Intubazione-mediata intratracheale (IMIT) instillazione: A non invasiva, Lung-specifico sistema di rilascio

Sommario

Intubazione endotracheale-mediata (IMIT) instillazione di reagenti è un eccellente metodo non invasivo per lo studio di malattie respiratorie, come pure un metodo per instillare reagenti terapeutici direttamente nel polmone. Si tratta di un metodo rapido e altamente riproducibile che è adatto per la prova preclinica.

Abstract

Studi sulle malattie respiratorie in genere comportano l'uso di modelli murini come sistemi sostitutivi. Tuttavia, ci sono notevoli differenze fisiologiche tra il topo e respiratorio umano, in particolare nelle loro vie respiratorie superiori (URT). In alcuni modelli, queste differenze nella cavità nasale murino possono avere un impatto significativo sulla progressione della malattia e la presentazione nel tratto respiratorio inferiore (LRT) quando si utilizzano tecniche di instillazione intranasale, potenzialmente limita l'utilità del modello di topo per studiare queste malattie. Per questi motivi, sarebbe vantaggioso sviluppare una tecnica di instillare batteri direttamente nei polmoni topo per studiare la malattia LRT in assenza di coinvolgimento delle vie aeree superiori. Abbiamo chiamato questa specifica tecnica di fornitura intubazione endotracheale-mediata (IMIT) instillazione del polmone. Questa tecnica non invasiva minimizza il potenziale per instillazione nel sangue, che può verificarsi durante tradizio più invasiveapprocci chirurgici onal intratracheali infezione, e limita la possibilità di consegna tratto digestivo incidentale. IMIT è un processo in due fasi in cui i topi vengono prima intubati, con una fase intermedia di garantire il posizionamento del catetere corretta nella trachea, seguiti da inserimento di un ago smussato nel catetere di mediare consegna diretta dei batteri nei polmoni. Questo approccio permette un'efficacia> 98% della fornitura nei polmoni un'eccellente distribuzione del reagente nel polmone. Così, IMIT rappresenta un nuovo approccio per studiare le malattie LRT e spedizione terapeutica direttamente nel polmone, migliorando sulla capacità di utilizzare topi come surrogati per studiare malattie respiratorie umane. Inoltre, la precisione e la riproducibilità del sistema di erogazione rende anche suscettibili di buona prassi di laboratorio (GLP), così come la consegna di una vasta gamma di reagenti che richiedono elevata efficienza di consegna al polmone.

Introduzione

I topi sono stati utilizzati per modellare numerose manifestazioni della malattia umana, compresa una miriade di malattie respiratorie. Modelli di malattia surrogate sono spesso in grado di ricapitolare tutti gli aspetti di una malattia modellato, in genere a causa di importanti fisiologica o differenze immunitarie nei due modelli di accoglienza. Pertanto, l'obiettivo di migliorare i sistemi di modello è quello di sviluppare approcci che consentono surrogati a specchio più da vicino un processo patologico o ospitano risposta come osservato nel sistema host originale. Ci sono parecchie differenze fisiologiche fondamentali tra i topi e gli esseri umani nel meccanismo con cui si ispirano l'aria. Inclusi in queste differenze sono significative differenze raziometriche di dimensioni tra vie aeree superiori e LRT. È stato stimato che i topi possiedono> 100 volte la superficie URT rispetto agli esseri umani, normalizzati contro totale ^1,2 capacità polmonare. Così, turbinati nasali del mouse consentono più ampio filtraggio dell'aria inspirata per facilitare una maggiore velocità di breathing, che può avere un impatto significativo sugli studi di polmonite se l'infezione della cavità nasale svolge un ruolo significativo nella progressione della malattia.

