Sviluppo di un In vitro Sistema modello per studiare l'interazione tra Equus Caballus IgE con il suo recettore ad alta affinità FcεRI

Summary

Il presente studio descrive lo sviluppo e le applicazioni di un sistema di analisi geneticamente modificato basato sulla trasfezione di cellule leucemiche basofile di ratto con il gene equino FcεRIα. Le cellule trasfettate esprimono un recettore funzionale in cui il rilascio di mediatori della risposta allergica può essere attivato da IgE e antigene.

Abstract

L'interazione delle IgE con il suo recettore Fc ad alta affinità (FcεRI) seguita da una sfida antigenica è la via principale nelle reazioni allergiche IgE mediate. Come conseguenza dell'elevato legame di affinità tra IgE e FcεRI, insieme alla continua produzione di IgE da parte delle cellule B, le allergie di solito persistono per tutta la vita, senza attualmente una cura permanente disponibile. I cavalli, in particolare i cavalli da corsa, che sono comunemente consanguinei, sono una specie di mammiferi molto inclini allo sviluppo di risposte di ipersensibilità, che possono compromettere seriamente le loro prestazioni. Le risposte fisiologiche alla sensibilizzazione allergica nei cavalli rispecchiano quelle osservate nell'uomo e nei cani. In questo articolo descriviamo lo sviluppo di un sistema di analisi in situ per la valutazione quantitativa del rilascio di mediatori della risposta allergica relativa al sistema equino. A tal fine, il gene che codifica per l'equino FcεRIα è stato trasfettato ed espresso sulla superficie delle cellule parentali di leucemia basofila di ratto (RBL-2H3.1). Il prodotto genico della α-chain equina trasfettata ha formato un complesso recettoriale funzionale con le β e γ-chain endogene di ratto ¹. Il sistema di analisi risultante ha facilitato una valutazione della quantità di mediatore secreto dalle cellule RBL-2H3.1 trasfettate con FcεRIα equina dopo sensibilizzazione con IgE equine e provocazione antigenica utilizzando il rilascio di β-esosaminidasi come lettura ^{2, 3}. Il rilascio del mediatore ha raggiunto il picco del 36,68% ± del 4,88% a 100 ng ^ml-1 di antigene. Questo test è stato modificato rispetto ai precedenti test utilizzati per studiare le risposte allergiche umane e canine ^{4, 5}. Abbiamo anche dimostrato che questo tipo di sistema di dosaggio ha molteplici applicazioni per lo sviluppo di strumenti diagnostici e la valutazione della sicurezza di potenziali strategie di intervento terapeutico nelle malattie allergiche ^{6, 2, 3}.

Introduction

Allergia è noto da millenni. Un trattamento di asma è stato descritto nel testo medico egiziano antico noto come il Papiro di Ebers (~ 1550 aC) e discusso i rimedi a base di erbe per il trattamento di essa ^7.

Allergia Oggi è classificata come una risposta di ipersensibilità di tipo I, in cui il tipo cellulare T helper 2 (TH ₂₎ braccio del sistema immunitario dirige la produzione di anticorpi immunoglobulina E (IgE) in risposta ad antigeni ambientali chiamati allergeni. Si tratta di sostanze diverse che comunemente interagiscono con le cellule del sistema immunitario e stimolano la sintesi e la secrezione di citochine pro-infiammatorie, comprese interleuchina-4 e interleuchina-13 ^{8, 9} così come particelle in particelle di fumo di sigaretta o di scarico diesel che permettono di migliorare la sintesi di IgE ^10.

L'aumento delle manifestazioni allergiche nei paesi industrializzati negli ultimi 50 anni è stata attribuita ad una combinazione dell'effetto diinquinanti ambientali e una tendenza a un ambiente più igienizzato, che si combinano per spostare la risposta immunitaria verso un profilo predominato da TH ₂ citochine, come proposto dalla 'ipotesi dell'igiene' ^11.

Come accennato in precedenza, gli esseri umani non sono gli unici mammiferi affetti da allergia. In particolare cavalli e cani possono anche sviluppare reazioni allergiche classiche e uno studio di ¹² ha dimostrato che, come negli esseri umani, allergia equina è attribuito a fattori genetici e ambientali. Di conseguenza, questi animali presentano un buon modello per studiare l'interazione tra cause genetiche e ambientali di allergia, la sua progressione da sensibilizzazione alla malattia, e le possibili strategie di intervento una volta che le manifestazioni cliniche indicate nel

Nel 1887, Stömmer stato il primo a descrivere la somiglianza tra umano e asma equina ^13, l'effetto dell'istamina sul sistema cardiovascolare equina èmolto simile a quello umano ^14. I cavalli sono anche la pietra angolare del settore corse di cavalli, che vale la pena di US $ 72 miliardi, con un giro d'affari delle scommesse di US $ 115 miliardi di dollari all'anno ^15.

