Articolo metodologico

Valutazione della Selective mRNA Traduzione in cellule di mammifero per polisoma Profiling

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DOI:

10.3791/52295

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28 ottobre 2014

 ,  , 
1Apoptosis Research Centre, Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute and Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology, University of Ottawa, 2Montreal Neurological Institute, 3Apoptosis Research Centre, Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute and Department of Pediatrics, University of Ottawa

In questo articolo

Sommario

La capacità delle cellule di adattarsi allo stress è fondamentale per la loro sopravvivenza. La regolazione della traduzione dell'mRNA è una di queste strategie di adattamento, che prevede una rapida regolazione del proteoma. Qui, forniamo un protocollo standardizzato di profilazione dei polisomi per identificare mRNA specifici che vengono tradotti selettivamente in condizioni di stress.

Abstract

Regolazione della sintesi proteica rappresenta un punto di controllo chiave nella risposta cellulare allo stress. In particolare, RNA discreto elementi regolatori sono stati mostrati per permettere alla traduzione selettiva di specifici mRNA che codificano per proteine ​​tipicamente richiesti per una particolare risposta allo stress. L'identificazione di questi mRNA, così come la caratterizzazione dei meccanismi di regolamentazione responsabili della traduzione selettiva è stata in prima linea di biologia molecolare per qualche tempo. Profiling polisoma è un metodo pietra miliare in questi studi. L'obiettivo di polisoma profiling è quello di catturare la traduzione dell'mRNA immobilizzando ribosomi traducono attivamente diverse trascrizioni e separare i poliribosomi risultanti da ultracentrifugazione su gradiente di saccarosio, consentendo così una distinzione tra trascrizioni altamente tradotti e quelli mal tradotti. Questi possono poi essere ulteriormente caratterizzate da metodi tradizionali biochimica e biologia molecolare. È importante sottolineare che, combinando polysome profilatura con approcci genomici ad alto rendimento consente una vasta analisi di scala di regolazione traduzionale.

Introduzione

Regolazione della sintesi proteica (traduzione) è un processo cellulare fondamentale che è intimamente legata alla sopravvivenza cellulare. Dato che la traduzione consuma più del 50% dell'energia della cellula, non è sorprendente che la traduzione è strettamente regolata e che perturbazioni in una versione non sono ben tollerati. Al contrario, molti processi cellulari aberranti richiedere che le macchine di traduzione e l'uscita di traduzione (cioè proteoma) devono essere modificati. Questo è spesso il caso in vari stati di risposta allo stress e malattie, ed è probabilmente meglio esemplificato nel cancro. Uno dei principali vantaggi del controllo traduzionale è la capacità delle cellule di riprogrammare rapidamente la produzione di proteine ​​in risposta a vari trigger esterni ed interni, così bene meccanismo di regolazione che consigli l'equilibrio tra la sopravvivenza delle cellule e la morte 1.

Due aspetti del controllo traduzionale sono particolarmente interessanti; comprensione della natura del mec normativohanism (s) ed elementi di comando che consentono una versione specifica, e l'identificazione di specifici mRNA e dei loro prodotti proteici che partecipano alla risposta cellulare al particolare trigger che ha suscitato una versione selettiva in primo luogo. Profilatura polisoma è una tecnica che permette efficace studio di entrambi i processi.

L'obiettivo generale della tecnica polisoma profiling è quello di studiare e quantificare lo stato di traduzione di specifici mRNA in condizioni cellulari diversi. Il principio della tecnica è quello di catturare la traduzione dell'mRNA da '' congelamento '' ribosomi traducono attivamente su diversi trascritti e separare i poliribosomi risultanti da ultracentrifugazione su gradiente di saccarosio, consentendo una distinzione tra trascrizioni altamente tradotte (vincolato da più ribosomi) e quindi mal quelli tradotti (vincolati da uno o due ribosomi). In questo particolare protocollo, la cicloesimmide antibiotico che si lega allaSubunità ribosomiale 60S e inibisce la produzione di deacetilato tRNA dal sito E ribosoma 2, viene utilizzato per inibire la traslocazione del ribosoma ribosomi e stallo sul mRNA traduzione. Tuttavia, altri agenti bloccanti come emetine tale definizione anche i blocchi di allungamento 3, può essere utilizzato.

A differenza del western blotting e 35 S-metionina tecniche di marcatura che misurano l'output finale del processo di traduzione, polisoma profilazione ha il vantaggio di misurare ribosomi associazione con mRNA attivamente tradotte, consentendo così uno studio più dettagliato di meccanismi di conversione in condizioni diverse. Quindi, la tecnica può essere facilmente adattato per studiare specificamente diverse modalità di definizione 4-6, fattori proteine ​​coinvolte nella regolazione definizione 7-9, condizioni di stress che interessano la sintesi proteica 1,10,11 o gli effetti delle strutture di mRNA come IRES oa monte aperte fasi di lettura su proteine ​​synthESIS 12-14. Al giorno d'oggi, polisoma applicazioni di profilatura sono ancora più ampia con l'uso di DNA microarray 15 o sequenziamento di prossima generazione 16,17 per analizzare polisomi-associati mRNA.

Protocollo

NOTA: Una nota su come lavorare con RNA: Prendere precauzioni standard per la protezione contro la degradazione dell'RNA da RNasi. Utilizzare guanti, puntali per pipette, plasticware RNasi-free e sostanze chimiche in tutte le fasi del protocollo. Utilizzare ultrapura o acqua DEPC trattati per tutte le soluzioni. Decontaminare le superfici sospette con la soluzione di inattivazione RNase seguendo il protocollo del produttore.

