I livelli di proteine nelle cellule e tessuti sono spesso strettamente regolati dal saldo della produzione di proteine e di liquidazione. Usando fluorescenza Decay Dopo Fotoconversione (FDAP), la cinetica di clearance di proteine possono essere sperimentalmente misurati in vivo.
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Articolo metodologico
Misurare Protein Stabilità in Living embrioni di zebrafish Usando fluorescenza Decay Dopo Fotoconversione (FDAP)
In questo articolo
Sommario
Abstract
Stabilità della proteina influenza molti aspetti della biologia, e misurando la cinetica di clearance di proteine in grado di fornire importanti informazioni nei sistemi biologici. In esperimenti FDAP, la clearance di proteine negli organismi viventi può essere misurata. Una proteina di interesse è etichettato con una proteina fluorescente fotoconvertibile, espresso in vivo e photoconverted, e la diminuzione del segnale di photoconverted nel tempo è monitorato. I dati vengono poi dotata di un modello di clearance appropriato per determinare la proteina emivita. È importante sottolineare che la cinetica di clearance delle popolazioni di proteine in diversi comparti dell'organismo possono essere esaminati separatamente applicando maschere compartimentali. Questo approccio è stato utilizzato per determinare l'emivita intra- ed extracellulari di proteine di segnalazione secrete durante lo sviluppo zebrafish. Qui, descriviamo un protocollo per la sperimentazione FDAP in embrioni di zebrafish. Dovrebbe essere possibile utilizzare FDAP per determinare la cinetica di liquidazioneogni proteina oggetto di tag in ogni organismo otticamente accessibile.
Introduzione
I livelli di proteine nelle cellule ed organismi sono determinati dalla loro tassi di produzione e passaggio. Protein dimezzamento possono variare da minuti a giorni 1-4. In molti sistemi biologici, la stabilizzazione o liquidazione di proteine chiave ha effetti importanti sulla attività cellulare. È necessaria modulazione di stabilità proteina intracellulare per la progressione del ciclo cellulare 5,6, segnalazione di sviluppo 7-9, apoptosi 10, e la funzione normale e la manutenzione dei neuroni 11,12. Stabilità della proteina extracellulare influenza la distribuzione e la disponibilità di proteine secrete....
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Protocollo
1. Creazione di un fotoconvertibile Fusion Costruire e Iniettare dechorionated embrioni di zebrafish
- Generare un costrutto funzionale contenente la proteina di interesse fusa ad una proteina fotoconvertibile verde a rosso (vedi Discussione), quindi utilizzare la trascrizione in vitro per generare capped mRNA codificante la proteina di fusione come nel Müller et al., 2012 19.
- Utilizzare pronasi per rimuovere le chorions da circa 30 embrioni di zebrafish allo stadio unicellulare. In alternativa, dechorionate manualmente embrioni usando pinze 28.
Nota: Gli embrioni devono essere dechori....
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Risultati
FDAP è stata utilizzata per determinare l'emivita di proteine di segnalazione extracellulari in embrioni di zebrafish 19. Una di queste proteine, Squint, induce l'espressione di geni mesendodermal durante l'embriogenesi 34. Strabismo-Dendra2 attiva l'espressione di geni mesendodermal a livelli simili a untagged Squint, come dimostrato da qRT-PCR e ibridazione in situ test 19. Gli embrioni sono stati co-iniettate con Alexa488 destrano e mRNA codifica Squint-Dend.......
