L'analisi in vitro della ricombinazione del cambio di classe nei topi è impegnativa a causa delle molecole IgE citofile legate ai recettori Fc sulla superficie delle cellule B. Descriviamo un metodo per la rilevazione delle IgE utilizzando la scissione mediata dalla tripsina delle IgE legate alla superficie prima della fissazione e della permeabilizzazione per la colorazione a fluorescenza citoplasmatica.
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Articolo metodologico
Rilevazione di True IgE-esprimono mouse B Cells Lineage
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
B linfociti immunoglobuline catena pesante (IgH) ricombinazione switch di classe (CSR) è un processo in cui inizialmente espresso IgM passa ad altri isotipi IgH, come IgA, IgE e IgG. Misurazione di IgH CSR in vitro è un metodo fondamentale per lo studio di un certo numero di processi biologici che vanno dalla ricombinazione e riparazione del DNA agli aspetti della immunologia molecolare e cellulare. Test in vitro CSR coinvolge citofluorimetrica superficie di misurazione espressione Ig sulle cellule B attivate. Mentre la misurazione di IgA e IgG sottoclassi è semplice, misurazione delle IgE con questo metodo è problematico a causa IgE solubile legame FcεRII / CD23 espresso sulla superficie delle cellule B attivate. Qui si descrive una procedura unica per la misurazione accurata delle IgE-produzione di cellule del mouse B che hanno subito la RSI nella cultura. Il metodo si basa sulla tripsina-mediata scissione di complessi IgE-CD23 sulla superficie delle cellule, consente il rilevamento di IgE-cellule produttrici B lineage da cycolorazione toplasmic. Questa procedura offre una soluzione conveniente per l'analisi di citometria di flusso della RSI a IgE.
Introduzione
Durante immunoglobuline catena pesante (IgH) ricombinazione switch di classe (CSR) in topi e nell'uomo, il IgH μ esoni regione costanti (Cu) vengono cancellati e sostituiti da uno dei diversi gruppi di downstream esoni regione costanti (C H s) (es Cγ, Cε e Cα), risultando in un interruttore dalla produzione di IgM alla produzione di altre classi di Ig (ad esempio IgG, IgE, o IgA). CSR avviene entro interruttore (S) le regioni, che sono 1-10 sequenze kb situati 5 'per ogni set di C H 1 s. L'attivazione indotta citidina deaminasi (AID) enzima avvia CSR attraverso l'attività citidina deamination....
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Protocollo
NOTA: Tutti gli esperimenti descritti erano in conformità con le Istituzionale Cura e uso Comitato Animal (IACUC) le linee guida e approvato dal Hospital Children Research animali (ARCH), Boston, Mass.
1. Preparazione dei reagenti
- 1,000x IL-4 Stock: Diluire citochina IL-4 a 20 pg / ml in H 2 O o 0,1% di siero albumina bovina (BSA). Distribuire in 200 aliquote microlitri provette da 1,5 ml microcentrifuga e conservare a -20 ° C.
- 1,000x anti-CD40: ottenere dal produttore a 1,0 mg / ml, conservare a 4 ° C.
- B stimolazione cellulare multimediale: per 425 ml di terreno RPMI-1640, aggiungere 75 ml di siero di vitello fetale ....
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Risultati
Questa procedura è stata implementata con successo per studiare la RSI a IgE in cellule del mouse B. Per dimostrare l'efficienza di misura della RSI, abbiamo stimolato le cellule B della milza di topo con anti-CD40 e IL-4 come descritto in precedenza 11. Dopo cinque giorni di stimolazione, le cellule sono state raccolte ed elaborate utilizzando il protocollo sopra descritto e colorati con fluorescenza marcata IgM, IgG1, IgE, gli anticorpi e B220 (CD45R). Gated sui linfociti sabbiatura (figura 1),<.......
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Discussione
La stimolazione di topo milza cellule B in coltura con anti-CD40 e IL-4 simulerà T helper di tipo 2 (T H 2) le interazioni, il passaggio di classe incoraggiante IgG1 e IgE 5. Cellule B possono essere attivate per la RSI nel contesto di splenociti totale 12 o come purificati cellule B della milza 11. Come indicato nel protocollo (passo 2.3), B arricchimento delle cellule è opzionale, ed è a discrezione dello sperimentatore per determinare se sarebbe vantaggioso. Positivo separa.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno divulgazioni.
Ringraziamenti
DRW è sostenuto da sovvenzioni NIH AI089972 e AI113217, e dalla mucosa Immunologia Studi della squadra, e in possesso di un Premio alla Carriera per medici scienziati del Wellcome Fondo Burroughs.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Anti-Topo IgE FITC | BD Pharmingen | 553415 | clone R35-72 |
| Rat Anti-Mouse IgG1 PE | BD Pharmingen | 550083 | clone A85-1 |
| Metanolo | BDH | BDH1135-4LP | Mantenere a -20 ° C |
| Filtro per celle Falcon 40 µ m Nylon | Corning | 352340 | |
| Filtro per celle Falcon 70 µ m Nylon | Corning | 352350 | |
| Anti-Hu/Mo CD45R(B220) PerCP-Cy5.5 | eBioscience | 45-4052-82 | clone RA3-6B2 |
| anti-Mouse/Rat CD40 | eBioscience | 16-0402-85 | clone HM40-3 |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| MEM-NEAA (100x) | Gibco | 11140-050 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (10x) | Lifetechnologies (Corning) | 46-013-CM | |
| MACS CD45R (B220) microsfere | Miltenyi Biotec | 130-049-501 | |
| Colonna di purificazione MACS | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| IL-4 | PeproTech | 214-14 | Ricostituire in acqua o soluzione di formalina BSA allo 0,1%, |
| tamponata neutra, 10% | Sigma Aldrich | HT501128-4L | |
| (10x) | Sigma Aldrich | T4174-100 ml | 5,0 g di tripsina, 2,0 g di EDTA• 4 Na per litro di 0,9% NaCl |
| Penicillina-Streptomicina | Sigma Aldrich | P0781-100 ml | 10.000 U Penicillina; 10 mg/ml Streptomicina (100x) |
| L-Glutammina 200 mM | Sigma Aldrich | G7513 | |
| 2-mercaptoetanolo (99%) | Sigma Aldrich | M6250-100 ml | |
| Tampone per lisi dei globuli rossi | Sigma Aldrich | R7757 | |
| Rat Anti-Mouse IgM RPE/Cy7 | SouthernBiotech | 1140-17 | clone 1B4B1 |
| HyClone Siero fetale di vitello | Thermo | SH30910.03 | |
| stimolazione delle cellule B | mezzi di stimolazione delle cellule B sono costituiti da RPMI con siero fetale di vitello (15%), 20 mM HEPES, 1x MEM-NEAA, 2,0 mM L-glutammina, 1x Penicillina-Streptomicina (Penicillina: 100 U/ml, Streptomicina: 100 &; g/ml), beta-mercaptoetanolo (7 & micro; L/L), IL-4 (20 ng/ml) e anti-CD40 (1 µ g/ml) |
Riferimenti
- Chaudhuri, J., et al. Evolution of the immunoglobulin heavy chain class switch recombination mechanism. Advances in immunology. 94, 157-214 (2007).
- Gould, H. J., Sutton, B. J. IgE in allergy and asthma today. Nature reviews. Immunology. 8, 205....
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Ristampe e permessi
