Metodo semplice per DNA fluorescenza In Situ Ibridazione di cromosomi Squashed

Summary

Qui, presentiamo un metodo semplice per eseguire l'ibridazione in situ del DNA a fluorescenza (DNA ISH) per visualizzare sequenze eterocromatiche ripetitive su cromosomi montati su vetrini. Il metodo richiede un numero minimo di reagenti ed è versatile per l'uso con sonde corte o lunghe, tessuti diversi e per la rilevazione con segnali basati sulla fluorescenza o non sulla fluorescenza.

Abstract

DNA ibridazione in situ (ISH DNA) è un metodo comunemente utilizzato per le sequenze di mappatura a specifiche regioni cromosomiche. Questo approccio è particolarmente efficace per la mappatura delle sequenze altamente ripetitive alle regioni eterocromatiche, dove approcci computazionali affrontare sfide proibitive. Qui si descrive un protocollo semplificato per ISH DNA che aggira lavaggi formammide che sono passi standard in altri protocolli ISH DNA. Il nostro protocollo è ottimizzato per l'ibridazione con brevi singole sonde filamento di DNA che portano coloranti fluorescenti, che segnano in modo efficace le sequenze di DNA ripetute all'interno di regioni cromosomiche eterocromatiche tutta una serie di diversi tipi di tessuto insetto. Tuttavia, le applicazioni possono essere estese da usare con sonde più grandi e la visualizzazione di sequenze singola copia (non ripetitivi) DNA. Dimostriamo questo metodo mappando diverse sequenze ripetitive diversi di cromosomi schiacciate da Drosophila melanogaster cellule neurali e Nasoniavitripennis spermatociti. Mostriamo modelli di ibridazione sia per le piccole, le sonde sintetizzati commercialmente e per una sonda più grande per il confronto. Questa procedura utilizza semplici forniture di laboratorio e reagenti, ed è ideale per gli investigatori che hanno poca esperienza con l'esecuzione di ISH DNA.

Introduction

DNA ibridazione in situ (ISH DNA) è un metodo comunemente utilizzato per le sequenze di mappatura a specifiche regioni cromosomiche. Sonde alle regioni a copia singola all'interno euchromatin possono essere generati attraverso una manciata di approcci, tra cui nick-traduzione o end-etichettatura dei prodotti lunghi di DNA ^1,2 e l'incorporazione di deoxygenin (DIG) nucleotidi -attached e il loro riconoscimento attraverso una grande varietà di anticorpi gruppo-coniugato ^1-3. Visualizzazione di sequenze eucromatiche in pochi o solo numero copia richiede l'uso di singole, grandi sonde ad alta attività specifica o un cocktail di ....

Protocol

1. Tissue Dissection e Fixation (60 min)

1. Per cervelli Drosophila, 3 ^° posto instar larve in una goccia di 1x PBS (tampone fosfato salino). Scegli grande 3 ^° instar larve che sono attivamente strisciando da fiale o bottiglie che non sono sovraffollate.
   1. Utilizzare uno ultrafine paio pinzette per afferrare i ganci bocca e un altro paio pinzette per afferrare 2/3 per tutta la lunghezza del corpo (figura 1A, B). Tirare delicatamente i ganci bocca per esporre il cervello, gangli ventrale, ghiandole salivari e parte del tratto digerente larvale. Utilizzare le pinzette per separare il cervello e gangli ventrale

Results

Per illustrare questo metodo, si ibridati una serie di piccoli oligonucleotidi sintetizzati in commercio che sono stati modificati chimicamente con coniugati fluorescenti (Figura 2) e una sonda più biotinilato (fatta attraverso la traduzione nick di un prodotto di PCR; Figura 2B), ai cromosomi da diversi tessuti differenti tipi (vedi tabella 1). Le sequenze bersaglio inclusi ripetizioni satelliti situati in pericentromeriche (eterocromatiche) regioni dei cromosomi mitot.......

Discussion

ISH DNA è spesso utilizzato per mappare le sequenze specifiche per i cromosomi. Abbiamo descritto un metodo semplice per ISH DNA ottimizzato per alto numero di copie, sequenze eterocromatiche. Invece di utilizzare lavaggi in una soluzione di formammide, che è un requisito in altri protocolli ISH DNA esistenti, poniamo vetrini montati tissutale direttamente su un blocco di pre-riscaldata per denaturare il DNA. Questo metodo aggira l'uso di grandi quantità di formammide. Un passo fondamentale per la produzione di segn.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vetrini rivestiti in poli-L-lisina (possono essere utilizzati anche vetrini normali)	Pinzette Sigma Aldrich
Ultrafini (calibro 5)	Vetrini coprioggetti Dumont
22 x 22 mm Trattato	Fisher		Sigmacote per immersione per 15 secondi, asciugando e rimuovendo tutte le tracce di Sigmacote in modo che il vetrino sia chiaro
Carta da filtro Sigmacote	Sigma
			75 - 150 mm
			oleata di paraffina
Blocco termico con termometro
Incubatrice
Lamette da
Camera di umidità Scatola			vuota per puntali per pipette o Tupperware, foderata con salviette di carta inumidite o
barattoli			con scanalature per vetrini
Foglio di
Pipette Pasteur Provette
			per microfuge da 1,5 ml
Smalto			per unghie Micropipetta P20 trasparente o colorata
e punte
Graffette			20 - 25 graffette metalliche standard collegate per formare a chain
Reagenti
16% paraformaldeide di grado EM	Reagenti
Acido acetico	Sigma
Azoto
100% Etanolo, grado
Sintetizzato commercialmente, marcato in fluorescenza oligo
Sonda biotinilata lunga	Invitrogen; Passaggi alternativi 2.7.1-2.7.3		es., nick tradotto e biotinilato con BioNick di Invitrogen
Rhodamine-Avidin	Roche; Passaggi alternativi 2.7.1-2.7.3		per il rilevamento di una sonda biotinilata lunga
Tampone di ibridazione	Ricetta sopra
4x SSCT	Ricetta sopra		soluzione salina-citrato di sodio + Tween
0,1x SSC	Ricetta sopra		soluzione salino-sodio citrato
Ricetta	sopra
SBT	Ricetta sopra		SSC, albumina sierica bovina, Tween
1x PBT	Ricetta sopra		soluzione salina tamponata con fosfato + Tween
1x PBS	soluzione salina tamponata con fosfato
			citrato di sodio allo 0,5% in H2O
Formamide	Sigma Aldrich
Vectashield con vettore DAPI	laboratori