1. Preparazione di soluzioni.

  1. Preparare 500 ml di soluzione di base (0,3 M NaCl;. 15 mM MgCl 2 6H 2 O, 15 mM Tris-HCl, pH 7,4). Mescolare con un ancoretta fino a quando la soluzione è limpida e passare attraverso un filtro da 0,45 micron. Conservare a temperatura ambiente.
  2. Preparare 10 e il 50% soluzioni di saccarosio e 60% Soluzione Chase come segue:
    1. Per il 10% di saccarosio Solution (w / v), in un tubo da 50 ml centrifuga aggiungere 5 g di saccarosio e riempire a 50 ml con soluzione di base. Per il 50% soluzione di saccarosio (w / v), in un tubo annuncio centrifuga da 50 mld 25 g di saccarosio e riempire a 50 ml con la soluzione di base.
    2. Per il 60% (w / v) Chase soluzione, in un tubo da centrifuga da 50 ml aggiungere 30 g di saccarosio e riempire a 50 ml con soluzione di base. Aggiungere 100 ml di soluzione di blu di bromofenolo satura (aggiungere bromofenolo blu per acqua fino a quando non si scioglie più, centrifuga per far sedimentare la polvere non disciolta) alla soluzione di caccia del 60%. Mescolare con un vortice e verificare la completa dissoluzione.
    3. Soluzioni Conservare a 4 ° C fino al momento dell'uso.
  3. Preparare RNA Lysis Buffer. Preparare questo buffer fresco il giorno dell'esperimento. Preparare 500 ml di tampone di lisi RNA per ogni campione. Ad 1 ml di soluzione di base aggiungono 10 ml di Triton X-100 (1% [v / v] def), 1 ml di 100 mg / ml cicloeximide in DMSO (CHX, 0,1 mg / ml finale) e 3,5 ml RNasin (140 U / ml). Mescolare con un vortice. Tenere su ghiaccio.
    NOTA: Cicloeximide è altamente tossico e può causare mutazioni. Evitare il contatto con la pelle e l'inalazione. Per evitare di maneggiare la polvere troppo spesso, di preparazionesono una grande quantità di 100 mg / ml in DMSO magazzino, un'aliquota e mantenerlo a -80 ° C per una conservazione a lungo termine. Tenere magazzino lavora a -20 ° C.
  4. Il giorno dell'esperimento, preparare saccarosio + CHX Soluzioni aggiungendo CHX (concentrazione finale di 0,1 mg / ml) al volume desiderato del 10% e soluzione di saccarosio al 50% (~ 7 ml di ciascuna soluzione a gradiente).

2. Preparazione di saccarosio gradiente utilizzo di un caffè automatico Gradient

  1. Girare il creatore di gradiente '' ON '' e livellare il piatto che conterrà il gradienti (criticalstep!) Clicca su '' Fatto '' quando piatto è livellato.
  2. Selezionare nel menu del programma di gradiente da eseguire:
    1. Premere menu '' GRAD '' e selezionare '' LIST ''.
    2. Selezionare "SW41".
    3. Scorrere l'elenco e selezionare il ''10 - 50% di pendenza - 11 passi' 'programma di stampazione il pulsante '' RUN ''.
  3. Posizionare un tubo conico ultracentrifuga (SW-41 tubo, 14 x 89 mm) nel Marker Block e utilizzare il marcatore tubo multa prevista per tracciare un segno sul tubo lungo il gradino superiore della Marker Block. Mettere i tubi in un rack di montaggio su una superficie stabile.
    NOTA: Questo marchio sarà la guida di riempimento per la stratificazione delle soluzioni di saccarosio del 10 e 50%.
  4. Fissare la cannula a due prevista per due siringhe 10 ml e lavare pipettando su e giù con acqua distillata tiepida contenente soluzione inattivazione RNasi. Assicurarsi di rimuovere tutte le tracce di acqua in seguito.
  5. Riempire una delle siringhe con il 10% di saccarosio + CHX e inserire la cannula nella parte inferiore del tubo ultracentrifuga. Erogare delicatamente soluzione al 10% di saccarosio finché non entra appena passato il segno sulla provetta.
    NOTA: Evitare di fare bolle. Se si formano bolle, picchiettare delicatamente il tubo per spostare loro.
  6. Riempire l'altra siringa con il 50% di saccarosio + CHX, eliminare il liquido in più fuoricon una cannula pulire e inserire delicatamente sul fondo della provetta ultracentrifuga. Erogare delicatamente la soluzione di saccarosio al 50% fino a raggiungere esattamente il marchio. Rimuovere rapidamente e senza intoppi la cannula.
    NOTA: Il saccarosio 10% dovrebbe salire nel tubo e forma un menisco in alto. Se no, aggiungere più soluzione di saccarosio al 10% in superficie.
  7. Inserire il tappo fornito inclinando il tubo ultracentrifuga un po 'e spostare tutte le bolle d'aria. Rimuovere il liquido in eccesso nel serbatoio del tappo con una micropipetta.
  8. Pulire il liquido in eccesso lungo la parete del tubo e posto sul piatto gradiente per il caffè.
  9. Premere il pulsante '' RUN ''.
    NOTA: La piastra si inclina con l'angolo specificato, mettere in pausa per 5 secondi e le rotazioni per formare il gradiente avrà inizio.
  10. Quando formazione di pendenza è completa (circa 2 minuti, la macchina emette un segnale acustico), rimuovere delicatamente il ultracentrifuga (s), posto sulla cremagliera e rapidamente rimuovere il tappo in un movimento verso l'alto per evitare di disturbare la Temnt.
  11. Tenere gradiente (s) sul ghiaccio. Non disturbare! In alternativa, i gradienti mantenere una notte a 4 ° C.
  12. In alternativa, utilizzare un due camera di gradiente creatore di rendere gradienti come segue:
    1. Tubo di risciacquo e gradiente creatore con la soluzione inattivazione RNase e acqua RNase-free.
    2. Aggiungere 5 ml di 50% di saccarosio + CHX alla camera prossimale di caffè gradiente e assicurare che l'aria tra le due camere è rimosso.
    3. Aggiungere 5 ml di 10% di saccarosio + CHX alla camera distale del creatore di gradiente.
    4. Aggiungere 0,5 ml di 50% di saccarosio + CHX a fondo di una provetta da centrifuga conica (SW-41 tubo, 14 x 89 mm) e il luogo in portaprovette.
    5. Accendere agitatore posto in camera di prossimale, aperti sportelli cazzi e deposito gradiente alla velocità impostata su "3" (circa 1 ml / min).
    6. Luogo gradiente (s) sul ghiaccio. Non disturbare.
      NOTA: gradienti possono essere conservati a 4 ° C.

