Cultura della embrionali di topo cocleari espianti e Gene Transfer con elettroporazione

Sommario

Presentiamo un metodo che descrive l'isolamento e la coltura di espianti cocleari dall'orecchio interno di topo embrionale. Dimostriamo anche un metodo per il trasferimento genico in espianti cocleari tramite elettroporazione a onda quadra. La coltura di espianti in vitro abbinata alla tecnica di trasferimento genico consente ai ricercatori di studiare gli effetti dell'alterazione dell'espressione genica durante lo sviluppo.

Abstract

Le cellule ciliate uditive situate all'interno dell'organo del topo di Corti rilevano e trasmettono informazioni sonore al sistema nervoso centrale. Le cellule ciliate meccanosensoriali sono allineate in una fila di cellule ciliate interne e tre file di cellule ciliate esterne che si estendono lungo l'asse basale e apicale della coclea. La tecnica di coltura dell'espiantaggio qui descritta fornisce un metodo efficiente per isolare e mantenere gli espianti cocleari dall'orecchio interno embrionale del topo. Inoltre, la morfologia e le caratteristiche molecolari delle cellule ciliate sensoriali e delle cellule di supporto non sensoriali all'interno delle colture di espianti cocleari assomigliano a quelle osservate in vivo e possono essere studiate all'interno del suo ambiente cellulare intrinseco. Gli espianti cocleari possono fungere da importanti strumenti sperimentali per l'identificazione e la caratterizzazione di percorsi molecolari e genetici coinvolti nella specificazione e nel patterning cellulare. Sebbene i modelli murini transgenici forniscano un approccio efficace per gli studi sull'espressione genica, un numero considerevole di mutanti di topo muore durante lo sviluppo embrionale, ostacolando così l'analisi e l'interpretazione dei fenotipi dello sviluppo. L'organo di Corti proveniente da topi mutanti che muoiono prima della nascita può essere coltivato in modo da poter analizzare il loro sviluppo in vitro e le risposte a diversi fattori. Inoltre, descriviamo una tecnica per l'elettroporazione di espianti cocleari embrionali ex vivo che può essere utilizzata per sottoregolare o sovraesprimere geni specifici e analizzare la loro potenziale funzione endogena e verificare se un prodotto genico specifico è necessario o sufficiente in un determinato contesto per influenzare lo sviluppo cocleare dei mammiferi^1-8.

Introduzione

L'organo mammifero di Corti è composto da un mosaico di tipi di cellule specializzate, tra cui due tipi di cellule ciliate meccanosensoriali e almeno quattro tipi di cellule di supporto non sensoriali che lo rendono un sistema modello ideale per studiare i normali processi cellulari come la proliferazione, la specificazione del destino, la differenziazione e il patterning. Inoltre, il normale sviluppo di questi diversi tipi di cellule è essenziale per la normale funzione uditiva. Pertanto, è fondamentale comprendere i fattori, sia molecolari che cellulari, che ne regolano lo sviluppo. Tuttavia, le piccole dimensioni della coclea di topo e la sua inaccessibilità rappresentano una sfida particolare per gli studi sull'espressione genica. Inoltre, la maggior parte degli eventi di specificazione e patterning del destino cellulare si verificano durante periodi di tempo embrionali e sono per lo più completati prima della nascita. Pertanto, l'identificazione e la caratterizzazione degli eventi di segnalazione durante i periodi di tempo embrionali è essenziale per ottenere informazioni sulle basi molecolari della morfogenesi cocleare.

Qui, dimostriamo un metodo per coltivare coclea intatta in vitro da orecchie interne di topo embrionali. Il razionale alla base dell'uso di questa tecnica è che le coclee in coltura mantengono le loro caratteristiche molecolari e morfologiche, fornendo così un modello prezioso per studiare potenziali geni candidati ed esplorare i meccanismi coinvolti nella morfogenesi cocleare. Sebbene i topi transgenici possano essere utilizzati per studi sull'espressione genica, è spesso necessario un sistema in vitro per monitorare specifiche funzioni geniche. Inoltre, le colture cocleari possono essere stabilite da embrioni di topo transgenico in modo da poter studiare il loro sviluppo in vitro e la risposta a vari fattori solubili e antagonisti. Sebbene in questo protocollo vengano utilizzati embrioni al giorno 13 (E13), le colture da E12 o E14 all'orecchio interno postnatale precoce possono dare risultati simili.

