Con questo studio, si introduce un modello di stress standardizzato per l'isolato retina superfused bovina per futuri test terapeutici preclinica. L'effetto di una ipossia (puro N 2) o di stress glutammato (250 uM glutammato) sulla funzione della retina rappresentato da a- e ampiezze b-onda è stata valutata.
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Articolo metodologico
Glutammato e ipossia come modello di stress per l'isolato perfuso vertebrati Retina
In questo articolo
Sommario
Abstract
Neuroprotezione è stato un forte campo di indagine nella ricerca oculistico negli ultimi decenni e colpisce malattie come il glaucoma, occlusione vascolare retinica, distacco della retina, e la retinopatia diabetica. E 'stato l'oggetto di questo studio di introdurre un modello di stress test standardizzato per il futuro terapeutico preclinica.
Retine bovini sono stati preparati e perfusi con una soluzione standard di ossigeno satura, e l'ERG è stato registrato. Dopo la registrazione di b-onde stabili, ipossia (puro N 2) o di stress glutammato (250 micron glutammato) è stata esercitata per 45 min. Per studiare gli effetti sulla funzione dei fotorecettori da solo, 1 aspartato mM è stato aggiunto per ottenere un-onde. ERG-recupero è stato monitorato per 75 min.
Per ipossia, una diminuzione in onda ampiezza del 87,0% è stato osservato (p <0.01) dopo un tempo di esposizione di 45 min (diminuzione del 36,5% dopo la fine del washout p = 0,03). Inoltre, un dim inizialefacilità di ampiezze b-onda di 87.23% è stato registrato, che ha raggiunto la significatività statistica (p <0.01, diminuzione del 25,5% alla fine del lavaggio, p = 0,03).
Per 250 micron glutammato, una prima riduzione di 7,8% ampiezze un onda (p> 0.05) seguita da una riduzione di 1,9% (p> 0.05). Una riduzione del 83,7% delle ampiezze b-onda (p <0,01) è stato osservato; dopo un lavaggio di 75 min la riduzione è stata del 2,3% (p = 0.62). In questo studio, un modello standardizzato di stress è presentato che può essere utile per identificare i possibili effetti neuroprotettivi in futuro.
Introduzione
Neuroprotezione è stato un forte campo di indagine nella ricerca oculistico negli ultimi decenni. La retina è una rete neuronale altamente sensibile che dipende sensibilmente l'ossigenazione ed è fortemente influenzato dal metabolismo delle sue cellule circostanti. Le principali patologie oculari legate a danni delle cellule nervose sono occlusioni vascolari retiniche, glaucoma e distacco della retina.
Occlusione dell'arteria retinica, come esempio per occlusione vascolare retinica, porta ad una improvvisa perdita della vista a causa di ipossia della retina interna 1. E 'spesso associata a patologie vascolari generali 2 e porta ad una perdita visiva permanente 1, con solo l'8% dei pazienti sottoposti acuità visiva significativamente 1. Sebbene fibrinolisi arteriosa è stato suggerito come opzione di trattamento, il beneficio non può essere mostrato in uno studio clinico randomizzato 3.
Glaucoma e distacco della retinaentrambi hanno un aumento della concentrazione di glutammato 4-6. Glutammato in condizioni fisiologiche è rilevato come un trasmettitore eccitatorio tutto il sistema nervoso centrale e della retina interna 7,8. Elevati livelli di glutammato sono stati trovati non solo in glaucoma e distacco della retina 5,6 ma anche in retinopatia diabetica proliferativa 9. Un aumento glutammato eventualmente porta alla eccitotossicità e, di conseguenza, il danno delle cellule nervose 10. Nella maggior parte dei casi di distacco della retina e in alcuni casi di chirurgia proliferative retinopatia diabetica sulla retina (pars plana vitrectomia) sono necessari. Durante pars plana vitrectomia manipolazione meccanica, luce brillante della fibra ottica o sollecitazione di taglio esercitata da elevate portate di soluzioni per l'irrigazione durante lunghi operazioni esercitare un ulteriore stress sulla retina 11,12.