Diversi approcci sono stati impiegati per infondere batteri nei polmoni di topi per studiare le malattie respiratorie simile a quella umana. Il più comune di questi approcci è inoculazione intranasale, in cui una sospensione liquida viene applicato in una o entrambe le narici di un mouse. Mentre relativamente semplice, avvertimenti come volume instillazione e tipo di anestesia utilizzati possono influenzare l'efficienza della instillazione nel LRT via intranasale inoculazione ^3-5. In particolare, Miller et al. hanno dimostrato che l'instillazione intranasale di Francisella tularensis in volumi meno di 50 ml non hanno comportato l'instillazione dei batteri nel LRT ^6. Essi hanno inoltre osservato meglio LRT instillazione quando si usa isoflurano per via inalatoria rispetto a iniettato ketamina / xylazina per l'anestesia. Tuttavia, la nostra esperienze con Yersinia pestis inoculazione intranasale indica inoculazione più coerente può essere raggiunto utilizzando ketamina / xylazina rispetto a isoflurano (MBL, dati non pubblicati). Queste differenze potrebbero essere attribuite a patogeno usata o variabilità nella procedure di laboratorio, ma soprattutto evidenziare il potenziale di variabilità in questa tecnica. Inoltre, polmoni raccolte poco dopo instillazione intranasale mostrano che una percentuale relativamente bassa dell'inoculo batterico iniziale raggiunge il polmone (nel caso di Y. pestis, solo il 10% sono stati recuperati 1 ora dopo l'instillazione ^7), suggerendo che un gran numero di batteri potrebbe essere mantenuta nel URT (o ingerito nel tratto GI). In alcuni modelli di malattia, questo significativo deposito di batteri sulla mucosa URT può confondere la nostra comprensione della progressione della malattia se l'organismo è in grado di colonizzare la cavità nasale murino in modo incompatibile con la malattia umana. Per esempio, usando in vivo </ Em> di imaging, è stato osservato che Burkholderia pseudomallei, che non colonizzano l'URT umana, provoca un'infezione opportunistica schiacciante della cavità nasale murino al momento della consegna con il metodo instillazione intranasale ^8.

Altri metodi per instillare i batteri nei polmoni di topi sono stati impiegati nella ricerca sulle malattie infettive. Tuttavia, rispetto al instillazione intranasale questi metodi tendono a richiedere maggiore competenza tecnica e / o costose attrezzature senza eliminare il rischio di infezione da iniziazione in più siti (ad esempio, aerosol [URT e LRT]; transoral [tubo digerente e LRT], e intratracheale chirurgica [LRT e sangue]). Date le complicazioni potenziali che potrebbero essere associati con i siti secondari di infezione, abbiamo cercato di sviluppare un approccio endotracheale che bypassa vie aeree superiori e fornisce patogeno direttamente nei polmoni di topi anestetizzati, ma limita anche inoculat accidentaleione nel flusso sanguigno o del tratto gastrointestinale. A tal fine, l'intubazione endotracheale-mediata (IMIT) instillazione è stato sviluppato come una procedura non chirurgica che garantisce LRT instillazione di inoculo, includendo una fase intermedia per verificare il corretto posizionamento del catetere prima della instillazione. Questo metodo viene descritto usando colorante instillazione di dimostrare visivamente ampia distribuzione dell'inoculo nel polmone, e P. aeruginosa instillazione per dimostrare la consegna altamente efficace (> 98% dell'inoculo) di questo metodo per il polmone. È importante sottolineare che, mentre originariamente sviluppato per la consegna batterica, IMIT offre anche un efficace strumento per: i) instillazione di varie molecole per lo studio di altri modelli di malattie respiratorie, ii) la consegna terapeutiche particolari-polmone, e iii) studi di funzionalità polmonare di base, tra cui mirate consegna di siRNA al polmone.

Protocollo

NOTA: Tutte le procedure qui descritte sono stati esaminati e approvati dalla University of Louisville Istituzionale Comitato Biosicurezza (protocollo # 13-056) e Institutional Animal Care and Use Committee (protocollo # 13-064).