Presentiamo anche una tecnica di trasferimento genico in espianti cocleari embrionali in coltura utilizzando l'elettroporazione ad onda quadra. Dopo l'isolamento degli espianti cocleari, l'elettroporazione può essere utilizzata per esprimere plasmidi di DNA di geni di interesse in singole cellule all'interno del dotto cocleare. Questa tecnica funge da approccio complementare agli studi che utilizzano topi transgenici per ottenere informazioni sui percorsi molecolari alla base del fenotipo cellulare. Utilizzando questo metodo di trasferimento genico, una varietà di tipi di cellule epiteliali all'interno della coclea embrionale viene trasfettata, consentendo così analisi di perdita e guadagno di funzione a livello di singola cellula. Inoltre, gli studi elettrofisiologici possono essere eseguiti anche in colture di espianti cocleari⁸. Questo metodo di elettroporazione in vitro è relativamente semplice e diretto, combinato con un danno minimo al tessuto, ha portato a una rapida espansione di questa tecnica.

Protocollo

NOTA: Tutti i protocolli che impiegano animali vivi deve essere esaminato e approvato da una cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale (IACUC) e deve seguire i metodi per la cura e l'uso di animali da laboratorio ufficialmente approvato. Tutte le dissezioni devono essere eseguiti con tecnica sterile su un banco a flusso laminare pulita. Guanti e una maschera, se desiderato, devono essere indossati durante questa procedura.

