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Articolo metodologico

Rilevazione di True IgE-esprimono mouse B Cells Lineage

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DOI:

10.3791/52264

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1 dicembre 2014

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Division of Rheumatology, Immunology and Allergy, Brigham and Women's Hospital and Harvard Medical School

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

L'analisi in vitro della ricombinazione del cambio di classe nei topi è impegnativa a causa delle molecole IgE citofile legate ai recettori Fc sulla superficie delle cellule B. Descriviamo un metodo per la rilevazione delle IgE utilizzando la scissione mediata dalla tripsina delle IgE legate alla superficie prima della fissazione e della permeabilizzazione per la colorazione a fluorescenza citoplasmatica.

Abstract

B linfociti immunoglobuline catena pesante (IgH) ricombinazione switch di classe (CSR) è un processo in cui inizialmente espresso IgM passa ad altri isotipi IgH, come IgA, IgE e IgG. Misurazione di IgH CSR in vitro è un metodo fondamentale per lo studio di un certo numero di processi biologici che vanno dalla ricombinazione e riparazione del DNA agli aspetti della immunologia molecolare e cellulare. Test in vitro CSR coinvolge citofluorimetrica superficie di misurazione espressione Ig sulle cellule B attivate. Mentre la misurazione di IgA e IgG sottoclassi è semplice, misurazione delle IgE con questo metodo è problematico a causa IgE solubile legame FcεRII / CD23 espresso sulla superficie delle cellule B attivate. Qui si descrive una procedura unica per la misurazione accurata delle IgE-produzione di cellule del mouse B che hanno subito la RSI nella cultura. Il metodo si basa sulla tripsina-mediata scissione di complessi IgE-CD23 sulla superficie delle cellule, consente il rilevamento di IgE-cellule produttrici B lineage da cycolorazione toplasmic. Questa procedura offre una soluzione conveniente per l'analisi di citometria di flusso della RSI a IgE.

Introduzione

Durante immunoglobuline catena pesante (IgH) ricombinazione switch di classe (CSR) in topi e nell'uomo, il IgH μ esoni regione costanti (Cu) vengono cancellati e sostituiti da uno dei diversi gruppi di downstream esoni regione costanti (C H s) (es Cγ, Cε e Cα), risultando in un interruttore dalla produzione di IgM alla produzione di altre classi di Ig (ad esempio IgG, IgE, o IgA). CSR avviene entro interruttore (S) le regioni, che sono 1-10 sequenze kb situati 5 'per ogni set di C H 1 s. L'attivazione indotta citidina deaminasi (AID) enzima avvia CSR attraverso l'attività citidina deamination.

IgE è un mediatore chiave della malattia allergica 2 e una maggiore comprensione di come IgE è prodotto e regolato può aprire le porte a nuovi approcci terapeutici per la malattia atopica. In topi e nell'uomo, IgE è isotipo Ig più strettamente regolata. IgE è normalmente rilevato livelli migliaia di times meno di altri IgH isotipi 3, ma possono essere molto elevati negli stati di malattia 4. Tuttavia, la RSI per IgE non è completamente comprensibile. In vitro attivazione delle cellule B con IL-4 in combinazione con anti-CD40 o LPS, induce la RSI sia IgG1 e IgE 5. Cellule B attivate esprimono il recettore a bassa affinità IgE FcεRII / CD23 2,6, che lega IgE solubile secreta nella cultura dopo CSR. Perciò quando si analizzano con citometria a flusso, le cellule B con il recettore legato IgE macchia simile a B cellule che esprimono endogenamente IgE 7. Mentre è noto che il mouse B cellule esprimono il recettore a bassa affinità IgG FcγRIIB1 (CD32) 8, nella nostra esperienza non sembra interferire con la misura di commutazione classe IgG1. Tuttavia, quando si misura IgE commutazione dopo l'attivazione delle cellule B nella cultura, non specifica di superficie legato IgE può oscurare l'analisi. Con i metodi di colorazione comuni, le cellule non-IgE-esprimono macchia positivo per IgE.