3. cellulare Lysis e ultracentrifugazione.

  1. Inserire SW-41 rotore e benne a 4 ° C e centrifugare impostato a 4 ° C.
    NOTA: La procedura di lisi cellulare è ottimizzato per due 150 millimetri subconfluenti (~ 70-80% confluenti) piatti di cellule HEK293 per gradiente e volumi utilizzati può essere necessario un aggiustamento per diverse linee cellulari.
  2. Cellule piatto alla densità cellulare adeguata nei mezzi di comunicazione di crescita, almeno 24 ore prima della lisi.
  3. Preparare una aliquota (20 ml ogni 150 mm Piastra) di terreni di crescita contenente 0,1 mg / ml CHX.
  4. Incubare le cellule a CHX + mezzi (20 ml per 150 millimetri piastra) per 3 minuti a 37 ° C / 5% di CO 2 per arrestare e stabilizzare polisomi.
  5. Lavorando in fretta, i media aspirato dalle piastre, piatti segnaposto su ghiaccio e lavare le cellule una volta con 10 ml di ghiaccio freddo fosfato soluzione salina tamponata (PBS: 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1.8 mM KH 2 PO 4) integrato con CHX (concentrazione finale di 0,1 mg / ml) avendo cura di pipettare lentamente lungo il side della parete piatto per minimizzare il sollevamento del monostrato cellulare.
  6. Aspirare il PBS e aggiungere un ulteriore 10 ml di PBS + CHX di ogni piatto, raschiare le cellule con un sollevatore di cellulare e trasferire il volume totale da entrambe le piastre per un tubo da 50 ml centrifuga sul ghiaccio. Conservare 1 ml di sospensione cellulare in una provetta per microcentrifuga in ghiaccio per analisi delle proteine ​​a valle.
  7. Centrifugare la provetta 50 ml di cellule a 300 xga 4 ° C per 10 min.
  8. Rimuovere tutti PBS e risospendere il pellet in 500 ml di tampone di lisi ghiaccio RNA freddo.
  9. Trasferimento sospensione cellulare in una provetta 2 ml.
  10. Pipettare su e giù per le cellule lisi e incubare in ghiaccio per 10 minuti con vortex occasionale.
  11. Centrifugare a 2000 xga 4 ° C per 5 min a pellet nuclei.
  12. Trasferire il surnatante in una nuova provetta 2 ml.
  13. Centrifugare a 17.000 xga 4 ° C per 5 min a pellet detriti cellulari.
  14. Trasferire il surnatante in una nuova provetta 2 ml microcentrifuga e usare 2 ml per misuraredensità ottica a 260 nm (tampone di lisi uso come vuoto).
  15. Rimuovere 50 ml (10% del totale) di ogni campione per l'analisi di RNA totale. NOTA lisato può essere conservato a -80 ° C fino al momento dell'uso.
  16. Caricare delicatamente unità uguali A260 su ciascuno gradienti di saccarosio (min 10 OD, ottimali 25 OD, in un volume massimo di 500 ml;. Diluire lisato concentrato con tampone di lisi supplementare se necessario).
  17. Assicurarsi che i gradienti sono a 0,1 g l'uno dall'altro prima di ultracentrifugazione.
  18. Gradienti centrifugare a 39.000 rpm (260.343 xg) per 1,5 ore a 4 ° C.
  19. Durante spindown tenere freno rotore e spegnerlo durante la decelerazione quando raggiunge 1.000 giri al minuto.
    NOTA: Questo passaggio riduce al minimo qualsiasi disturbo dei gradienti causati da bruschi cambiamenti di accelerazione delle testine in contatto con il rotore in fase di frenata.

4. gradiente Frazionamento sistema Instrument Set-up.