La maggior parte dei cavalli da corsa in stile contemporaneo sono discendenti del piccolo numero di cavalli arabi allevati da Lady Anne Blunt dal 1878 in poi. Cavalli da corsa moderne sono comunemente inbred selezionare per le abilità di performance. Essi sono inclini a malattie genetiche, uno dei quali è la loro suscettibilità a montare reazioni allergiche. Essi hanno anche 1000 volte più elevati livelli di IgE nel siero rispetto anche gli esseri umani più gravemente allergica ^16. Reazioni allergiche a cavallo sono di solito manifestano come puntura d'insetto ipersensibilità (IBH) ^{17, 18.} IBH risultati nella dermatite a causa di punture di insetti formano nel genere Culicoides. Un'altra forma di malattia allergica equina è ostruzioni delle vie aeree ricorrenti (RAO), questo si manifesta nei polmoni e le vie respiratorie. E 'caratterizzata da respiro sibilante e laboratoriorespirazione OR. RAO comunemente si verifica in risposta alla muffa spore, e alti livelli di IgE allergene-specifici sono stati registrati nei cavalli affetti da RAO in uno studio di ¹⁹ anche se un'altra inchiesta non ha confermato che ^20.

Gli studi su allergie equina ruotavano attorno al tentativo di controllo e di neutralizzare equina IgE attraverso lo sviluppo di anticorpi anti-equino IgE monoclonali (MAK, MAB) ^{21, 22.} Inoltre lo studio entro ^{il 23} illustra la produzione dei domini extracellulari di α equina ad alta affinità Fc recettore catena (FcεRIα) recettori nel tentativo di rilevare e quantificare siero equino IgE. Uno studio correlato da Ledin ²⁴ illustra un nuovo approccio volto a neutralizzare il siero IgE dal priming del sistema immunitario con un self / non-self immunogeno. Tutti questi studi, tuttavia, non avevano un test efficace per testare la sicurezza e l'efficacia dei loro protocolli. In questo articolo, presentiamo ora tale prova sysTEM applicabile allo studio di strategie diagnostiche e terapeutiche relative al sistema equina, dove rilascio β-dell'esoaminossidasi, come indicatore di mediatore degranulazione delle cellule, è stata valutata su cellule RBL-2H3.1 esprimono equina FcεRIα. Questo protocollo si basa su precedenti pubblicazioni ^{25, 4, 5, 2, 3} descrivono l'ingegnerizzazione di cellule RBL trasfettate con il gene codificante il dominio di legame del recettore IgE ad alta affinità per le IgE da specie diverse. Il protocollo descritto come eseguire un saggio di rilascio β-dell'esoaminossidasi, i cui risultati sono presentati come media ± deviazione standard di esperimenti in triplo.

Il saggio di rilascio è stato sviluppato da Siraganian e gancio ²⁵ per studiare l'allergia umana. Il gruppo del laboratorio guidato dal dottor Reuben Siraganian ha sviluppato anche la linea di cellule RBL. Queste cellule RBL sono stati sviluppati per esprimere la FcεRIα umana e il protocollo è stato pubblicato da ^4. Il pezzo finaledel dosaggio venuto con lo sviluppo del plasmide pSV nel lavoro di Neuberger ²⁶ che descrive la produzione di un anticorpi IgE clonando suo pesante gene della catena a valle di un gene del mouse per una regione variabile di IgE che gli obiettivi l'aptene 4-idrossi-3 nitro-phenacetyl (NP), l'anticorpo chimerico risultante era perfettamente funzionante. La possibilità di sviluppare qualsiasi IgE rivolti stesso aptene, ma anche di clonazione suo recettore sulla superficie delle cellule RBL portato alla normalizzazione del dosaggio rendendolo un protocollo utile per misurare la degranulazione dei basofili.