1. La dissezione del Ear embrionali di topo interno

1. Impostazione per organo di culture espianto Corti:
   1. Sterilizzare la cappa coltura tissutale flusso laminare accendendo la luce UV per circa 30 minuti e disinfettare la superficie con etanolo al 70% prima dell'uso. Inoltre, sterilizzare tutti gli strumenti di dissezione tra cui strumenti di dissezione raffinati e piatti Sylgard rivestite di embrione dissezione tramite autoclave o per immersione in etanolo al 70% per almeno 20 minuti prima dell'uso. Eliminare il 70% di etanolo e lasciare i piatti e gli strumenti per aria secca in un flusso laminare Clea puliton panchina prima dell'uso.
   2. Preparare Balanced Salt Solution sterile di Hank (HBSS) / (4- (2-idrossietil) -1-acido piperazineethanesulfonic) (HEPES) miscela aggiungendo 10% di 10x HBSS e 0,5% HEPES e regolare il pH a circa 7,2 e sterilizzare il filtro soluzione finale e conservare a 4 ° C. Eseguire tutte le dissezioni di refrigerate soluzione HBSS / HEPES per conservare meglio il tessuto durante tutta la procedura.
   3. Piatti fondo di vetro a matrice Coat membrana basale aggiungendo 5 ml di freddo (4 ° C), sterile di Dulbecco modificato (DMEM) per un'aliquota di 300 ml di matrice membrana basale in una sterile 15 ml tubo di polipropilene. Mescolare vortexando contenuti e aggiungere 150 microlitri della miscela di matrice DMEM membrana basale al centro di ciascuna piastra di coltura in modo da coprire l'intera cultura ben presente al centro del piatto. Coprire i piatti e conservare in un 37 ° C incubatore per almeno 45 minuti prima dell'uso.
   4. Versare 4-5 ml refrigerate HBSS in three sterili piatti polistirene Petri e lasciare chiusi nella cappa.
   5. Preparare mezzo di coltura in una provetta da 15 ml di polipropilene sterile aggiungendo 9 ml di DMEM, 100 ml di integratori N2, 10 g / ml Cipro e 1 ml di FBS.
2. Isolamento di embrioni:
   NOTA: In questa procedura per la coltura di espianti cocleari da topi embrionali, raccolta orecchie interne dal giorno embrionale (E) 13 ossa temporali con il giorno dopo la fecondazione essere considerati come E1 ^9. Il protocollo può essere utilizzato anche con il mouse embrionale orecchio interno a partire dal E12 a E18.
   1. Euthanize un mouse a tempo-incinta di CO ₂ e sacrificare animali per dislocazione cervicale o appropriati protocolli approvati. Eseguire euthanization dalla cappa coltura tissutale a flusso laminare per mantenere la sterilità in sala coltura di tessuti.
   2. Posizionare il mouse eutanasia sul tovagliolo di carta con l'addome rivolto verso l'alto e disinfettare l'addome con il 70% di etanolo.
   3. Aprire la cavità addominale afferrando la pellecon pinze curve con una mano e dell'epidermide recisi e muscolo lungo la linea mediana con le forbici con un'altra mano. Fare due tagli perpendicolari su entrambi i lati e tirare fuori l'utero attentamente sollevando corna uterine bilaterali con una pinza e staccarla da sotto le forbici del tessuto connettivo con.
   4. Posizionare la catena embrionale in una capsula di Petri contenente soluzione raffreddata dissezione (miscela HBSS / HEPES) e trasferimento al banco pulito a flusso laminare.
   5. Rimuovere gli embrioni con attenzione di placenta e metterli in una delle piastre sterili contenenti soluzione dissezione. Se la soluzione diventa sanguinosa, spostarli in una nuova piastra di Petri.
      NOTA: A questo punto, gli embrioni possono essere messo in scena con una guida messa in scena Theiler.
   6. Decapitare embrioni pizzicando alla regione del collo con un paio di pinze o forbici pulite e posizionare le teste in un piatto fresco Petri contenente soluzione dissezione raffreddata.
3. La dissezione delle orecchie interne:
   1. Luogo one testa embrione in un piatto Sylgard sterile contenente dissezione a freddo
   2. soluzione. Lavorando sotto un microscopio da dissezione con un ingrandimento di 1,6X ~, immobilizzare la testa dell'embrione posizionando perni Minutien intorno o più vicino alla zona degli occhi (Figura 1A).
   3. Utilizzando due coppie di pinze sterili rimuovere con attenzione la pelle e aprire il cranio sul lato dorsale lungo la linea mediana (Figura 1B). Rimuovere cervello dalla cavità cranica e orecchie interne situate all'interno ossa temporali possono essere identificate in questa fase (Figura 1C, D). Il rivestimento del vaso sanguigno, che di solito è presente intorno l'orecchio interno, può essere utilizzato come punto di riferimento per identificare l'orecchio interno in questa fase (Figura 1D).
   4. Sezionare l'orecchio interno dalle ossa temporali posizionando la pinza sotto il tessuto e isolando l'orecchio interno dalla base del cranio e trasferimento in un piatto contenente soluzione di dissezione a freddo (Figura 1E, F).

2. Generazione di Organo delle Culture Corti Explant

NOTA: In questa fase di sviluppo, il tessuto è cartilagineo e può essere facilmente sezionato con pinze.

