Topo Pneumonectomia Modello di crescita compensatoria Lung

Sommario

La pneumonectomia di topo è un modello comunemente impiegato di crescita polmonare compensatoria. Questa procedura può essere utilizzata in combinazione con il tracciamento del lignaggio o con modelli murini transgenici per chiarire i meccanismi sottostanti.

Abstract

Negli esseri umani, la riparazione e il rimodellamento interrotti del polmone danneggiato contribuiscono a una serie di disturbi polmonari acuti e cronici che possono portare alla disabilità o alla morte. I modelli animali di riparazione e rigenerazione polmonare basati sulla lesione sono limitati da risposte specifiche della lesione, rendendo difficile differenziare i cambiamenti relativi alla risposta e alla risoluzione della lesione dai cambiamenti relativi alla riparazione e alla rigenerazione polmonare. Tuttavia, l'uso di modelli animali per identificare queste vie di segnalazione di riparazione e rigenerazione è fondamentale per lo sviluppo di nuove terapie volte a migliorare la funzione polmonare a seguito di lesioni polmonari. Il modello di pneumonectomia murina utilizza la crescita polmonare compensatoria per isolare quei segnali di riparazione e rigenerazione al fine di definire più chiaramente i meccanismi di resettazione alveolare. Qui, descriviamo la nostra tecnica per eseguire la pneumonectomia di topo e la pneumonectomia fittizia. Questa tecnica può essere utilizzata in combinazione con il tracciamento del lignaggio o altri modelli murini transgenici per definire il meccanismo molecolare e cellulare della riparazione e rigenerazione polmonare.

Introduzione

La funzione principale del polmone è di fornire ossigeno e anidride carbonica scambio tra un organismo e l'atmosfera. Negli esseri umani, una serie di condizioni congenite ed acquisite portano a ridurre la superficie del polmone che si traduce in deficit della funzionalità respiratoria. Anche se una serie di terapie come corticosteroidi inalatori, broncodilatatori, ossigeno supplementare, e la ventilazione meccanica cronica sono utilizzati per attenuare le conseguenze di funzionalità polmonare ridotta ^1-3, la terapia ideale per queste condizioni dovrebbe promuovere la ricrescita del tessuto polmonare funzionale - cioè, polmone rigenerazione.

Rigenerazione dei tessuti dei mammiferi è stata ben documentata. L'africano Mouse spinosi può rigenerare ampie aree di pelle senza formazione di cicatrici ^4. La falange distale nell'uomo può rigenerarsi dopo una lesione o amputazione ^5-7. Dopo pneumonectomia (PNX), la crescita del polmone di compensazione avviene nei topi ^8, ratti ^9, dogs ^10, e gli esseri umani ^11. Per definizione, la crescita del polmone di compensazione coinvolge non solo l'espansione di spazi aerei esistenti, ma ri-septation di questi spazi aerei allargata con l'espansione del microcircolo associato ^12. Analisi di espressione genica ha dimostrato che questo modello ricapitola molti degli eventi di segnalazione dello sviluppo polmonare ^13. Quattro settimane dopo il mouse PNX, superficie alveolare è equivalente a quella di fittizie animali operati ^14. In questo manoscritto, descriviamo la PNX mouse e procedure PNX fittizi.

Protocollo

Uso affermazione Animal:: NOTA Tutte le procedure di questo studio sono stati condotti con l'approvazione e seguendo le linee guida del Istituzionale uso degli animali e del Comitato Care (IACUC) dell'Ospedale dei bambini di Cincinnati. Otto settimane di età C57BL / 6J maschi sono stati ottenuti da Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) e permesso di ambientarsi per una settimana prima dell'uso. Fino chirurgia, gli animali sono stati alloggiati in una struttura senza barriere-patogeno e fornito chow autoclavato e filtrata ad acqua libdium. Ogni gabbia mouse è stato alimentato con aria dedicato e acqua e sale sono stati mantenuti su una 12 hr ciclo giorno-notte. Dopo il recupero da un intervento chirurgico, i topi sono stati mantenuti in gabbie con cime filtrati, a condizione autoclavato chow ad libidum, e purché filtrata l'acqua da una bottiglia d'acqua.

1. Preparazione degli strumenti

1. Rendere 6 divaricatori pelle utilizzando clip e perni di carta. Twist raddrizzò graffette sui gambi di perni di carta, lgronda un filo di acciaio diritto 5 cm da una estremità e fare un unico 0,5 centimetri gancio a forma di "U" alla fine del filo.
2. Fare circa 15 x 15 cm teli chirurgici quadrati con involucro di plastica. Preparare un condimento per ogni mouse. Mettere una torre di carta tra ogni involucro.
3. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici con una pila di piastrelle 12 x 12 pollici sughero, garze e tamponi di cotone con punta.