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Discussione
Il successo di un esperimento FDAP si basa sulla generazione di una proteina di fusione fotoconvertibile funzionale. Tagging una proteina può compromettere la sua attività biologica e / o proprietà biofisiche, tra cui la sua localizzazione, solubilità, stabilità e 36-41. Siate pronti a testare l'attività di diversi costrutti di fusione diversi al fine di trovare uno che è attiva. Abbiamo trovato che la modifica della posizione della proteina fotoconvertibile relativa alla proteina di interesse o utilizzan.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare Jeffrey Farrell, James Gagnon, e Jennifer Bergmann per i commenti sul manoscritto. KWR è stato sostenuto dal National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program durante lo sviluppo del test FDAP. Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti del NIH di AFS e da finanziamenti della Fondazione tedesca per la ricerca (Emmy Noether Program), il Max Planck Society, e il Programma Umana Frontier Science (Career Development Award) per PM.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| PyFDAP (scaricabile dal seguente sito web: http://people.tuebingen.mpg.de/mueller-lab)Installare | e utilizzare utilizzando le istruzioni fornite sul sito web di PyFDAP; PyFDAP è compatibile con i sistemi operativi Linux, Mac e Windows. | ||
| mMessage Kit di trascrizione mMachine Sp6 | Life Technologies | AM1340 | Per generare mRNA incappucciato per iniezione negli embrioni |
| Alexa488-destrano coniugato, 3 kDa | Life Technologies | D34682 | Co-iniettare con mRNA per creare maschere intracellulari ed extracellulari |
| di plastica a 6 pozzetti | BD Falcon | Incubare gli embrioni in pozzetti rivestiti di agarosio fino al momento del montaggio | |
| Terreno embrionale | 250 mg/L di sale istantaneo dell'oceano, 1 mg/L di blu di metilene in acqua di osmosi inversa regolata a pH 7 con NaHCO3 | ||
| Proteasi da Streptomyces griseus | Sigma | P5147 | Preparare un brodo da 5 mg/ml e utilizzare a 1 mg/ml in embrioni di deteroionato allo stadio monocellulare |
| Petri in vetro di 5 cm di diametro | Per la decorionazione degli embrioni | ||
| vetro da 200 ml | Per la decorionazione degli embrioni Apparecchio | ||
| microiniezione | Per l'iniezione di mRNA e colorante negli embrioni allo stadio di una cellula | ||
| Stereomicroscopio | Per l'iniezione e il montaggio di | ||
| embrioni1x Media | Diluire l'agarosio a basso punto di fusione ed eseguire l'imaging in questo terreno; ricetta: soluzione filtrata 0,2 mm di 58 mM di NaCl, 0,7 mM di KCl, 0,4 mM di MgSO4, 0,3 mM di CaCl2, 5 mM HEPES pH 7.2 | ||
| UltraPure agarosio a basso punto di fusione | Invitrogen | 16520-100 | Per il montaggio di embrioni; utilizzare ad una concentrazione dell'1% nel terreno di Danieau: aggiungere 200 mg a 20 ml di terreno di Danieau, microonde fino a dissoluzione, quindi aliquotare 1 ml in provette per microcentrifuga; Le aliquote possono essere memorizzate a 4 gradi C, rifuso al 70 ° C e raffreddato a 40– 42 gradi C quando è pronta per l'uso |
| Pipetta in vetro Pasteur | Kimble Chase (via Fisher) | 63A53WT | Per il montaggio di embrioni; fiammare la punta per evitare che i bordi frastagliati danneggino gli embrioni |
| Sonda | Per posizionare gli embrioni durante il montaggio | ||
| Piastre con fondo in vetro | MatTek | P35G-1.5-14-C | Utilizzare lo spessore del vetro di copertura appropriato per l'obiettivo; il numero di parte qui elencato si riferisce al vetro di copertura n. 1.5 |
| Provetta da 15 ml riempita con ~5 ml di terreno embrionale | BD Falcon | Per il risciacquo dell'agarosio residuo dalla pipetta Pasteur | |
| Microscopio | Una lampada ad arco di mercurio, 488 sono necessari laser nm, laser a 543 nm e i set di filtri appropriati | ||
| Fase | Per mantenere gli embrioni alla temperatura ottimale di 28 ° C durante l'esperimento | ||
| Software confocale in grado di eseguire l'imaging | Deve essere in grado di definire più posizioni e di visualizzarle automaticamente a intervalli definiti | ||
| ad acqua 25X o 40X | Obiettivo per imaging | ||
| Obiettivo | Obiettivo per fotoconversione | ||
| Olio | Olio da immersione con lo stesso indice di rifrazione dell'acqua |
Riferimenti
- Schwanhäusser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
- Boisvert, F. M., et al. A Quantitative Spatial Proteomics Analysis of Proteome Turnover in Human Cells. Molecular & Ce....
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Ristampe e permessi