1. Orient l'orecchio interno in modo che parte ventrale è rivolto verso l'alto (Figura 2A) e stabilizzare l'orecchio interno inserendo dolcemente la punta di perni Minutien attraverso la porzione vestibolare dell'orecchio interno (Figura 2B).
2. Uso pinze ultrafini tagliare aprire la cartilagine sovrastante facendo un'incisione con una estremità di pinze vicino alla finestra ovale e rimuovere la cartilagine dalla coclea (Figura 2C) con attenzione.
   NOTA: È importante assicurarsi che pinze non sono inserite troppo profondamente nella cartilagine cartilagine sovrastante è talvolta fuso con il condotto cocleare nel qual caso è utile usare pinza chiusa per rilasciare la cartilagine dal condotto cocleare sottostante raschiando sotto la surface della cartilagine. A questo stadio di sviluppo, la spirale cocleare è solo tre quarti di giro in lunghezza.
3. Successivamente, esporre dell'epitelio sensoriale posizionando la pinza alla regione preferita del condotto cocleare, sia la base o per lo all'apice, e tirando delicatamente il tetto della coclea (Figura 2D).
   NOTA: Il tetto della coclea deve essere completamente rimosso in quanto può mascherare dell'epitelio sensoriale ostacolare l'analisi.
   NOTA: Questa procedura deve essere eseguita delicatamente come è facile da strappare dell'epitelio sensoriale.
4. Come ultima fase, rimuovere con attenzione il tessuto connettivo sottostante dall'epitelio sensoriale esposto modo che la base del trapianto cocleare è uniformemente piana.
5. Isolare la coclea sezionato dalla parte vestibolare dell'orecchio interno con pinze. Questo può essere eseguito prima o dopo la fase 2.4 (figura 2E).
6. Trasferire l'epitelio sensoriale cocleare sezionato in un seminterrato membrane matrix-rivestita cultura e con una paletta sterile 1,5 millimetri (Figura 2F).
7. Orient espianto cocleare con la superficie luminale dell'epitelio rivolto verso l'alto e aspirare la membrana basale soluzione di matrice-DMEM per appiattire accuratamente il tessuto e sostituirlo con 150 ml di terreno di coltura fresco aggiungendo delicatamente al piatto. Si deve prestare attenzione per assicurarsi che ogni espianto aderisce bene alla coprioggetto vetro rivestito e non sta galleggiando nel mezzo di coltura. Assicurarsi che la punta della pinza è rivolta verso l'alto, mentre apponendo sul bene di vetro per evitare di danneggiare l'espianto cocleare.
8. Trasferire delicatamente il piatto di cultura in un 150 millimetri piatto di coltura sterile e posto in un tessuto culturale incubatore a 37 ° C con il 5% di CO ₂ per il periodo di tempo desiderato, di solito 3-6 giorni in vitro (DIV). Dopo 1 DIV, esaminare le culture sotto un microscopio da dissezione per assicurarsi che l'espianto cocleare aderisce bene al piatto di coltura.
9. Dopo incubation in vitro per periodi di tempo desiderato, le culture sono trattati per immunoistochimica.
   NOTA: Le culture espianto di solito vengono incubate per 6 DIV che è equivalente a stadio di sviluppo, P0. Dopo incubazione in vitro, le culture possono essere trattati per altre applicazioni a valle come immunoistochimica (Figura 3B), RT-PCR, ibridazione in situ, e / o Western Blot.

3. Elettroporazione mediata Gene Transfer

1. Configurazione per elettroporazione:
   1. Sterilizzare uno 100 millimetri vetro piatto Sylgard rivestite in autoclave o immersione in etanolo al 70% per circa 20 minuti e lasciare asciugare in un banco pulito prima dell'uso.
   2. Preparare DNA da un vettore di espressione di scelta utilizzando opportuni kit simo o midi-preparazione. I vettori di espressione utilizzati in questo protocollo sono pIRES2-Atoh1.EGFP e pCLIG-NeuroD1.EGFP. La concentrazione finale di DNA deve essere di almeno 1 mg / mL in DNA sterile /Senza RNAse acqua.
2. Electroporating DNA in espianti cocleari embrionali:
   1. Aggiungere 10 ml di soluzione di DNA plasmidico da 100 mm a piatto Sylgard rivestite fresco e trasferire un espianto cocleare completamente sezionato (ottenuto dalla fase 2.5) nella soluzione di DNA.
   2. Con superficie luminale dell'epitelio rivolto verso l'alto, inclinare la coclea leggermente in modo che sia perpendicolare al piano del piatto.
   3. Collocare le piastre di elettrodi su entrambi i lati della coclea con paddle negativo (catodo) verso l'epitelio sensoriale e la pala positivo (anodo) adiacente alla base della coclea.
      NOTA: Poiché DNA è caricato negativamente, migra da negativo a elettrodo positivo e inserendo l'estremità del catodo della sonda adiacente dell'epitelio sensoriale; il DNA principalmente passare attraverso la superficie dell'epitelio sensoriale.
   4. Utilizzando elettroporatore, consegnare 9 a 10 impulsi di 24 mV, 30 msec durata dell'impulso con l'interruttore a pedale su tegli elettroporatore e aggiungere 100 ml di terreno di coltura caldo alla coclea elettroporate.
   5. Ripetere i passaggi 3.2.1-4 per tutti gli espianti cocleari e per il DNA di tutti i geni di interesse e di trasferire il coclee elettroporate nel piatto di matrice rivestite membrana basale per la placcatura (passo 2,7). Culture tutte le coclee elettroporate a 37 ° C, 5% CO ₂ incubatore umidificato per lunghezze desiderate di tempo che sarà poi elaborati per immunocitochimica.
      NOTA: La coclea da un'intera cucciolata di CD1 mouse (circa 8-12 cuccioli) può essere isolato, microdissezione, elettroporate e placcato in <4 ore.