  1. Set-up dello strumento e vuote le spectrophotometer con acqua come segue:
    1. Accendere i componenti e attendere che la lampada si riscaldi-up per almeno 15 min.
    2. Assicurarsi che collettore di frazioni è impostato sul 'polisoma' metodo (premere due volte sull'icona della cartella; ritorno freccia due volte per tornare alla schermata iniziale).
    3. Assicurarsi che la valvola sul collettore di frazioni è impostato su rifiuti (freccia che punta a icona cestino bin). Inserire una beuta da 250 ml contenente acqua distillata sotto il tubo di raccolta dei rifiuti.
    4. Selezionare le seguenti impostazioni sul registratore grafico: Set Sensibilità manopola per 'LAMPADA SET E OTTICA'; impostare Noise interruttore del filtro a '1,5'; Regolare il selettore di separatore di picco su 'OFF'; set di selezione rapida Grafico a '30 cm / h '(5 cm / 10 min); set di base Regolazione linea (sulla parte superiore dell'unità spettrofotometro) a 'MAX APERTA'.
      NOTA: Opzionale: Un software registratore digitale può essere usato al posto del registratore grafico. Sul computer, fare clic su 'Start'. Una finestra di acquisizione si apre: in thMenu e Opzioni, deselezionare la grafica Pausa. Modalità di visualizzazione, impostare i limiti del grafico a -10 e 100 (può essere modificato on-the-fly durante la corsa). Fare clic sul pulsante Salva per creare un nuovo file e registrare la corsa.
    5. Posizionare la siringa e la canna nella pompa e stringere in posizione (uso fornisce viti e chiave a brugola).
      NOTA: Non serrare eccessivamente.
    6. Riempire la siringa con Chase soluzione utilizzando il '' REV '' comando a velocità RAPID. Collocare la pompa in posizione verticale e inseguire l'aria attraverso il tubo con il 'AVANTI' 'comando'. Utilizzare RAPID Solo per questa funzione e lavaggi.
    7. Installare un tubo ultracentrifuga riempita con acqua priva di RNasi.
    8. Pierce il tubo ultracentrifuga con la cannula fino a quando i due segni neri sono visibili (il foro di erogazione si trova tra questi due segni) e avviare la pompa siringa su '' Manual '' a 6,0 ml / min.
    9. Come l'acqua passa attraverso la cella di flusso (ove cSoluzione hase riempie 1/3 del tubo), velocità interruttore variabile e impostata a 1,0 ml / min.
    10. Ad una velocità di flusso di 1,0 ml / min, regolare la linea di base Regolare quadrante sul spettrofotometro finché la tensione sul grafico è a zero (+/- 0,5 unità).
      NOTA: Osservare uscire l'acqua dal tubo di scarico nella beuta.
    11. Impostare la sensibilità desiderata a '0,5' o '1.0' AU.
      NOTA: 1.0 AU funziona meglio per 10 OD unità in un gradiente di 10 ml. Se OD è inferiore a 10, '0,5' sensibilità può essere utilizzato per migliorare il segnale.
    12. Premere il pulsante Auto Baseline e regolare le impostazioni per la soglia del 10% sul registratore grafico di base ruotando la manopola di offset Recorder (facoltativo se si usa registratore digitale).
    13. Una volta che una linea di base stabile è raggiunto, girare l'interruttore della pompa su 'OFF' e la ghiera tabella delle velocità a 60 cm / h se si utilizza registratore grafico analogico o 'OFF' se si utilizza registratore digitale.
    14. Recuperare la soluzione Chase passando pompa a 'REPosizione di V '(se necessario si può aumentare la portata di nuovo a 6,0 ml / min ... NON USARE RAPID) fino a raggiungere la prima boa sulla cannula piercing.
    15. Rimuovere il tubo da centrifuga e inseguire eventuali bolle d'aria all'interno della cannula eseguendo un po 'della soluzione Chase attraverso di essa. Pulire il pulito fase di piercing.
      NOTA: Alcuni acqua residua può fuoriuscire dalla cella di flusso.

5. Gradiente Frazionamento e la raccolta di campioni.

  1. Installare e forare il tubo da centrifuga contenente il gradiente di saccarosio.
  2. Posizionare undici 2 ml provette da microcentrifuga nel collettore frazione posizioni vassoio 1-11 in modo che i tappi non sporgano verso l'alto. Sostituire '' tubo # 1 '' per ora con un '' tubo di scarico '' per raccogliere qualsiasi liquido rimasto nel tubo collettore.
  3. Impostare la manopola di controllo della pompa di 'manuale' e portata sulla pompa a siringa a '6,0 ml / min'
  4. Premere l'icona 'Play' sul raccoglitore di frazioni. Non appena il braccio raggiunge il primo tubo, premere il tasto '' pausa '' (questo posizionare il braccio e aprire la valvola frazione di erogazione).
  5. Avviare la pompa utilizzando il comando '' 'AVANTI' e monitorare Grafico penna registratore. Quando inizia deviando verso l'alto (che indica che il campione passa attraverso la cella di flusso dello spettrofotometro), rapidamente sostituire '' tubo di scarico '' con '' tubo # 1 ''.
  6. Quando la prima goccia viene raccolto, passare rapidamente ai comandi 'avvio / arresto a distanza', '' variabile (1,0 ml / min) '' e premere '' Play '' icona.
    NOTA: La pompa è ora controllata dall'interfaccia raccoglitore di frazioni e 1 ml frazioni saranno raccolti ogni min.
  7. Da questo punto in poi, letture A260 appariranno sull'interfaccia registratore digitale (o la Recorde grafico analogicor). Assicurarsi che il '' Record '' si preme il pulsante sul software!
  8. Dopo il blu Soluzione Chase entra nel tubo di raccolta o l'ultimo tubo (tubo di solito 11), premete l'icona 'Stop'.
    NOTA: La valvola di erogazione dovrebbe passare alla valvola di scarico.
  9. Tenere frazioni in ghiaccio prima di aver frazionato tutti i gradienti. Al termine delle frazioni giorno può essere conservato a -80 ° C prima proteina o isolamento dell'RNA. Se è richiesta proteine ​​e RNA analisi, dividere ogni frazione a metà (500 microlitri ciascuno per proteine ​​e RNA analisi).