Tutte le malattie di cui hanno in comune che la patologia è localizzato al Retinun solo e posa la comunità oftalmologico con la sfida di trovare il modo di proteggere la retina come un sistema neurosensoriale.
L'elettroretinogramma (ERG) è il metodo standard per la valutazione della funzione in vivo fotorecettore (a-onda) e la funzione della retina interna (b-onda). L'ERG è misurata con argento-elettrodi introdotti nella cornea e gli occhi sono stimolata da un crescente livello di luce per rilevare i difetti di barre o coni o nella retina interna. Diversi difetti nella retina possono essere rilevate da cambiamenti di ampiezza (la forza della risposta) o la latenza (la risposta-intervallo-to-) della ERG. Diverse ERG protocollo e metodi di misurazione (pattern-ERG, multifocale-ERG o campo chiaro ERG) permettono un'ulteriore differenziazione dei difetti. La tecnica della retina isolato è stato introdotto recentemente, consentendo di valutare gli effetti sulla retina senza interferenze da esempio un animale di studioreazioni generali 13,14.
E 'stato lo scopo di questo studio per valutare e introdurre un modello di stress definito e standardizzato per ipossia e lo stress glutammato sulla retina isolata superfused. Quindi, speriamo di gettare le basi per futuri studi sugli effetti neuroprotettivi di alcuni agenti o soluzioni di irrigazione intraoculari.
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Protocollo
1. Preparazione di occhi bovini
- Ottenere occhi bovini subito dopo la macellazione.
- Trasporto gli occhi protetti in "Sickel soluzione" un mezzo speciale contenente NaCl 120 mM, KCl 2 mM, 0,1 mM MgCl 2, 0,15 mM CaCl 2, 1.5 mM NaH 2 PO 4, 13,5 mM Na 2 HPO 4 e 5 mM di glucosio a RT.
- Eseguire la preparazione della retina in condizioni adatte scuri con una luce rossa fioca.
- Rimuovere la parte anteriore dell'occhio. Eseguire un'incisione ca. equatoriale 4 millimetri posteriormente al limbus. Successivamente rimuovere cornea, iride, corpo ciliare e obiettivo in un unico pezzo. Tenere le retine in Sickel-soluzione.
- Meccanicamente allentare i collegamenti vetrose alla superficie retinica e rimuovere il vitreo dalla tazza occhio aperto.
- Successivamente suddividere l'occhio in quattro quadranti e pugni fuori turno aree di ca. 7 mm con un trapano.
- Separare delicatamente la retinadal epitelio pigmentato e posizionarlo su un dispositivo di registrazione all'interno di una scatola al riparo dalla luce. Il dispositivo di registrazione è costituito da un manutentore plastica con una maglia nel mezzo; posizionare la retina sulla maglia e poi fissare con un anello di plastica direttamente sugli elettrodi.
NOTA: Il manutentore plastica ha due canali per permettere un flusso costante di fluido.
2. Registrazione del Elettroretinogramma (ERG)
- Per registrare l'elettroretinogramma, utilizzare due elettrodi di argento / cloruro di argento-su entrambi i lati della retina e profumato retina ad una velocità costante di perfusione ca. 1 ml / min e temperatura costante di 37 ° C. Utilizzare il "Sickel-soluzione" satura di ossigeno.
- Prima di avviare la misurazione, scuro adattare la retina (proteggerlo dalla luce durante tutte le misure) e utilizzare gli intervalli di stimolo di cinque minuti. Utilizzare un 1 Hz singolo flash allo xeno bianco per la stimolazione con un'intensità impostato 6.3 mlx sulla superficie della retina.
- Uso calibrato filtri di densità neutri e uno stimolo luce 10 usec controllato da un timer in modo da avere una risposta ottimale.
- Per misurare ed elaborare i dati, filtrare l'ERG e amplificarlo (100 Hz filtro passa alto, 50 filtro notch Hz, 100.000 x amplificazione) utilizzando un RPS312RM amplificatore Grass. Prova a filtrare le eventuali frequenze di disturbo che possono disturbare il segnale. Per elaborare i dati, utilizzare una scheda di acquisizione dati digitali da analogico a un computer desktop (PC compatibile).