4. Analisi delle Culture Cochlear Explant

NOTA: Le colture vengono incubate per 6 solito DIV che è equivalente a stadio di sviluppo, P0. Dopo incubazione in vitro, le culture sono fissi e trattati per immunocitochimica.

1. Dopo lunghezza desiderata di incubation, rimuovere terreno di coltura e rapidamente risciacquare l'espianto cocleare in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e incubare in 4% paraformaldeide (preparato in PBS) per 15 minuti a temperatura ambiente.
2. Lavare il fissativo aggiungendo PBS e sciacquare in PBS per tre volte per 15 min.
3. Permeabilize con PBS-T (PBS + 0,5% Tween) per 30 minuti prima di bloccare con PBS-T contenente siero di capra 10%.
4. Incubare in soluzione anticorpo primario contenente anticorpo primario in PBS-T con siero di capra 1% notte a 4 ° C.
5. Lavare la coclea tre volte a temperatura ambiente utilizzando PBS-T 15 min ciascuna prima di aggiungere anticorpi secondari coniugati Alexa appropriate.
6. Dal momento che l'espianto cocleare è colta sul vetrino di vetro può essere gestito individualmente isolando il vetrino dal piatto e montaggio su una diapositiva. Ciò può essere ottenuto immergendo il piatto di coltura in OS30 solvente per almeno 1 ora a temperatura ambiente. Utilizzando la lama di rasoio sterile, staccare il vetrino dal dish e montare su un vetrino e visualizzare sotto un microscopio a fluorescenza.

Risultati

Descriviamo un metodo per isolare la coclea dalle orecchie interne embrionali e micro-sezionare per esporre l'epitelio sensoriale. Una volta sezionato, può essere piastrato e coltivato come dotto cocleare intatto (Figura 3) e analizzato mediante immunoistochimica. Gli espianti cocleari in coltura forniscono un saggio utile per esaminare l'effetto di una varietà di fattori solubili e farmaci farmacologici sullo sviluppo cocleare. Dopo la dissezione degli espianti cocleari, la tecnica dell'elettroporazione...

Discussione

Tutte le cellule all'interno del labirinto membranoso dell'orecchio interno del mouse inclusi sensoriale, nonsensory ei neuroni gangliari a spirale sono tutti derivati ​​dallo placodally di derivazione otocyst adiacente al romboencefalo della ectoderma, intorno E8 ^10-14. Al E11, la regione ventrale del otocyst estende a formare il dotto cocleare e lo sviluppo continua, un gruppo di cellule epiteliali all'interno della coclea, così come in altre regioni del otocyst, diventano specificato come cerot...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
HBSS	Gibco	14065-056
HEPES	Gibco	15630-080
Dulbecco' s Modified Medium	Gibco	12430-054
Siero fetale bovino	Gibco	10082
N-2 Integratore (100x)	Gibco	17502-048
Ciprofloxacina cloridrato	Cellgro	61-277-RF
Piatto di vetro 60 mm	Kimble Chase	23062-6015/23064-6015
Piatto di vetro 100 mm	Kimble Chase	23064-10015/23062-10015
Perni minuziosi	Strumenti per le scienze fini	26002-15
Pinze Dumont #5	Strumenti per le scienze fini	11251-10
Generatore di impulsi	Protech International Inc	CUY21Vivo-SQ
Piastre per colture con fondo in vetro	MatTek	P35G-0-10-C
Matrice Matrigel	BD Biosciences	356237
Piatto di coltura, 60 x 15 mm	Becton Dickinson	353037
Piastre di coltura tissutale	Greiner Bio-one	639160
Soluzione salina tamponata con fosfato	Gibco	10010-023
OS-30	Dow Corning	4021768
Fluoromount	Southern Biotech	0100-01
Provette coniche, 15 ml	Greiner Bio-one	188261
Miosina 6	Proteus Biosciences Inc	25-6791
Miosina 7a	Proteus Biosciences Inc	25-6790
TuJ1	Sigma	T2200