6. Lavare

NOTA: (questo è un passaggio facoltativo da eseguire solo se più pendenze devono essere raccolti).

  1. Immergere il tubo di scarico nella beuta contenente ~ 50 ml di acqua ultrapura e invertire la pompa utilizzando una portata 6 ml / min.
  2. Arrestare la pompa quando la soluzione Chase raggiunge il primo contrassegno on la cannula piercing.
  3. Rimuovere la provetta da centrifuga, inseguire l'aria fuori della cannula e pulire il palco piercing.
    NOTA: Alcuni acqua residua può fuoriuscire dalla cella di flusso.
  4. Ripetere la procedura di frazionamento partendo dal punto 5.1.

7. pulizia finale.

  1. Scollegare il tubo della pompa dal fondo del perforatore e pompare la soluzione Chase in una provetta da centrifuga da 50 ml usando l'impostazione flusso rapido. Conservare la soluzione Chase a 4 ° C in quanto può essere riutilizzato.
  2. Collegare tubo della pompa ad un sistema di tubi 3 vie e chiudere la valvola che porta alla siringa. Collegare un tubo ad una siringa da 50 ml riempita con acqua distillata e l'altro tubo alla base del perforatore.
  3. Installare il tubo ultracentrifuga utilizzato per la fase di tranciatura e passare almeno 50 ml di acqua distillata attraverso lo spettrofotometro e tubo di raccolta (interruttore al menu di raccolta sull'interfaccia facendo clic sul '' Start / Pausa '' icona).
  4. Rimuovere il tubo, siringa (utilizzare chiave a brugola per rimuovere le viti) e di tutti gli altri componenti rimovibili e lavare accuratamente con acqua del rubinetto tiepida e poi risciacquare con acqua ultrapura.
    NOTA: Prestare particolare attenzione quando si lava il pistone, cilindro, tubi e piercing cannula.
    NOTA: Maneggiare la siringa cilindro in vetro con cautela! Conservare tutti i componenti a partire da polvere.
  5. Pulire fondo della cella di flusso con un panno morbido inumidito con acqua distillata. Pulire il vassoio raccoglitore di frazioni e tutte le altre aree in cui potrebbe essere stato versato il saccarosio.

8. Isolamento di RNA dal saccarosio Frazioni.

  1. Preparare 50 ml di soluzione di proteinasi K per ogni 1 ml di frazione saccarosio (37,5 microlitri 10% SDS, 7,5 ml di EDTA 0,5 M, 1 ml Glycoblue, 4 ml di 20 mg / ml di proteinasi K).
  2. In 2 ml tubo fondo piatto, incubare 1 ml frazione di saccarosio con 50 ml di soluzione di proteinasi K a 55 ° Cper 1 ora (se si usa 500 microlitri frazioni regolare il volume di soluzione di proteinasi K di conseguenza).
  3. Aggiungere un volume uguale di fenolo: cloroformio: alcool isoamilico (125: 24: 1, preferibilmente acido (pH 4,5) per minimizzare la contaminazione del DNA) alle frazioni saccarosio.
    NOTA: aggiungere un extra di 200 ml di cloroformio a frazioni 7-10 perché sono più pesanti e fasi potrebbero ottenere invertita.
    NOTA: fenolo / cloroformio può causare ustioni al contatto e l'inalazione. Indossare camice da laboratorio, occhiali di sicurezza, e utilizzare un fumehood.
  4. Vortex ~ 30 sec e centrifugare a massima velocità per 5 minuti a temperatura ambiente.
  5. Rimuovere ~ 80-90% di fase acquosa (non toccare interfase che potrebbero contenere DNA genomico) e posto in nuovo tubo.
  6. Aggiungere un uguale volume di cloroformio e ripetere il punto 8.4.
  7. Rimuovere fase acquosa facendo attenzione ad evitare interfase.
  8. Aggiungere 1:10 volume di 3 M acetato di sodio, pH 5,2 (in alternativa 5 M di acetato di ammonio può essere utilizzato).
  9. Aggiungere 1,5 volumi di refrigerati, absolute etanolo e vortex per 15 sec.
  10. Precipitare durante la notte a -20 ° C (o 1 ora a -80 ° C se in fretta).
    NOTA: I campioni possono essere lasciati a -20 ° C più a lungo, se necessario.
  11. Centrifugare alla massima velocità per 30 min a 4 ° C.
  12. Lavare il pellet con 1 ml di freddo RNasi-free etanolo al 70%.
  13. Far asciugare il pellet e risospendere in 20 ml di acqua RNase-free.
  14. Quantificare l'RNA totale mediante spettrofotometria per garantire un adeguato rendimento e la purezza (sulla base di A260 / 280 ratio) e procedere allo standard RT-qPCR 14 con volumi uguali di ogni frazione e primer PCR specifici per l'mRNA (s) di interesse.

