Articolo metodologico

In vitro Caratterizzazione funzionale del topo colorettale Afferent Endings

DOI:

10.3791/52310

⸱

21 gennaio 2015

 , 
1Center for Pain Research, Department of Anesthesiology, University of Pittsburgh

In questo articolo

Sommario

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Questo video dimostra un protocollo per condurre registrazioni elettrofisiologiche a fibra singola su un preparato di nervo colorettato di topo in vitro.

Abstract

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Questo video dimostra in dettaglio una singola fibra protocollo registrazione elettrofisiologica in vitro utilizzando un preparato del mouse colon-retto-nervo. L'approccio permette l'identificazione imparziale e caratterizzazione funzionale delle singole afferenze del colon-retto. Registrazioni extracellulari di potenziali d'azione propagate (AP) che provengono da uno o pochi afferente (cioè, singolo-fibra) campi recettivi (RFS) del colon-retto sono costituiti da fasci di fibre nervose presi in giro. Il colon-retto viene rimosso sia con il bacino (PN) o splanchnic lombare (LSN) nervo collegato e aperta longitudinalmente. Il tessuto viene posto in una camera di registrazione, bloccato piatta e perfuso con soluzione di Krebs ossigenata. Stimolazione elettrica focale viene utilizzato per individuare le terminazioni afferenti colorettali, che vengono ulteriormente testati da tre stimoli meccanici distinti (smussare sondaggio, mucosa carezze e tratto circonferenziale) di categorizzare funzionalmente le afferenze in cinque mechanosensiclassi tive. Endings rispondono a nessuno di questi stimoli meccanici sono classificati come afferenze meccanico-insensitive (MIAS). Sia meccanosensibili e MIAS possono essere valutati per la sensibilizzazione (ad esempio, la risposta maggiore, soglia ridotta, e / o acquisizione di mechanosensitivity) per esposizioni localizzate del RFs ai prodotti chimici (per esempio, la zuppa infiammatoria (IS), la capsaicina, l'adenosina trifosfato (ATP)). Descriviamo l'apparecchio e la preparazione registrazione colorectum-nervo, raccolta di colon-retto con annesso PN o LSN, identificazione del RFs nel colon-retto, registrazione singola fibra da fasci nervosi, e l'applicazione localizzata di prodotti chimici per l'RF. Inoltre, le sfide della preparazione e l'applicazione di stimolazione meccanica standardizzati vengono anche discussi.

Introduzione

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Il dolore e ipersensibilità sono le lamentele predominanti dei pazienti affetti da disturbi gastrointestinali funzionali, tra cui la sindrome dell'intestino irritabile (IBS), che esistono in assenza di apparenti cause patobiologico o danni ai tessuti. Ad esempio, i pazienti IBS presentano ipersensibilità, comprese reazioni accresciute a rettale distensione palloncino e una maggiore sensibilità durante la normale funzione intestinale, così come ipersensibilità di rinvio somatiche (ossia, la tenerezza alla palpazione della zona addominale) 1. Perché il targeting afferenze colorettali ha dimostrato di essere efficace per alleviare il dolore e ipersensibilità in pazienti con IBS (ad esempio, l'instillazione intra-rettale di anestetici locali 2,3; ingestione orale della guanilato ciclasi C-agonisti linaclotide 4-6), una migliore comprensione della innervazione afferente del colon-retto è importante.

Afferenze viscerali, tra cui afferenze del colon-retto, Sono in grado di rispondere alle modalità chimici / di nutrienti e termiche (ad esempio, 7-9). Tuttavia, afferenze viscerali che rispondono a stimoli meccanici (cioè, afferenze meccanosensibili) sono stati i più studiato a fondo, perché gli stimoli meccanici (ad esempio, distensione luminale, tratto) sono quelle che generalmente danno luogo a sensazioni coscienti, tra cui il disagio e il dolore 10-16. Inoltre, i visceri sono innervate da afferenze meccanicamente insensibili (MIAS), comunemente definiti silenziosi o dormire nocicettori 17. In condizioni fisiologiche normali, MIAS non rispondere alla stimolazione meccanica o abbia una grande risposta soglie 18, ma possono diventare attivi e acquisire mechanosensitivity in condizioni fisiopatologiche e contribuire alla ipersensibilità.