Il test ha i pro e contro. I pro del saggio è la sua adattabilità ad essere utilizzato in qualsiasi sistema di mammiferi, il nostro laboratorio ha quindi utilizzato per verificare la degranulazione dei sistemi umani, canini e equino, e questo è realizzabile semplicemente sintetizzando IgE dell'organismo e la clonazione suo recettore sulla superficie delle cellule RBL.

D'altronde,i contro del saggio è che le cellule RBL sono molto sensibili alle variazioni termiche, meccaniche e PH, rendendoli dare una variazione dei livelli di degranulazione all'interno dello stesso dosaggio. E 'quindi fortemente consigliato che i dosaggi vengano sempre ripetuti in triplicato e quindi una media è preso da loro. Inoltre, le cellule RBL tendono a spostarsi verso un fenotipo non-rilascio se lasciati in coltura per un tempo prolungati (> 10 settimane) ^27, rendendo la loro manutenzione ingombrante. Sono anche soggetti a infezioni da batteri micoplasma, che non sono visibili al microscopio ottico e non modificano la morfologia della cellula, ma sarebbero drasticamente cambiare i loro livelli di degranulazione. Pertanto sono necessari test micoplasma regolari.

Protocol

1) Preparazione di Cell Line:

1. Sviluppare la linea di cellule RBL-2H3.1 esprimere equino α FcεRI:
   1. Utilizzando tecniche di base di coltura di tessuti per linee cellulari monostrato, trasfezione le cellule RBL-2H3.1 genitori utilizzando il plasmide pEE6, che porta il gene equina FcεRIα (GenBank: Y18204.1) ^28. Aggiungere 2 mg ml ^-1 del DNA plasmidico a 0,8 ml di cellule ad una densità di 1,2 x 10 ⁷ cellule ml ^-1. Elettroporazione le cellule a 250 V, 960 mF utilizzando un 0,4 centimetri electrocuvette incubare immediatamente in ghiaccio per 10 min.
   2. Selezionare le cellule trasformate utilizzando supporti contenenti 0,4 g di solfato di geneticina G418, quindi ordinare le rimanenti cellule viventi mediante FACS da loro codifica con un anticorpo fluorescente IgE. Utilizzare il conseguente RBL-2H3.1 esprimere equina linea cellulare FcεRIα per lo studio ^{2, 3.}
2. Pre-dosaggio degli anticorpi di sensibilizzazione:
   1. 5 cellule ml ^-1.
   2. Aggiungere l'IgE di interesse per le cellule in sospensione ad una concentrazione finale di 1 ng ml ^-1, poi piastra 100 microlitri di cellule su una piastra da 96 pozzetti a colonne 1-6 e incubare a 37 ° C + 5% di CO ₂ + 90% umidità relativa per 16 ore. Dopo il periodo di incubazione, e prima di eseguire il test di rilascio, controllare i pozzi sotto un microscopio per la confluenza bene e l'adesione delle cellule.

2) saggio di rilascio:

1. Lavare le cellule:
   1. Buffer di stampa a caldo (PIPES 25 mM, 120 mM di cloruro di sodio, 5 mM di cloruro di potassio, 0,04 mM di cloruro di magnesio, e 1 mM di cloruro di calcio) a 37 ° C per consentire il lavaggio delle cellule delicato.
   2. Lavare le cellule muovendo il piatto per rimuovere il supporto delle cellule e l'aggiunta di 100 ml caldo, 37 ° C, buffer di stampa. Ripetere due volte.
2. Sfida Antigen:
   1. Preparare una diluizione in serie dell'antigene (NIP-HSA o DNP-HSA) di 0 ng ml ^-1, 0,1 ng ml ^-1, 1 ng ml ^-1, 10 ng ml ^-1, 100 ng ml ^-1, 1.000 ng ml ^-1, 10.000 ng ml ^-1 nel buffer di stampa e calda a 37 ° C.
   2. Dopo il secondo lavaggio delle cellule, scartare i media e sostituito con 100 microlitri delle soluzioni di antigene. Assicurarsi che i pozzetti di una stessa fila (A1-6 per esempio) hanno la stessa concentrazione dell'antigene aggiunto a loro.
   3. Impostare un controllo negativo nella riga A con l'aggiunta di antigene 0 ng ^-1 ml. Aggiungere crescente concentrazione dell'antigene le righe (BG) seguiti da triton x-tampone (5% Triton X-100) in cellule H riga per lisare le cellule per essere utilizzato come controllo positivo. Incubare a 37 ° C per 20 minuti per permettere alle cellule di rilasciare i suoi mediatori.
3. Impostazione di controlli e individuali:
   1. Dopo l'incubazione, trasferire 50 ml di surnatante cellula all'altra metà delle piastre (pozzi a pozzi A1-6 A7-12, ecc). Scartare i restanti 50 ml di surnatante e sostituire con 50 ml di triton x-tampone per consentire la misurazione della quantità di mediatori rilasciati in ciascun pozzetto in colonne 7-12 come percentuale dei mediatori totale all'interno delle celle nella colonna 1-6 .
4. Substrato enzimatico:
5. Aggiungere 50 ml di substrato β-dell'esoaminossidasi (50 mM 4-nitrofenil N-acetil-β-D-glucosaminide preparata in DMSO diluita fino a 2 mM aggiungendolo al tampone citrato 0,2 M di acido citrico e sodio acetato 0.2 M, pH 4.5) a tutti i pozzetti facilitato la conversione del substrato 4-nitrofenolo dall'enzima β-dell'esoaminossidasi. Incubare le piastre a 37 ° C per 2 ore.