2. Preparazione del mouse

1. Indurre l'anestesia con il 2% isoflurano. Pesare animale.
2. In un'area dedicata, la preparazione chirurgica radersi torace sinistro e collo con il rasoio elettrico.
3. Applicare una goccia di lacrima artificiale unguento agli occhi del topo.
4. Decontaminare collo e torace sinistro con clorexidina e alcool isopropilico. Ripetere altre due volte.

3. mouse oro-tracheale intubazione e ventilazione meccanica

1. Avere un luogo non sterile tecnico chirurgico la supina mouse nell'area chirurgica pre-riscaldato.
2. Confermare profondità dell'anestesia documentando la mancanza di una risposta a zampa pizzico.
3. Dopo aver lavato le mani e indossare abiti chirurgica, maschera e cappello, indossare guanti chirurgici sterili.
4. Dopo drappeggio e con tecnica asettica, fare una incisione verticale 1 centimetro sopra l'anteriore a metà collo per esporre la laringe. Leggermente ritrarre i muscoli cinghia con curve dentata 10 centimetri pinze ed esporre la laringe e della trachea, diffondendo i muscoli cinghia con la punta di un paio di forbici diritte.
5. Via orale inserire un 22 G smussato punta angiocatheter nel mid-trachea (Figura 1A) e confermare visivamente il posizionamento (Figura 1B). Mantenere l'anestesia e ventilare con 1-3% isoflurano attraverso roditori ventilatore (225 ml per ictus; 200 Stokes al minuto). Impiegare un limite pressione di 15 cm H ₂ O.

4. mouse Pneumonectomia

1. Posare il mouse in decubito laterale destro con la parte posteriore del topo di frontel'operatore (lato sinistro in alto). Utilizzare un involucro di plastica autosigillante come un telino sterile. Taglio attraverso il drappo, utilizzare smussato forbici curve a punta per fare un taglio di due centimetri lungo parallelo alle costole al 4 ^° e 5 ^° spazio intercostale. Inserire la punta ricurva forbici spuntate e sezionare la pelle dalle costole sottostanti e muscoli intercostali.
2. Ritrarre la pelle con quattro divaricatori per esporre un quadrato di 1,5 x 1,5 centimetri finestra chirurgica (Figura 2A). Fissare i divaricatori alla scheda di sughero.
3. Sezionare fino a costine con pinze curve, e utilizzare una punta delle pinze curve di entrare nella cavità toracica.
4. Utilizzando la punta smussata micro-forbici, usare la lama inferiore per entrare nella cavità toracica. Eseguire un'incisione 0,5 centimetri tra le costole e ripetere nella direzione opposta.
5. Utilizzando i due divaricatori rimanenti, aprire il torace nel asse anteriore-posteriore e la sicurezza dei divaricatori per la bacheca di sughero (Figura 2B).
6. Uso curve pinze a punta smussata nella mano sinistra, afferrare il polmone sinistro e spostare la parte superiore del polmone sinistro lateralmente e inferiormente attraverso la toracotomia fino l'arteria polmonare sinistra e dei bronchi sono esposti (Figura 3A, B).
7. Tenendo titanio applicatore microclip vascolare caricata nella mano destra con il corpo dell'applicatore nel palmo e punta ricurva punta lontano dalla palma (Figura 3C), far scorrere la punta dell'applicatore nel torace lungo la curvatura della faccia posteriore sinistra polmone e clip il bronco sinistro e l'arteria polmonare (Figura 3D).
8. Rimuovere l'applicatore ma mantenere il polmone sinistro retratto. Afferrare le smussati punta micro-forbici con la mano destra e tagliare il bronchi e polmonare distale al clip e rimuovere polmone sinistro (Figura 3E).
9. Rimuovere i divaricatori costali.
10. Utilizzare le pinze smussato curve a pizzicare 1 cm di pelle inferiori alla incisiacceso ma sopra del livello del diaframma e inserire un G angiocatheter 24 attraverso la pelle e nella cavità toracica sinistra (Figura 4A, B).
11. Utilizzare 5-0 prolene sutura di inserire due punti staccati in tutto il 4 ^° e ^{5 °} costole per chiudere la cavità toracica.
12. Rimuovere i divaricatori pelle. Utilizzare due serie di pinze per approssimare la pelle lungo la lunghezza dell'incisione e incollare la pelle chiusa.
13. Collegare una siringa luer-lock 3 ml al angiocatheter e rimuovere l'aria residua applicando delicata aspirazione e il ritiro della angiocatheter.
14. Incollare l'incisione collo chiuso con due set di pinze come prima.