1. Preparazione del colorante

1. Diluire 0,1% (w / v) Coomassie Brilliant Blue in PBS e sterilizzare filtro con un filtro a siringa da 0,45 micron.

2. Preparazione di Pseudomonas aeruginosa cultura

1. 15 ore prima instillazione, inoculare 3 ml di brodocoltura con una singola colonia batterica.
2. Crescere la coltura 15 ore a 37 ° C su un agitatore (200 rpm).
3. Centrifuga 1 ml di coltura in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml 12.000 xg per 30 sec.
4. Rimuovere il mezzo e risospendere il pellet in 1 ml di PBS.
5. Diluire un'aliquota del magazzino sospensione batterica 1:10 in PBS e misurare il diametro esterno ₆₀₀ della sospensione batterica diluita per determinare lala concentrazione batterica.
6. Diluire la sospensione batterica magazzino in PBS alla concentrazione desiderata di inoculo batterico, utilizzando un volume di consegna di 50 microlitri per IMIT inoculazione.

3. IMIT instillazione

1. Inserire un gruppo di topi in isoflurano camera di induzione di anestesia e anestetizzare con un 2 - miscela di isoflurano / ossigeno 3%.
2. All'inizio iniziale di sedazione, collottola il mouse, tenendo premuto il mouse verticale, e somministrare 10 ml di una soluzione di lidocaina 2% mediante sonda gastrica dell'ago alla parte posteriore della gola e consentire alla soluzione di scendere verso l'epiglottide. Ritorna il mouse alla camera di anestesia.
   1. Lasciare almeno 5 minuti per consentire la lidocaina prendere pieno effetto come anestetico locale.
3. Quando i topi hanno raggiunto il livello desiderato di sedazione (tasso di ~ 60 bpm respirazione), ridurre la isoflurano al 2% per mantenere la sedazione.
4. Precarico tintura o inoculo batterico in 250 ml a tenuta di gasprecisione siringa in forma con un lungo ago smussato 22 G.
   1. Prima elaborare 150 microlitri di aria, misurati mediante lo stantuffo della siringa teflon. Successivamente, elabora 50 ml di inoculo facendo avanzare lo stantuffo Teflon dal marchio 150 microlitri al segno 200 microlitri sul corpo siringa.
      NOTA: Quando il campione viene espulso in un mouse intubato, la sospensione 50 microlitri sarà trasportato primo, seguito da un cuscino d'aria 150 microlitri che distribuirà l'inoculo nel polmone.
5. Rimuovere un mouse dalla camera di induzione e giaceva supino su una piattaforma intubazione. Fissare il mouse alla piattaforma agganciando i suoi incisivi con un O-ring attaccato al velcro strip, e fissare il velcro alla piattaforma. Sollevare il mouse per una pendenza di 45 °.
6. Usando un applicatore di cotone micro, ritrarre la lingua con un moto di rollio, con la mano dominante.
7. Con la mano non dominante, utilizzare una misura otoscopio operativo con una specula intubazione sia maintain la ritrattazione della lingua e visualizzare la glottide.
8. Con la mano dominante, utilizzare un filo guida filettato attraverso un catetere 20 G intubare il mouse, sedere il catetere ad una profondità da 10 mm nel trachea mouse (catetere è in forma di un manicotto in silicone con 10 mm di catetere esposta). Rimuovere l'otoscopio / specula.
9. Verificare che il mouse è stato intubato correttamente, garantendo il catetere con la mano non dominante, mentre per breve tempo il collegamento di un Luer lunghezza collegata di 1/16 "tubo trasparente contenente un colorante.
   NOTA: Il colorante viene rapidamente migrazione avanti e indietro in risposta alla respirazione.
10. Non procedere con i passi successivi, se la conferma di intubazione non è stata stabilita, a questo punto. Se l'intubazione tentata non è riuscita, ripristinare il filo del catetere e la guida per un ulteriore tentativo a intubazione.
    NOTA: È sconsigliabile tentare più di due intubazioni di un topo in una sessione senza causare traumi al mouse.
11. Continuare afissare il catetere con la mano non dominante, mentre l'inserimento della siringa di precisione / ago smussato contenente il cuscino di sospensione / aria liquida.
12. Erogare aria / liquido direttamente nei polmoni in un unico movimento fluido e rimuovere immediatamente l'ago / catetere dal mouse.
13. Ritorna il mouse in una gabbia e permettere il recupero dall'anestesia.