9. Isolamento di proteine ​​dal saccarosio Frazioni.

  1. Oltre a RNA, proteine ​​possono essere isolati e identificati nelle singole frazioni polisoma pure. Utilizzare uno dei tanti ottimi protocolli disponibili per l'isolamento delle proteine, ad esempio 18.

Risultati

Abbiamo recentemente descritto un nuovo ruolo per il tumore soppressore PDCD4 come un inibitore selettivo di traduzione degli mRNA codificanti inibitori di apoptosi XIAP e Bcl-xL 12 IRES-ospitare. Profiling polisoma era una tecnica fondamentale per dimostrare il coinvolgimento specifico di PDCD4 nella traduzione IRES-mediata. HEK293 cellule sono state trasfettate per esaurire i livelli endogeni di PDCD4 (Figura 1A) e poi sottoposti ad polisoma analisi del profilo. Abbiamo osservato che la riduzione dei livelli di PDCD4 non ha compromesso la traduzione globale cellulare, come giudicato dalla mancanza di cambiamenti nel profilo polisoma quando si confrontano i siCTRL e siPDCD4 cellule trattate (Figura 1B). Allo stesso modo, polisoma distribuzione di non-IRES variante di XIAP 19 è rimasta invariata tra le cellule trattate e non trattate (Figura 1C). Al contrario, polisoma distribuzione dei mRNA due IRES-ospitano, XIAP e Bcl-xL, è risultata significativamente modificata. In assenza di PDCD4 la distribuzione di questi due mRNA viene spostata in ribopolysomes pesanti (Figura 1D, E). Dal momento che questo non è accompagnato da variazioni dei livelli di steady-state di XIAP e Bcl-xL mRNA (Figura 1F) Questi risultati dimostrano una maggiore traduzione di XIAP e Bcl-xL in cellule con livelli PDCD4 ridotti, che è stato ulteriormente confermato mediante Western blotting (Figura 1G).

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Figura 1:. Profiling polisoma identifica PDCD4 come inibitore selettivo della traduzione XIAP e Bcl-xL (A) HEK293 cellule sono state trattate con PDCD4 siRNA o di controllo (CTRL), non-targeting siRNA, lisati e sottoposti ad analisi Western blot con anti-PDCD4 e gli anticorpi anti-nucleolina per verificare il grado di PDCD4 knock-down. (B) PDCD4 è stato abbattuto come in (A) eI lisati cellulari sono stati sottoposti a polisoma profilatura. Profilo polisoma Rappresentante è mostrato nel pannello superiore; distribuzione del XIAP non IRES (C), Bcl-xL (D), e XIAP IRES (E) mRNA relativi a quella della GAPDH è mostrato come la percentuale di mRNA totale (% mRNA) di ogni frazione. (F) fissa livelli di mRNA -state sono stati misurati mediante RT-qPCR in PDCD4 siRNA o di controllo (CTRL) siRNA cellule trattate. (G) I lisati da (A) sono stati anche sottoposti ad analisi Western Blot con anticorpi anti-XIAP, anti-Bcl-xL, e anticorpi anti-nucleolina. (NB. I dati presentati nella figura 1 sono stati originariamente pubblicati in 12) Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussione

Profilatura polisomale è una tecnica potente che consente la quantificazione dello stato della traduzione di trascritti specifici in diverse condizioni di trattamento. Si tratta di una tecnica molto semplice principio che tuttavia richiede diverse fasi di esecuzione, alcune delle quali sono critici per la produzione di buoni profili polisoma. Questi passaggi chiave sono: 1) uso di prodotti chimici RNase-free e plasticware, 2) la preparazione di ottimi gradienti di saccarosio (nella nostra esperienza un 10-50% gradienti di saccarosio funzionano meglio per risolvere in modo efficiente 40 / 60S subunità e mRNA con ribosomi legato), e 3 ) utilizzando cellule che sono in crescita esponenziale e non confluenti oltre l'80%, al fine di catturare i più alti tassi di traduzione. Quest'ultimo passo dovrebbe essere presa in considerazione quando si fa trattamenti lunghi cellulari, come knockdown gene o sovraespressione, in modo che la quantità di cellule per piastra sarà una funzione di quanto le cellule saranno confluenti al punto finale.

Nei risultati presented qui, polisoma analisi del profilo è stato uno strumento importante per valutare il ruolo PDCD4 nella regolazione traduzione dei IRES-mRNA ospitano XIAP e Bcl-xL 12. Il fatto che non abbiamo osservato alcun cambiamento nei profili generali polisoma su PDCD4 knock-down (Figura 1B) ci ha permesso di concludere che PDCD4 non ha compromesso traduzione globale cellulare nelle condizioni dell'esperimento. Abbiamo poi utilizzato l'analisi di RT-qPCR per determinare la distribuzione del XIAP e Bcl-xL mRNA in cellule trattate con PDCD4 o siRNA di controllo. qPCR è un metodo di scelta per analizzare profili polisoma, rispetto allo standard di RT-PCR o Northern blotting, perché permette di quantitativa piuttosto che un'analisi semi-quantitativa della distribuzione mRNA e per la rilevazione di sottili variazioni nell'efficienza traslazionale tra i trattamenti. Utilizzando questa tecnica, siamo stati in grado di dimostrare che la distribuzione delle XIAP e Bcl-xL mRNA (espresso come percentuale del target totale mRNA in tutto il gradient) era significativamente spostato in poliribosomi pesanti (mRNA con un gran numero di ribosomi ad essi associati) dopo PDCD4 knock-down (Figura 1D, E), indicando così un aumento di definizione di questi mRNA. Ciò è stato ulteriormente confermato da un aumento XIAP e Bcl-xL livelli di proteina, ma non nei loro livelli di RNA allo stato stazionario (Figura 1F, G). È importante sottolineare che la distribuzione polisoma della variante non-IRES di XIAP è rimasta invariata tra le cellule trattate e non trattate (Figura 1C). In alternativa, l'efficienza traduzionale potrebbe essere presentato come un rapporto di contenuto di mRNA in polisomi (solitamente frazioni 5 a 10) rispetto monosomes (solitamente frazioni 2 a 4) 14.