Delineato qui è una strategia che è stata utilizzata per condurre test di CSR e rilevare vere cellule-IgE esprimono B da topi 9-11. Il trattamento delle cellule B attivate con tripsina, un reagente di laboratorio comune a digerire le proteine, rimuove sia cytophylic e la membrana superficiale legata IgE. Permeabilizzazione successiva e colorazione per citoplasmatica IgE rivela così le vere cellule-IgE che producono.

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Protocollo

NOTA: Tutti gli esperimenti descritti erano in conformità con le Istituzionale Cura e uso Comitato Animal (IACUC) le linee guida e approvato dal Hospital Children Research animali (ARCH), Boston, Mass.

1. Preparazione dei reagenti

  1. 1,000x IL-4 Stock: Diluire citochina IL-4 a 20 pg / ml in H 2 O o 0,1% di siero albumina bovina (BSA). Distribuire in 200 aliquote microlitri provette da 1,5 ml microcentrifuga e conservare a -20 ° C.
  2. 1,000x anti-CD40: ottenere dal produttore a 1,0 mg / ml, conservare a 4 ° C.
  3. B stimolazione cellulare multimediale: per 425 ml di terreno RPMI-1640, aggiungere 75 ml di siero di vitello fetale appena scongelati (FCS), 10 ml di 1,0 M tampone HEPES, 5 ml di L-glutammina magazzino, 5 ml penicillina: streptomicina magazzino, 5 ml essenziali media non essenziali Aminoacidi microlitri minimi (MEM-NEAA), e 3,5 di 2-mercaptoetanolo. Tenere i supporti a 4 ° C per un massimo di una settimana. Aggiungere IL-4 (20 ng / ml) e anti-CD40 (1,0 mcg / ml) immediatamente prima dell'usosolo il volume di supporti necessari.
  4. 2% FCS-FACS Buffer: Aggiungi 10 ml di FCS a 490 ml di 1x PBS. Conservare a 4 ° C.
  5. 2x soluzione tripsina-EDTA: Diluire 5 ml di soluzione di 10x tripsina-EDTA magazzino (5,0 g tripsina, EDTA 2,0 g per litro) in 20 ml di PBS 1x. Conservare tripsina-EDTA in 2x aliquote di lavoro a 4 ° C. Lasciar riscaldare a temperatura ambiente prima dell'uso.
  6. Siero fetale di vitello: Mantenere FCS scongelati a 4 ° C per un massimo di due settimane. Mettere in ghiaccio 15 minuti prima che la procedura di colorazione citoplasmatica.
  7. Neutral-buffered formalina: Preparare una soluzione di formalina al 10% (3,7% paraformaldeide). Formalina è tossica e quindi gestirlo sotto una cappa di laboratorio mentre indossa appropriate DPI. Conservare formalina a temperatura ambiente in un armadietto di immagazzinaggio chimico.
  8. Metanolo: Conservare metanolo assoluto (100%) a -20 ° C finché le cellule sono pronte per essere permeabilizzate. Si noti che il metanolo è infiammabile e deve essere conservato in un freezer adeguato.

2.Purificazione e attivazione delle cellule B

  1. Da una milza del mouse appena raccolte, preparare una sospensione di cellule singole premendo delicatamente l'organo attraverso un colino cella di 70 micron con lo stantuffo di una siringa da 3 ml. In una provetta da centrifuga da 15 ml conica, raccogliere le cellule in 10 ml di PBS 1x e centrifugare a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C.
  2. Decantare il surnatante e risospendere pellet in 1 ml di globuli rossi Lysing Buffer per 5 min. Neutralizzare con 13,5 ml di 1x PBS e centrifugare a 300 xg per 5 min.
  3. (Opzionale) magneticamente separare le cellule B e che utilizzano anti-CD45R (B220) -labeled perline, seguendo il protocollo di purificazione MACS secondo le istruzioni del produttore.
  4. Stimolare le cellule B purificate a 1,0 x 10 6 cellule / ml in scaldato mezzi stimolazione delle cellule B contenente IL-4 (20 ng / ml) e anti-CD40 (1,0 mcg / ml) per 5 giorni a 37 ° C. Iniziare con 8 ml di coltura divisi in 2 pozzetti di una piastra di coltura da 6 pozzetti (4 ml).
  5. Controllare culturi giornaliero di mantenere a 1,0 x 10 6 cellule / ml. Regolare la concentrazione suddividendo in altri pozzi e diluendo la cultura dei media con la stimolazione delle cellule B contenente IL-4 freschi e anti-CD40.