4. Caratterizzazione di IMT di consegna

1. Dopo IMIT instillazione, eutanasia il mouse da CO ₂ asfissia in un post-inoculazione momento opportuno.
2. Fissare il mouse eutanasia su una tavola di dissezione e godersi il torace e l'addome con il 70% EtOH usando una bottiglia a zampillo.
3. Se la valutazione della distribuzione di un agente di imaging nel polmone, rimuovere i polmoni dal animale con tecnica sterile e visualizzare i polmoni come appropriato per l'imaging.
   NOTA:. I polmoni possono essere preparate per ulteriori tecniche di colorazione istologiche mediante fissazione o crioconservazione del caso
4. Se la valutazione della carica batterica del tessuto polmonare infetto, togliere i polmoni dall'animale con tecnica sterile. Luogo polmoni in una sterile, pre-pesate 1 sacchetto di campionamento oz. Pesare e registrare il peso del sacchetto di campionamento + polmoni.
   1. Aggiungere 1 ml di PBS sterile, 1x per ogni sacchetto di campionamento + tessuti. Richiudere sacchetto di campionamento.
   2. Omogeneizzare i tessuti da dolce a rotazione un 25 ml pipetta sierologica nel sacchetto di campionamento + tessuto.
   3. Generare diluizioni seriali del polmone omogenato in PBS sterile e piastra su piastra di agar (LB, o se del caso alla specie batteriche in fase di studio):
      1. Condurre una diluizione in serie di sei volte in un U-basso a 96 pozzetti da pipettatore multicanale allora piastra campioni in triplicato dal multicanale sulla piastra di agar.
   4. Incubare le piastre di agar per una notte a 37 ° C ed enumerare le unità formanti colonie il giorno successivo.

Risultati

Per visualizzare la distribuzione di materiale instillato attraverso il metodo IMIT, 50 ml di 0,1% Coomassie Brilliant Blue tintura è stato instillato nei polmoni di un topo anestetizzato. Il mouse è stato immediatamente eutanasia ei polmoni sono stati rimossi dalla necroscopia sterile. La figura 1 mostra che il colorante è stato consegnato a tutti i lobi del polmone.

Per determinare la quantità di batteri consegnato ai polmoni tramite il metodo IMIT, tre gruppi di topi (n = 3) sono stati instillato con tre differenti concentrazioni di P. aeruginosa (1.21 x 10 ^8, 1.21x10 ^7, e 1,21 x 10 ⁶ unità formanti colonie [CFU] per 50 microlitri). Subito dopo IMIT instillazione, i topi sono stati sacrificati, polmoni rimossi e numeri batteriche sono state enumerate e confrontate con i inoculums (Figura 2). Consegna dell'inoculo è molto efficace tramite questo metodo, con> 98% dell'inoculo recuperato dai polmoni di instillatoanimali. Inoltre, IMIT instillazione era altamente riproducibile indipendentemente dalla concentrazione di inoculo (R ² = 0,9951).

Figura 1: IMIT instillazione distribuisce inoculo nel corso dei polmoni polmoni di topi instillato con 50 ml di 0,1% Coomassie Brilliant Blue spettacolo colorante blu distribuite in tutti i lobi..

Figura 2:. IMIT instillazione di batteri nei polmoni topi sono stati instillato con P. aeruginosa e il numero di batteri instillati nei polmoni (Log ₁₀ CFU - recuperata) sono stati confrontati con l'inoculo stimato (Log ₁₀ CFU - distribuito). Ogni cerchio rappresenta la UFC / polmone di un mouse individuale (n = 3 per ogniDose batterica).

