede una volta raggiunta la pressione corretta.
   Nota: La temperatura piede dovrebbe cadere da 2 ° C dopo 5 min di pressione costante.
3. Mantenere la posizione del bracciale sopra "ginocchio" dell'animale tutto il ischemia. La pressione del bracciale inizierà a cadere dopo pochi minuti, o se l'arto del ratto è in movimento.
4. Pompare ripetutamente il bulbo di inflazione in brevi raffiche di mantenere la pressione del bracciale desiderata breve scoppio ripetuto di pompaggio
5. Ischemia remota può essere consegnato in continuo tra il 5 e 15 min. Il protocollo ischemia riperfusione comprende 2 periodi di 5 minuti ischemia con un intervento 5 min di riperfusione.
6. Sgonfiare la pressione del bracciale svitando la valvola dell'aria. Controllare la variazione di temperatura nel corso della pro ischemiaprotocollo. Rilasciare il bracciale.
7. Continuare con la ferita sperimentazione. Animali sotto l'effetto dell'anestesia dovrà essere collocato su un pad termico. Continuare a monitorare gli animali fino ambulatoriale. Gli animali non possono essere restituiti alla casa fino a quando si cammina.

6. Luce Pregiudizio - Retina Degenerazione Modello

1. Scuro adattare gli animali durante la notte (12-15 h). Subito dopo ischemia condizionata a distanza o ischemia remota sham (moderazione animale) posto animali in perspex alloggiamento con cibo e acqua.
2. Accendere lampade fluorescenti (1.000 lux) situato sopra Perspex abitazioni alle 9 del mattino per 24 ore. Dopo l'esposizione alla luce, rispedire gli animali dim illuminazione ciclica per 7 giorni.

Procedure Ischemia 7. Post-remote

1. Valutazione Vision con Elettroretinogramma (ERG):
   Nota: Il ERG set-up e il protocollo del flash seguiti Brandli e Stone ^26.
   1. Scuro adattare gli animali durante la notte (12-15 ore). Sottodim illuminazione rossa anestetizzare gli animali mediante iniezione intraperitoneale di ketamina e xilazina (60 mg / kg e 5 mg / kg, rispettivamente). Midriatico (solfato di atropina 1,0%), anestesia corneale (proximetacaina 0,5%).
   2. Applicare l'idratazione corneale (Carbomero polimero) collirio subito alla cornea. Applicare gel oftalmico ad intervalli di 20 min per mantenere l'idratazione corneale.
   3. Disegnare un filo vagamente legato intorno al bulbo oculare per aiutare le registrazioni stabili ERG. Temperature Monitor utilizzando una sonda rettale e mantenere la temperatura corporea dell'animale a 37-37,5 ° C.
   4. Posizionare la testa all'interno di una sfera di integrazione Ganzfeld.
      Nota: Il Ganzfeld è uno stimolo leggero completamente programmabile che fornisce uniformi briciolo lampi da LED per l'occhio.
   5. Registrare il elettroretinogramma utilizzando 4 mm platino elettrodo positivo misura sfiorando cornea e un diametro Ag / AgCl elettrodo pellet 2 millimetri inserito in bocca. Riferimento entrambi gli elettrodi ad ago in acciaio inossidabileinserito per via sottocutanea in groppa.
   6. Segnali di registrazione con gli impostazione passa-banda di 0.3-1,000 Hz (-3 dB), con un tasso di acquisizione 2 kHz (strumenti ad). Dopo una registrazione stabile ERG è stabilito soggetto l'animale a un 10 minuti adattamento al buio prima di iniziare le registrazioni.
   7. Seguire il protocollo flash come precedentemente descritto da Brandli e Stone ^26.
      1. Programmare la durata del flash (abbiamo usato lampeggia 1-2 msec in durata), e impostare l'intensità di -4.4 a 2.0 log scotto cd.sm ^-2. Utilizzare lampi (log 2.0 scotto cd.sm ^-2, 1 ms) per misurare la funzione retinica. In questo studio è il confronto tra il controllo, infortunio leggero e lesioni leggero con RIP.

8. TUNEL Assay

1. Eutanasia animali mediante iniezione intraperitoneale di sovradosaggio fenobarbital (100 mg / kg). Enucleare gli occhi e fissare nel 4% paraformaldeide.
2. Lavare gli occhi in PBS prima cyroprotectingocchi notte in saccarosio al 30% (w / v). Incorpora gli occhi in OCT e tagliare in 20 sezioni micron sagittali con un criostato.
3. Eseguire il test TUNEL su sezioni retiniche con colorazione DAPI seguendo il protocollo di Maslim et al. ²⁷
4. Utilizzare la microscopia a fluorescenza per TUNEL conteggi della retina. Cellule TUNEL sono stati registrati dallo strato nucleare esterno (ONL); lo strato più esterno della retina, che contiene nuclei fotorecettori. In questo studio, i conteggi TUNEL stati effettuati in triplicato per ogni occhio, con 5 occhi per ciascun gruppo di trattamento.
5. Utilizzare ANOVA per gruppo statistico confrontare gli strumenti di controllo, lesioni luce, e del pregiudizio + RIP luce ratti.

Results

Un bracciale di pressione sanguigna elevata sopra 160 mmHg blocca il flusso di sangue al arto posteriore come si vede chiaramente nella figura 1B. La mancanza di ossigenazione dei tessuti determinato una riduzione temperatura del piede dell'animale per un protocollo ischemia-riperfusione (Figura 2). La temperatura del piede (33 ° C) è stata inferiore a quella temperatura interna ed affidabile ridotta durante l'elevazione pressione della cuffia (31 ° C), che sorge quando il bracciale è s...

Discussion

Roditore ischemia degli arti posteriori è stata indotta con successo con uno sfigmomanometro manuale e cuff fornire neuroprotezione ai fotorecettori della retina. Un risultato in linea con ischemico condizionata indotto la protezione dei fotorecettori da un infortunio leggero ^9,28.

In sostanza, l'ischemia a distanza provoca breve ossigeno privazione ai tessuti. Quindi, a distanza precondizionamento ischemico ha molte somiglianze con condizionata ischemica o tolleranza ischemic...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sfigmomanometro aneroide manuale DuraShock serie Gold	Welch Allyn	DS56	Sfigmomanometro manuale
Neonato [misura 2] 1 tubo, confezione da 10	Welch Allyn	5082-102-1	Bracciale per la pressione sanguigna degli arti
Adattatore Luer lock	Welch Allyn	5082-178	Adattatore per bracciale neonatale
Pod termistore AD	Instruments	Unità di temperatura cutanea	ML 309
Sonda per la temperatura della pelle	AD Instruments	MLT 422/A
Powerlab, hardware di acquisizione a 4 canali	AD Instruments	PL 35044
Sistema di coperte omeotermiche con sonda flessibile	Harvard Appartus	507222F
Asciugamano			opzionale: ischemia remota da sveglio
Isoflo - 100% isoflurano (250 ml)	Abbot Animal Health	05260-05	opzionale: anestetico per inalazione ischemia remota
Ketamil - ketamina 100 mg/ml (50 ml)	Troy Laboratories Pty Ltd		opzionale: ischemia remota anestetica iniettabile
Xylium - Xilazina 100 mg/ml (50 ml)	Troy Laboratories Pty Ltd		opzionale: ischemia remota anestetica iniettabile