Questo articolo fornisce un metodo per studiare la dinamica delle vescicole dei neurotrasmettitori nelle cellule di neuroblastoma, utilizzando un costrutto di sinaptobrevina2-pHluorin e la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale. Viene inoltre riportata la strategia sviluppata per l'elaborazione delle immagini e l'analisi dei dati.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
TIRFM e GFP-sonde pH-sensibile per valutare Neurotransmitter Vesicle Dynamics in cellule SH-SY5Y neuroblastoma: cell imaging e analisi dei dati
In questo articolo
Sommario
Abstract
Vescicole sinaptiche rilasciano neurotrasmettitori alla sinapsi chimiche attraverso un ciclo dinamico di fusione e di recupero. Monitoraggio attività sinaptica in tempo reale e sezionare le diverse fasi di eso-endocitosi a livello di singolo-vescicole sono fondamentali per la comprensione funzioni sinaptiche in salute e malattia.
Geneticamente codificato sonde pH-sensibili direttamente mirate a vescicole sinaptiche e Total Internal Reflection microscopia a fluorescenza (TIRFM) forniscono la risoluzione spazio-temporale necessario per seguire la dinamica delle vescicole. Il campo evanescente generato per riflessione interna totale può eccitare solo fluorofori collocati in uno strato sottile (<150 nm) sopra il coperchio di vetro su cui le cellule aderiscono, esattamente dove i processi di eso-endocitosi avvengono. Le immagini ad alto contrasto risultanti sono ideali per le vescicole monitoraggio e l'analisi quantitativa di eventi di fusione.
In questo protocollo, SH-SY5Y umano ncellule euroblastoma sono proposti come modello utile per studiare il rilascio dei neurotrasmettitori a livello singolo vescicole da TIRFM, a causa della loro superficie piana e la presenza di vescicole dispersi. Vengono forniti i metodi per la coltivazione SH-SY5Y come cellule aderenti e per loro trasfezione con Synapto-pHluorin, così come la tecnica per effettuare TIRFM e imaging. Infine, una strategia che mira a selezionare, contare e analizzare gli eventi di fusione a livello di cellule intere e single-vescicola è presentato.
Per convalidare l'approccio di analisi procedura di imaging e di dati, le dinamiche di vescicole pHluorin-tag vengono analizzati sotto il riposo e stimolati (depolarizzante concentrazioni di potassio) condizioni. Depolarizzazione della membrana aumenta la frequenza degli eventi di fusione e provoca un aumento parallelo del segnale di fluorescenza netto constatato cellula intera. Analisi singola vescicola rivela modifiche di comportamento fusion-evento (altezza maggiore di picco e larghezza). Questi dati suggeriscono tha depolarizzazione potassio induce non solo un massiccio rilascio di neurotrasmettitore, ma modifica anche il meccanismo di fusione della vescicola e riciclaggio.
Con la sonda fluorescente caso, questa tecnica può essere impiegata in sistemi cellulari diversi per sezionare i meccanismi di secrezione costitutiva e stimolata.
Introduzione
Trasmissione sinaptica chimica tra neuroni è un importante meccanismo di comunicazione nel sistema nervoso. Essa si basa sul rilascio di neurotrasmettitori attraverso un ciclo dinamico di fusione della vescicola e recupero nel sito presinaptico. Molte delle proteine coinvolte nella dinamica vescicole sono stati identificati; tuttavia, il loro contributo specifico al fenomeno resta da chiarire 1.
La nostra comprensione è in parte limitata dal fatto che i dosaggi più utilizzati per eso / endocitosi non sono sempre la più appropriata. Diversi studi relativi alla fusione delle vescicole e dinamiche si basano su tecniche elettrofi....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
1. Cella Cultura e Transfection
- Coltura cellulare SH-SY5Y
NOTA: Gli esperimenti sono stati condotti con il neuroblastoma umano SH SY5Y (ATCC # CRL-2266) 15. Cellule SH-SY5Y crescono come una miscela di ammassi galleggianti e cellule aderenti. Seguire le istruzioni riportate nel protocollo (densità cellulare, rapporto di scissione, ecc.) Per avere cellule che crescono saldamente attaccati alla copertura in vetro, che è cruciale per TIRFM.- Prima di iniziare, sotto l'armadio biosicurezza flusso laminare, rendere il volume opportuno di soluzione di fosfato sterile salina tampone (PBS) e terreno di coltur....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Le procedure TIRF imaging e analisi dei dati descritti sono stati concepiti per studiare vescicole dinamiche in sistemi cellulari. Questa tecnica può essere utilizzata per determinare gli effetti di molecole di segnalazione e farmaci sugli eventi di fusione e le dinamiche neurotrasmettitore vescicole 17. Utilizzando proteine di membrana plasmatica GFP-tagged, l'analisi TIRFM è stato impiegato per caratterizzare il traffico costitutiva di GFP-tagged trasportatori del glutammato in gliali e cellule epitel.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Questo articolo presenta un protocollo di immagine e analizzare vescicole dinamica in cellule secernenti, utilizzando vettori cDNA codificati fluorescenti e TIRFM. Gli elementi chiave del successo di imaging da TIRFM sono la selezione del modello di cellulare e trasfezione delle cellule con indicatori ottici geneticamente codificate di rilascio delle vescicole e riciclo.
TIRFM è ideale per le cellule in crescita aderenti a una copertura in vetro e sufficientemente piatto per permettere la vi.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare l'Università degli Studi di Milano per il sostegno a Eliana Di Cairano (borsa di studio post-dottorato) e Stefania Moretti (Ph.D. fellowship). Questo lavoro è stato sostenuto dal Programma di Ricerca dell'Università di PUR CP
Vorremmo ringraziare il Prof. Jeremy M. Henley, Facoltà di Biochimica, Università di Bristol, Regno Unito, per il pHluorin costruire e Dr. Francesco Dotti per l'assistenza nell'analisi dei dati, e di Silvia Marsicano per l'assistenza tecnica.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Attrezzatura | |||
| Axio Observer Z1 |  Zeiss | 491912-9850-000 | microscopio invertito |
| Multiline Argon Laser Lasos 77 | Lasos | 00000-1312-752 | laser a ioni di argon multilinea (458/488/514 nm), 100 mW |
| Laser TIRF slider | Zeiss | 423681-9901-000 | |
| Obiettivo 100X | Zeiss | 421190-9900-000 | Olio, NA 1.45 Alpha-Plan |
| CCD Camera RetigaSRV Fast 1394 | QImaging | ||
| Cambiamento ottico del filtro LAMBDA 10-3 con SmartShutter | Sutter Instrument Company | ||
| Software | |||
| Image ProPlus 6.3 Software | Media Cybernetics | selezione di punti, selezione di aree di interesse (ROI), determinazione dell'intensità di fluorescenza | |
| Excel | Microsoft | correzione del fotoblesamento, analisi dell'intera cellula e delle singole vescicole | |
| GraphPad Prism 4.00 | GraphPad Software, Inc. | analisi statistica |
Riferimenti
- Sudhof, T. C. The synaptic vesicle cycle. Annu. Rev. Neurosci. 27, 509-547 (1146).
- Denk, W., Svoboda, K. Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick. Neuron. 18 (3), 351-357 (1997).
- Helmchen, F., Svoboda, K., Denk, W., Tank, D. W.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