Discussione

IMIT instillazione offre miglioramenti chiave per modelli di malattie respiratorie già esistenti nella capacità di infondere riproducibile reagenti direttamente nei polmoni. Si tratta di un approccio veloce che si trova in posizione ideale per una squadra di due ricercatori, uno dei quali gestisce la logistica di anestesia e ingabbiamento, e l'altro che esegue la tecnica IMIT. I grandi studi possono essere condotti utilizzando IMIT con un impegno medio di tempo di 2 - 3 minuti per mouse. Poiché l'approccio fa uso di isoflurano come anestetico, topi recuperare rapidamente dall'anestesia, riducendo il tempo di allevamento di animali controllo attraverso il recupero.

L'aspetto più tecnicamente impegnativo del metodo IMIT è il passo iniziale di intubazione topi. Gli individui che imparano a svolgere IMIT sono in grado di concentrarsi su questo primo passo di posizionamento del catetere e la garanzia che l'intubazione è stato raggiunto attraverso la conferma visiva di movimento tintura. Il vantaggio di questo approccio è che il polmone-specific instillazione è garantita attraverso l'uso della conferma di intubazione, che aumenta la fiducia sia del nuovo ricercatore nonché l'esperto tentativo di intubazione un animale difficile. Gli elementi chiave per ottimizzare la probabilità di una intubazione di successo sono: i) il raggiungimento di un sedazione profonda per dare il tempo di lavoro sufficienti, ii) il corretto posizionamento del specula in bocca per permettere una buona visualizzazione della epiglottide, iii) l'inserimento di una buona profondità del specula in modo che la linguetta rimane retratto durante tutta la procedura, e iv) utilizzo della piattaforma di ribaltamento per supportare mani del ricercatore in modo che la procedura è condotta rilassata e con un comportamento costante.

Uno dei limiti della procedura IMIT è legato alla frequenza degli eventi IMIT instillazione. A causa del trauma potenziali associati con intubazione perso, non è consigliabile che più di due tentativi di intubazione essere condotti in una singola sessione (fino a due miss). IMITha un ottimo potenziale nella sua capacità di essere utilizzato per fornire terapie nel polmone murino, i regimi terapeutici ma che si avvalgono di consegna molto frequente di reagente nei polmoni non possono essere adatti per IMIT. Può essere possibile che IMIT potrebbe essere utilizzato quotidianamente per fornire reagenti in un polmone murino senza causare traumi significativi, ma solo se condotta da un ricercatore altamente qualificato, come la maggior parte dei traumi associati con intubazione è pensato per essere associato ad un evento intubazione perdere . Tale IMIT ad alta frequenza dovrebbe essere discusso con i veterinari locali e IACUC.

Un potenziale limite ulteriore IMIT è la dimensione del mouse che viene intubato. La procedura IMIT sopra descritta è stata sviluppata usando topi di circa 17-22 g, dove è stato trovato un catetere 20 G per essere un formato adatto per la trachea di topi in questo intervallo di grandezza. Cateteri più grandi sono stati utilizzati con successo nei topi anziani; lo sviluppo iniziale di IMIT muso facciata di un catetere 18 G topi BALB / c che sono> 20 g. È importante sottolineare che, se si utilizzano i formati alternativi cateteri, aghi smussati devono essere di provenienza che si adattano il lume del catetere e sono tagliati ad una lunghezza che si estende appena 1 millimetro al di là della punta del catetere. Intubazione di topi di dimensioni inferiori a 17 g può essere possibile, ma non è raccomandato a causa della esperienza richiesta, e richiederebbe l'uso di cateteri più piccoli e specula che sono descritti in precedenza.