5. Terminare la reazione:
   1. Arrestare la reazione aggiungendo 150 microlitri del tampone Tris (1 M Tris-HCl, pH 9) a ciascun pozzetto come l'alto pH del tampone arresta la reazione e trasforma il 4-nitrofenolo in un colore giallo.
6. La lettura e l'analisi dei risultati:
   1. Leggere la piastra utilizzando uno spettrofotometro piastra a 405 nm per misurare l'assorbanza del colore giallo. Calcolata la percentuale di rilasciato β-dell'esoaminossidasi utilizzando la seguente formula:

2. Applicare questa formula in ogni pozzetto, dopo di che in media è data per ogni riga. A1 e A7 rappresentano la posizione dei pozzetti della piastra da 96 pozzetti. Tracciare un grafico della percentuale di rilascio di β-esosaminidasi (che corrisponde al rilascio di mediatori totale) agaiNST antigene concentrazione di ^{2, 3.}

Results

I genitori cellule RBL-2H3.1 e quelle trasfettate con il gene del recettore equina FcεRIα sono stati sensibilizzati con il mouse IgE contro DNP-HSA e sfidati con l'antigene DNP-HSA. Mouse IgE si lega al recettore di ratto endogena in entrambe le linee cellulari e quindi agisce come un controllo per verificare la fattibilità rilascio di entrambe le linee cellulari di rilasciare mediatori (Figura 1 A). Questo è un controllo importante e dovrebbe essere effettuata regolarmente dal momento esteso (> 10 s...

Discussion

In sintesi i risultati di questa indagine hanno dimostrato che quando le cellule RBL-2H3.1 esprimono FcεRIα equini sono sensibilizzati con equina IgE e contestate da un antigene, danno un rilascio picco mediatore del 36.68% ± 4,88% del totale di mediatore all'interno della cellule, rispetto alla RBL-2H3.1 cellule parentali non esprimono equina FcεRIα.

Così questo test fornisce un utile strumento per indagare e studiare le risposte allergiche equini in vitro. La sua consente la d...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
RBL-2H3.1 che esprime fc&epsilon equino; RI&alfa;	-	-	Prodotto in laboratorio
IgE equino anti NIP-HSA	-	-	Prodotto in laboratorio
Piastra a 96 pozzetti	Sigma
CLS3595-Pipetta multicanale	Anachem	-
Incubatore	Galaxy R	-
4Idrossi-5-iodo-3-acido nitrofenilacetico	Cambridge Research Biochemicals	N-1070-1	NIP-OH è stato coniugato con l'albumina sierica umana per produrre NIP-HSA in laboratorio
Dinitrofenile coniugato con albumina sierica umana	Sigma	A6661	Spettrofotometro a piastre DNP-HSA abbreviato
	Anthos Labtec HT2	-	-
Tubi	Sigma	P1851-Cloruro
sodio	Sigma	S7653-Cloruro
di potassio	Sigma	P9333-Cloruro
di magnesio	Sigma	M2670-Cloruro
di calcio	Sigma	C1016-Triton
x100	Sigma	X100-4-nitrofenil
N-acetil-β-D-glucosaminide	Sigma	N9376	La soluzione madre chiamata substrato β-esosaminidasi era 50mM preparata in DMSO
Dimetil Solfossido	Sigma	D2650-Acido
citrico	Sigma		251275-Acetato
di sodio	Sigma	S7670-Tris
	Sigma	T5941	-