5. mouse Sham Pneumonectomia

1. Esporre il polmone sinistro, come indicato nel protocollo "Mouse Pneumonectomia". Sollevare la gabbia toracica con una pinza smussato curve per consentire all'aria nella cavità toracica sinistra (Figura 5A, B).
2. Posizionare un G angiocatheter 24 nel tho di sinistraRacic cavità come sopra facendo attenzione a non danneggiare il polmone sinistro.
3. Utilizzando 5-0 prolene sutura e facendo attenzione a non forare il polmone (figura 5C), posizionare due lunghezze di materiale di sutura nel 3 ^° / 4 ^° e 5 ^° / 6 ^° intercapedini costola (Figura 5D). Mettere entrambe le lunghezze di materiale di sutura prima di legare per ridurre i rischi di ernia del polmone sinistro. Legare il materiale di sutura per fare due punti interrotti (Figura 5E).
4. Incollare la pelle sopra l'incisione toracica, rimuovere l'aria residua con il angiocatheter, e incollare l'incisione collo come sopra.

6. Rianimazione, Analgesia, e recupero

1. Spegnere il isoflurano, e somministrare 0,1 mg / kg di buprenorfina e 0,5 ml di soluzione fisiologica normale per via sottocutanea.
2. Quando respirazioni spontanee riprendono, rimuovere il tubo endotracheale.
3. Osservare il mouse fino a quando non è di nuovo ambulatoriale. Walking tipicamente resumes diversi minuti dopo la rimozione del tubo endotracheale.
4. Posizionare il mouse in un 27 ° C incubatore (umidificato, 25% di ossigeno) per recuperare O / N.
   NOTA: Abbiamo posto diverse pellets di chow bagnato con acqua sul pavimento della gabbia per le prime 24 ore dopo l'intervento chirurgico.
5. Somministrare 0,1 mg / kg di buprenorfina per via intraperitoneale due volte al giorno per tre giorni dopo l'intervento. Fare attenzione a non aprire il sito chirurgico durante la manipolazione degli animali.

7. Monitoraggio mouse

1. Pesare topi a 1, 3, 5, e 7 giorni dopo l'intervento chirurgico.

Risultati

. Una trama di PNX e sham gestito pesi del mouse viene fornito in figura 6 Nelle nostre mani, la sopravvivenza è costantemente 95-100% per entrambi PNX e sham pneumonectomia. Per una descrizione di come il polmone destro re-cresce in questo modello e il decorso previsto, rimandiamo il lettore di manoscritti di Gibney et al. ¹⁵ e Wang et al. ¹⁴

Diversi problemi comuni devono essere evitati per eseguire con successo le procedure sham pne...

Discussione

Abbiamo fornito la descrizione più dettagliata delle procedure PNX del mouse PNX e mouse farsa segnalati fino ad oggi. Abbiamo fatto il lettore a conoscenza di alcuni dei problemi comuni che gli investigatori di apprendimento la procedura comunemente incontrano, e abbiamo delineato diverse tecniche sviluppate dal nostro laboratorio per mitigare queste trappole. Altri laboratori che utilizzano questo modello possono sviluppare altre modifiche tecnica o utilizzare strumenti diversi. Nel valutare le differenze nelle tecnic...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Applicatore di clip vascolari da 6 pollici	Teleflex Medical (WECK)	137062
Horizon piccola clip rossa in titanio	Teleflex Medical (WECK)	1201
Pinza curva da 12 cm	Fine Science Tools	11003-12
Pinza Graefe seghettata curva da 10 cm	Fine Science Tools	11052-10
Porta	aghi CastroviejoFine Science Tools	12565-14
Forbici per strabismo dritte da 9 cm (punta smussata)	Fine Science Tools	14075-09
Forbici fini dritte da 8,5 cm temprate	Fine Science Tools	14090-09
Forbici a molla dritte e smussate Cohan-Vannas	Fine Science Tools	15000-12
Colla per pelle	Gluture	32046
22 G Angiocatheter
24 G Angiocatheter
3 ml Siringa
4 Divaricatori
2 Divaricatori
5-0 Prolene su ago da taglio curvo	Ethicon	8698G
Siringa da 0,5 ml su ago
Soluzione salina
Buprenorfina
Press-n-Seal wrap	Glad Products Company
12 x 12 pollici Sughero bordo pila	Ufficio Deposito
70% etanolo
Betadine
Ventilatore per topi	Hugo Sachs Elektronnik	Minivent Tipo 845
Vaporizzatore isoflurano	OHMEDA	Excel 210 SE
Unguento lacrimale artificiale	Puralube	NDC: 17033-211-38

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