L'uso dei controlli in tutta il protocollo è importante nel convalidare qualsiasi polisoma risultato profiling, come picchi osservati dalle letture di assorbanza a 254 nm non possono da soli essere attribuito ad RNA ribosomiale (detergentes, come Triton X-100 fortemente assorbono in questa regione dello spettro e possono oscurare 40 / 60S picchi nella parte superiore del gradiente). Sfumature in bianco, senza lisato e / o con tampone lisato devono essere eseguiti per determinare il contributo relativo dei buffer per l'assorbanza a 254 nm. Artefatti strutture di ordine superiore possono anche portare a interpretazioni errate di polisomi dove ci sono in effetti nessuno (ad esempio, "pseudo-polisomi" 20). Sequestranti magnesio (utilizzato durante tutta la procedura di stabilizzare ribosomi 80S) con l'EDTA cationi bivalenti chelante aggiunti lisati e al buffer gradiente (20 mM per 15 min) provoca la separazione del ribosoma nei suoi componenti piccoli (40S) e grandi (60S ) subunità. Pertanto, se i picchi di assorbanza a 260 nm registrati sono infatti polisomi, trattamento EDTA collasserà il profilo tale osserverà una singola massima nella parte superiore del gradiente che corrisponde a liberare mRNA e unità ribosomiale (dati non mostrati). Coincidentecon EDTA indotta crollo del profilo, tutti gli obiettivi specifici analizzati da qPCR occorre ora trovato nella parte superiore del gradiente.

Il numero dei ribosomi associati ad un mRNA non è sempre un indicatore di quanto efficientemente quel particolare mRNA viene tradotto. Infatti, ci sono contesti specifici in cui traduzione attiva su polisomi diventa stallo 21,22 che il lettore dovrebbe essere a conoscenza. Determinare se trascrizioni sono attivamente impegnati con i macchinari di traduzione può essere fatto da a) trattando il campione con puromicina, che a differenza di EDTA, provoca 'run-off' di ribosomi che sono attivamente translocating in un mRNA, oppure b) il trattamento del campione con homoharringtonine che inibisce la traslocazione di solo il primo ribosoma al codone di inizio, di nuovo causando 'run-off' di tutti i ribosomi translocating a valle.

L'uso di trascritti di controllo per l'analisi qPCR è anche critico. Il Seleczione di trascrizioni che non sono affetti da diverse condizioni di trattamento come alcuni geni housekeeping (GAPDH, actina, tubulina Nucleolina), mRNA ribosomali (18S, RPL13A) o in questo caso la variante non-IRES del XIAP IRES, è importante in verificare se l'effetto del trattamento sulla traduzione è specifica o generalizzata. Queste trascrizioni di controllo possono essere utilizzati per normalizzare la distribuzione dei mRNA analizzati come è stato fatto qui (XIAP e Bcl-xL mRNA sono stati normalizzati per GAPDH mRNA e espressa in percentuale del contenuto totale di mRNA rappresentato dalla somma del contenuto di mRNA in ogni frazione ) o, in alternativa, di destinazione e di controllo mRNA possono essere espressi come valori assoluti ed esposti separatamente. analisi qPCR dei lisati ingresso (solitamente il 10% del volume totale) è un altro passo che il controllo della distribuzione di specifici mRNA. Idealmente, il contenuto di un trascritto di mRNA specifico nel lisato ingresso dovrebbe essere paragonabile alla somma del contenuto di mRNA in tutte le 10 frazioni analizzati. Infine, Un passaggio facoltativo per il controllo per il fenolo: cloroformio fase di estrazione è a picco ogni frazione polisoma con un in vitro trascritto mRNA giornalista (come CAT, cloramfenicolo acetil transferasi) che verrà successivamente quantificato qPCR e può anche essere usato per normalizzare la dati 14.