Abbiamo usato IMIT per la consegna di diversi patogeni respiratori oltre a P. aeruginosa, compresi B. pseudomallei ⁹ e Klebsiella pneumoniae ^10. Il modello IMIT ha conseguito notevoli progressi per i nostri studi di B. malattie respiratorie pseudomallei, dopo aver individuato che l'inoculazione intranasale provoca un precoce, morbilità URT-correlata di topi piuttosto che l'endpoint malattia sistemica osservata nella malattia umana ^9. B. pseudomallei è un Tier 1 Selecagente t di impatto biodefense, e come si stanno sviluppando tali, modelli di malattie respiratorie per l'esposizione di aerosol che modelli un biodefense correlato potenziale via di ingresso per patogeni come arma. Dato che i modelli attuali aerosol provocano l'infezione sia della URT e LRT, gli stessi potenziali fenotipi presto morbilità abbiamo individuato per il modello intranasale di B. malattie respiratorie pseudomallei può applicare al modello di aerosol. Un futuro adattamento del modello IMIT potrebbe essere una consegna di aerosol intubazione-mediata (IMAD), in cui i topi sono intubato per la consegna porta aerosol solo nel polmone. Ventilatori meccanici sono attualmente disponibili per mantenere l'anestesia isoflurano, che potrebbe essere adattato per fornire una, piuttosto che a base liquida, sfida patogeno aerosol.

IMIT stato sviluppato inizialmente come un approccio per ottimizzare l'erogazione dei batteri al polmone, ma ha anche un'applicazione per la consegna di altri reagenti nel polmone del mouse. Come disdiscussi sopra, consegna intranasale di composti in topi determina una bassa efficienza, consegna altamente variabile dei reagenti nell'organo bersaglio del polmone. Consegna intranasale di Positron Emission Tomography (PET) reagenti di imaging al polmone murino ha prodotto un rendimento di consegna del 40% ^11, mentre abbiamo dimostrato che IMIT offre un'ottima alternativa per l'altra consegna del polmone si avvicina con il suo> 98% di efficacia consegna e la distribuzione multilobare. Questo miglioramento somministrazione mirata al polmone ha il potenziale per aumentare la riproducibilità di consegna terapeutico per il trattamento della malattia polmonare. IMIT simile potrebbe offrire vantaggi agli studi di: i) l'impatto delle sostanze irritanti polmonari ambientali, ii), del cancro del polmone studi fenotipici, iii) specifici siRNA-polmone knock-down.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Roditore, Cavalletto da lavoro	inclinabile Hallowell EMC	000A3467	La base deve essere staccata quando si lavora in un BSC
Otoscopio operativo Testa	Welch Allyn	21700
Otoscopio 3,5 V Li Batteria	Welch Allyn	71900
Intubazione del topo Speculum corto, Autoclavabile	Hallowell EMC	200A3589S
Anse incisive	Hallowell EMC	210A3490A
Applicatore a punta fine in cotone	Puritan	871-PC DBL	Utilizzato per la retrazione della lingua
Catetere per flebo, 20 G	Exel Int	26741	Opzionale: montare un manicotto in silicone con superficie del catetere esposta da 10 mm
Siringa a tenuta di gas, 250 ul	Hamilton	81120	Utilizzato per l'erogazione di inoculo liquido mediante
ago smussato IMIT, 22 G	Hamilton	91022	Taglio a misura per sporgere di 1 mm dal catetere da 20 G
Filo guida (filo in fibra ottica, 0,5 mm)	TheFiberOpticStore.com	FOF .50	Taglio a 6 "di lunghezza: utilizzato come filo guida per l'intubazione
Siringa Tuberculin, 1 ml	Becton Dickinson	309659	Assemblare con filo in fibra ottica come filo guida
Brilliant Blue R (Coomassie)	Sigma	B0149
Tygon tubo, 1/16"	Saint Gobain	ALC00002
Luer maschio 1/16" barb	Cole Parmer	45503-22
Luer femmina 1/16" barb	Cole Parmer	45500-00
Lidocaina, USP	Spectrum	LI102	pH lidocaina in soluzione al 2% (p/v) pH7.0
Sacchetto per campioni, 1 oz	Whirl-Pak	B01067
Piastra a 96 pozzetti con fondo a U,		Greiner sterile 650161