3. tripsinizzazione, Fissazione e permeabilizzazione

  1. Tripsinizzazione
    1. Raccogliere fino a 1.0 x 10 7 cellule coltivate in una provetta conica da 15 ml, centrifugare a 300 xg per 5 min, e decantare il surnatante.
    2. Lavare con 10 ml di PBS per rimuovere la proteina residua dal supporto di raccolta delle cellule. Ripetere la fase di centrifugazione e decantare il surnatante.
    3. Risospendere il pellet di cellule nel volume residuo dopo decantazione (circa 100 ml).
    4. Aggiungere con cautela 800 ml di temperatura ambiente 0,1% (2x) tripsina-EDTA alle cellule. Versare lentamente con un angolo di 45 ° lungo la parete del tubo conico.
    5. Chiudere la provetta e miscelare delicatamente inclinando il tubo in modo che il liquido corre lungo la lunghezza del tubo di tempo 5-6s. A filante, precipitato bianco potrebbe formarsi nella soluzione. Limitare il tempo tripsinizzazione di sotto di un min.
    6. Placare la reazione tripsinizzazione con 1 ml di FCS freddo. Diluire il FCS immediatamente aggiungendo 10 ml di PBS freddo.
    7. Centrifugare a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C, poi decantare il supernatante e restituire i tubi in ghiaccio.
  2. Fissazione
    1. Risospendere le cellule nel volume residuo dopo decantazione. Se necessario, portare il volume fino a 100 ml con PBS freddo.
    2. In una cappa aspirante, aggiungere 800 ml di soluzione di formalina tamponata neutra al 10% per le cellule e pipettare su e giù. Il tubo scalderà seguito all'aggiunta di formalina. Incubare a 37 ° C per 10 min.
  3. Permeabilization
    1. Impostare un mixer da banco vortex ad una velocità di agitazione delicata.
    2. Disegna 9 ml di freddo (-20 ° C), metanolo in un 10 ml pipetta sierologica.
    3. Tenere la provetta contenente le cellule sopra il vortex e iniziare dolcemente shaking cellule.
    4. Aggiungere metanolo freddo al tubo in modo cade a gocce sulle cellule mentre il tubo è ancora scuotendo modo che il metanolo è continuamente miscelazione. Dopo i primi 2 ml di metanolo la velocità di erogazione può essere aumentata a un flusso lento.
    5. Lasciate che il tubo di sedersi sul ghiaccio per 30 minuti per completare la permeabilizzazione. In alternativa, le cellule possono essere conservati a -20 ° C per un mese.

4. fluorescenza colorazione per IgG1 e IgE di conversione

  1. Campione Centrifugare a 300 xg per 5 minuti e decantare la soluzione di metanolo. Un precipitato bianco può sedimentare le cellule.
  2. Aggiungere 10 ml di temperatura ambiente 1x PBS e centrifugare a 300 xg per 5 minuti per lavare le cellule. Ripetere una volta. Nota: Lavare il pellet con temperatura ambiente PBS dissolve precipitato in più che può formare dopo la fase 4.1.
  3. Eseguire un lavaggio supplementare con 10 ml di 2% FCS-tampone FACS.
  4. Distribuire campioni ad un 96-ben piatto rotondo fondoe centrifugare a 300 xg per 5 min. Decantare il surnatante e mettere il piatto su ghiaccio.
  5. Stain in 60 ml di 2% di buffer FCS-FACS per bene con le seguenti diluizioni degli anticorpi: anti-IgM RPE / Cy7, 1: 200, anti-IgG1 PE, 1: 600, anti-IgE FITC, 1: 100, Anti- CD45R (B220) PerCP-Cy5.5, 1: 200
  6. Dopo 5 min di colorazione, lavare la piastra con 150 ml di 2% FCS-tampone FACS e centrifugare per 5 min a 300 x g.
  7. Risospendere in 400 ml di 2% di buffer FCS-FACS e pipetta attraverso una 40 micron colino cella nylon in 5 ml FACS tubo.