Come con qualsiasi tecnica, la profilatura polisoma presenta alcune limitazioni. Il fatto che di solito un minimo di 10 frazioni (cambiamenti più sottili di efficienza di traduzione può richiedere 20 o più) devono essere raccolti in modo da avere distribuzioni polisoma curato rende questo passaggio limitante, nel senso che solo un massimo di 4 campioni può essere analizzati alla volta per poter gestire comodamente estrazione dell'RNA e analisi qPCR di 40 campioni e controlli di ingresso 4 alla volta. La dimensione del campione può facilmente aggiungere il passo con il numero di trascrizioni devono essere analizzati e il numero di qPCR replica di fare, e questo può essere costoso. Un altro limite di una base-qPCR polisomale profiling unnalisi è che può essere fatto solo su un approccio basato candidato (dove i trascritti da analizzare sono noti in anticipo) e non possono essere applicati per l'analisi dell'intero genoma di traduzione. Tuttavia, all'inizio del 21 ° secolo, gli investigatori hanno cominciato a interrogare i loro RNA polisomale a livello genomico mediante DNA microarrays 15 e più recentemente con sequenziamento di prossima generazione 16,17. In questo approccio potente, profilazione polisomale viene eseguita come descritto in questo protocollo la differenza che, invece di effettuare analisi qPCR delle singole frazioni, monosomes frazioni (frazioni di solito 2-4) e polisomi frazioni (di solito frazioni) sono raggruppati insieme e variazioni nella traduzione globale analizzati da DNA microarray o dell'intero genoma RNA sequencing. Quindi con questo approccio, è possibile valutare tutti gli mRNA la cui distribuzione si sposta dal polisomi a monosomes (diminuzione in traduzione) o viceversa (aumento in traduzione) su un trattamento specificomento. Validazione e quantificazione di specifica distribuzione polisomi di mRNA possono quindi essere fatto da qPCR. Un uso ancora più potente del principio polisomale profiling è profiling ribosoma. Ulteriore estensione alto rendimento di questa tecnica è stato segnalato di recente che consente il monitoraggio simultaneo di centinaia di polisoma 23 frazioni. Ciò fornisce un chiaro vantaggio quando sondare l'efficienza traslazionali delle collezioni mutanti o in una grande scala schermi RNAi. Profiling ribosoma è una tecnica che si avvale di sequenziamento di nuova generazione per mappare frammenti di RNA protetti da ribosomi (impronte ribosoma) impegnati nella sintesi proteica 24,25. In questa tecnica, traslocazione ribosoma può essere inibita con cicloeximide (reversibile) o emetine (irreversibile) seguita da lisi cellulare e la digestione RNasi per produrre una popolazione di impronte ribosoma. I ribosomi sono arricchiti, l'RNA totale è isolato, e contaminando ribosomiale e RNA ribosomiale mitocondriale viene rimosso.Impronte di RNA di circa 26-28 nucleotidi sono isolati, a trascrizione inversa, trasformato in una libreria di cDNA e sequenziati 26. A differenza di profilazione polisoma di serie, questo approccio non solo identifica specifici mRNA che sono regolati traslazione, ma produce anche informazioni mRNA specifico per una risoluzione di codone, come l'occupazione e la densità esatta di ribosomi lungo una trascrizione specifico. Ciò è particolarmente interessante per mRNA con specifiche modalità di traduzione, come mRNA IRES-ospitano, in quanto potrebbe dare più informazioni su dove sulla trascrizione ribosoma-reclutamento si sta verificando.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Siamo grati ai membri passati e presenti del laboratorio, in particolare Urszula Liwak, per la discussione critica riguardante i protocolli di profilazione dei polisomi e la condivisione dei dati. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni operative degli istituti canadesi di ricerca sanitaria, della Cancer Research Society e del National Science and Engineering Research Council of Canada a MH. MDF è stata sostenuta dal Vanier Canada Graduate Scholarship Doctoral Award e dall'Ontario Graduate Scholarship, e questo lavoro fa parte della sua tesi di dottorato.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Gradient Master 108 creatore di gradienti automatizzatoBIOCOMP107-201M
Auto Densi-Flow creatore di gradienti a due camereLABCONCO4517000
Beckman Ultracentrifuge Beckman CoulterModello # L-100-XP
Fraction FractionatorTELEDYNE ISCO69-3873-246Composto da: sistema di perforazione del tubo, pompa peristaltica, rivelatore UA-6 con filtri da 254 e 280 nm e collettore di frazioni Foxy R1
Software di acquisizione dati WinDaqDATAQ INSTRUMENTSWINDAQ/LITE
http://www.dataq.com/products/software/acquisition.htmProvette per ultracentrifuga Pollyallomer (per SW41, 14 x 89 mm)Beckman Coulter331372
(naso di delfino)daDiaMed PRE1900-N
(fondo piatto)SafeSeal12000
Saccarosio (senza nucleasi)Calbiochem573113MW = 342,3 g/mol
CycloheximideSIGMAC7698MW = 281,4 g/mol. Risospendere in DMSO e mantenere a -80C per sotrage a lungo termine. Attenzione: TOSSICO! Può causare vie respiratorie e irritazione della pelle. Indossare la mascherina durante la pesatura.
Cloruro di sodio (senza nucleasi)OmniPur7710MW = 58,44 g/mol
MgCl2.6H2O (senza nucleasi)OmniPur5980MW = 203,3 g/mol
Tris Base (senza nucleasi)J.T. Baker4109-01MW = 121,14 g/mol
Triton X-100OmniPur9400Attenzione: TOSSICO! Può causare vie respiratorie e irritazione cutanea
RNasina ribonucleasi ricombinante InibitorePromegaN2515
RNaseZap Soluzione di inattivazione della RNnasiAmbion, Life TechnologiesAM9780
GlycoBlue Coprecipitante (15 mg/ml)Invitrogen, Life TechnologiesAM9516
Acido-Fenolo:Cloroformio, pH 4,5 (con IAA, 125:24:1)Ambion, Life TechnologiesAM9722Attenzione: TOSSICO ! Può causare irritazione del tratto respiratorio, nonché irritazione e corrosione della pelle
Provette da centrifuga da 2 ml senza nucleasi Provette da centrifuga 2 ml senza nucleasi

Riferimenti

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