- Dopo il periodo di adattamento al buio sotto perfusione costante misurare le ampiezze del segnale elettrico fino sono registrati ampiezze b-onda stabili.
NOTA: Le ampiezze sono considerate stabili se cinque misurazioni singole raggiungono un valore medio e discostano meno del 10%. Un buon esempio di singole misurazioni è riportata nella figura 1. - Per iniziare il test, sostituiscono l'ossigeno puro o azoto puro (numero di singoli esperimenti, n = 5) per verificare ipossiao 250 micron glutammato (n = 5).
- Registrare le risposte elettriche ogni 5 minuti per 45 min.
- Dopo il periodo di prova, profumato le retine con medie standard satura di ossigeno per 75 minuti e guardare i cambiamenti di ampiezza b-wave. Questa è la fase di washout. Misurare l'ampiezza dell'onda b dal trogolo di un onda al picco del b-onda.
- Per studiare l'effetto di ipossia o glutammato sulle potenzialità fotorecettori in condizioni scotopiche, sopprimere la b-wave con l'aggiunta di 1 mM di soluzione nutritiva.
- Dopo aver registrato un potenziale fotorecettore stabile per 30 min, eseguire la procedura come prima, esponendo le retine 45 min alle diverse soluzioni di irrigazione con 1 mM aspartato. Utilizzare lo stesso periodo di washout (passo 2,8), come accennato in precedenza.
Analisi 3. Dati
- Per valutare statisticamente i dati, garantire una distribuzione normale per tutti i dati, ad esempio utilizzando il Kolmogorov-SmirnovTest 15.
- Calcolare la riduzione delle a- e b-onda ampiezze in percentuale dopo la fase di esposizione rispetto all'ultima misura prima dell'esposizione. Confrontare la riduzione delle ERG-ampiezze dopo 45 min - al termine del periodo di esposizione - ERG misurata prima dell'applicazione.
- Confrontare l'onda a- e b- al termine della fase di washout all'ampiezza corrispondente prima dell'esposizione ad esaminare una possibile ripresa.
- Per l'analisi statistica, utilizzare il software statistico JMP software o software SPSS. Calcolare i dati tutto come media ± deviazione standard. Stimare significatività con il test statistico appropriato.
NOTA: Questi test potrebbero essere diverse a seconda del campo di applicazione sperimentale. In questa impostazione, utilizzare paired t-test di Student.
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Risultati
Dopo 1 ora di perfusione dei preparati della retina con una soluzione standard di ossigeno-saturi (Figure 1A e B) ERG-ampiezze mostravano stabilizzazione e meno variazione ampiezze tra singole misurazioni. pH, pressione osmotica, la temperatura, e pO 2 (tranne per il test ipossia) sono state mantenute costanti per tutte le prove.
Per isolare il segnale fotorecettore dal segnale della retina interna, 1 mM aspartato è stato aggiunto alla soluzione standard per sopprime...
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Discussione
In questo studio, è stato trovato un significativo rilievo l'ampiezza dell'onda b dopo 45 min di ipossia. Tale riduzione è ancora significativo dopo la fase di lavaggio. Potrebbe essere osservato un effetto simile sul potenziale fotorecettori.
I risultati sono supportati da altri dati pubblicati 16 e ci danno l'opportunità di studiare i possibili effetti neuroprotettivi dopo ipossia.
Dopo 45 min di esposizione 250 mM glutammato, abbiamo tro...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo articolo è dedicato alla mia amata moglie Maren e al nostro piccolo Karl.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 120 mM NaCl | Merck Pharma, Germania | 1.064.041.000 | |
| 2 mM KCl, | Merck Pharma, Germania | 1.050.010.250 | |
| 0,1 mM MgCl2, | Merck Pharma, Germania | 58.330.250 | |
| 0,15 mM CaCl2 | Merck Pharma, Germania | 111 TA106282 | |
| 1,5 mM NaH2PO4/13,5 mM Na2HPO4 | Merck Pharma, Germania | 1.065.860.500 | |
| 5 mM di glucosio | Merck Pharma, Germania | 40.741.000 |
Riferimenti
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