5. Utilizzare la seguente strategia Gating:

  1. Isolare CD45R (B220) cellule positive da parte della popolazione brillamento linfociti situato sul / plot SSC FSC (Figura 1).
  2. Dalle cellule positive B220, utilizzare la trama IgE e IgG1 di rivelare le popolazioni corrispondenti.

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Risultati

Questa procedura è stata implementata con successo per studiare la RSI a IgE in cellule del mouse B. Per dimostrare l'efficienza di misura della RSI, abbiamo stimolato le cellule B della milza di topo con anti-CD40 e IL-4 come descritto in precedenza 11. Dopo cinque giorni di stimolazione, le cellule sono state raccolte ed elaborate utilizzando il protocollo sopra descritto e colorati con fluorescenza marcata IgM, IgG1, IgE, gli anticorpi e B220 (CD45R). Gated sui linfociti sabbiatura (figura 1),<...

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Discussione

La stimolazione di topo milza cellule B in coltura con anti-CD40 e IL-4 simulerà T helper di tipo 2 (T H 2) le interazioni, il passaggio di classe incoraggiante IgG1 e IgE 5. Cellule B possono essere attivate per la RSI nel contesto di splenociti totale 12 o come purificati cellule B della milza 11. Come indicato nel protocollo (passo 2.3), B arricchimento delle cellule è opzionale, ed è a discrezione dello sperimentatore per determinare se sarebbe vantaggioso. Positivo separa...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno divulgazioni.

Ringraziamenti

DRW è sostenuto da sovvenzioni NIH AI089972 e AI113217, e dalla mucosa Immunologia Studi della squadra, e in possesso di un Premio alla Carriera per medici scienziati del Wellcome Fondo Burroughs.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Anti-Topo IgE FITCBD Pharmingen553415clone R35-72
Rat Anti-Mouse IgG1 PEBD Pharmingen550083clone A85-1
MetanoloBDHBDH1135-4LPMantenere a -20 ° C
Filtro per celle Falcon 40 µ m NylonCorning352340
Filtro per celle Falcon 70 µ m NylonCorning352350
Anti-Hu/Mo CD45R(B220) PerCP-Cy5.5eBioscience45-4052-82clone RA3-6B2
anti-Mouse/Rat CD40eBioscience16-0402-85clone HM40-3
RPMI Medium 1640Gibco11875-093
HEPES (1M)Gibco15630-080
MEM-NEAA (100x)Gibco11140-050
Soluzione salina tamponata con fosfato (10x)Lifetechnologies (Corning)46-013-CM
MACS CD45R (B220) microsfere Miltenyi Biotec130-049-501
Colonna di purificazione MACSMiltenyi Biotec130-042-401
IL-4PeproTech214-14Ricostituire in acqua o soluzione di formalina BSA allo 0,1%,
tamponata neutra, 10%Sigma AldrichHT501128-4L
(10x)Sigma AldrichT4174-100 ml5,0 g di tripsina, 2,0 g di EDTA• 4 Na per litro di 0,9% NaCl
Penicillina-StreptomicinaSigma AldrichP0781-100 ml10.000 U Penicillina; 10 mg/ml Streptomicina (100x)
L-Glutammina 200 mMSigma AldrichG7513
2-mercaptoetanolo (99%)Sigma AldrichM6250-100 ml
Tampone per lisi dei globuli rossiSigma AldrichR7757
Rat Anti-Mouse IgM RPE/Cy7SouthernBiotech1140-17clone 1B4B1
HyClone Siero fetale di vitelloThermoSH30910.03
stimolazione delle cellule Bmezzi di stimolazione delle cellule B sono costituiti da RPMI con siero fetale di vitello (15%), 20 mM HEPES, 1x MEM-NEAA, 2,0 mM L-glutammina,  1x Penicillina-Streptomicina (Penicillina: 100 U/ml, Streptomicina: 100 &; g/ml), beta-mercaptoetanolo (7 & micro; L/L), IL-4 (20 ng/ml) e anti-CD40 (1 µ g/ml)
Soluzione di tripsina-EDTA Terreni di I

Riferimenti

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