Utilizzando la preparazione in vitro e il protocollo descritto qui, abbiamo sviluppato ed impiegato una strategia di stimolo elettrico al mare RCH per terminazioni ricettive, atti a identificare imparziale di entrambe le terminazioni meccanosensibili e MIA nel colon-retto 19. L'innervazione del colon-retto è derivato da splanchnic lombare (LSN) e del nervo pelvico (PN) percorsi, e include afferenze del colon che possono essere classificati in cinque classi meccanosensibili (sierose, mucose, muscoloso, muscoloso-mucosa, mesenterici) e una classe MIA 20. Utilizzando questa preparazione in vitro, abbiamo scoperto che MIAS colorettali mechanosensitivity acquisita (sensibilizzazione) a seguito di una breve esposizione dei loro campi recettivi ad una zuppa infiammatoria (IS), che ha sensibilizzato il 71% del MIAS nella via PN e il 23% del MIAS nella via LSN 19. Abbiamo anche documentato sensibilizzazione a lungo termine (fino a 28 giorni) del MIAS nel contesto di lunga durata ipersensibilità viscerale comportamentale (cioè, nei topi che ricevono trattamenti intracolonic con zymosan 21 o acido 2,4,6-trinitrobenzensulfonico (TNBS) 22) .

jove_content "> Tra afferenze meccanosensibili, afferenze muscolari e muscolo-mucose sono le uniche classi che tonicamente codificano tratto circonferenziale del colon-retto (cioè, sono stiro-sensitive) e Subserve la codifica dei nocivi distensione colorettale 23,24. Utilizzando un controllato dal computer Attuatore di forza, abbiamo applicato uno standard, omogenea, e riproducibile tratto rampa in direzione circonferenziale del tessuto colorettale appiattita e ulteriormente classificati afferenti tratto-sensibili, bassa soglia e ad alta soglia 23. Inoltre, l'andamento temporale della sensibilizzazione di stiramento afferenze -sensitive dopo zymosan intracolonic 21 o 22 TNBS trattamento corrisponde alla insorgenza, la persistenza, e / o il recupero dei comportamentale ipersensibilità viscerale, suggerendo un ruolo di afferenze colorettali tratto sensibile nel dolore viscerale e ipersensibilità.

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Protocollo

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NOTA: Questo protocollo è stato esaminato e approvato dalla University of Pittsburgh Istituzionale Animal Care and Use Committee.

1. Preparazione della soluzione di Krebs Modified e Drug Test Aliquote

  1. Rendere 6 L di soluzione di Krebs modificato contenente (in mM): NaCl 117,9, 4.7 KCl, 25 NaHCO 3, 1.3 NaH 2 PO 4, 1.2 MgSO4, CaCl 2 2,5, 11,1 D-glucosio, 2 butirrato di sodio, acetato di sodio 20 , 0.004 nifedipina (per bloccare le contrazioni muscolari spontanee), e 0,003 indometacina (per bloccare la sintesi di prostaglandine endogene). Utilizzare soluzioni Krebs ghiaccio freddi e caldi per la dissezione dei tessuti e la registrazione singola fibra, rispettivamente.
  2. Preparare eventuali soluzioni chimiche (ad esempio, IS, la capsaicina, ATP) in aliquote a concentrazioni desiderate.

2. Dissezione del Tissue colon-retto-nervo

  1. Anestetizzare e eutanasia topi maschi (6 - 8 settimane di vita, 20 - 30 g) inuna camera di CO 2 ad una velocità di flusso che sposta 10 - 30% del volume della camera per minuto fino topi smettere di respirare completamente come indicato dall'assenza di movimento del torace.
  2. Immediatamente dopo l'eutanasia, Exsanguinate tagliando aperta camera toracica, perforando l'atrio destro, e immergendo la carcassa del mouse in un ampio volume di (~ 500 ml) di ghiacciata soluzione Krebs (4 ° C) gorgogliare con CarboGen (95% O 2 , 5% di CO 2).
  3. Rimuovere accuratamente tutti i visceri, ma gli organi del colon e pelvica. Transetto il mouse nella metà attraverso il segmento vertebrale T12 leggermente sopra il diaframma toracico e trasferire il mezzo caudale di una camera di dissezione contenente ghiacciata, bolle soluzione Krebs.
  4. Sotto uno stereomicroscopio, rimuovere la vescica e gli organi riproduttivi per sezionare i loro incroci per l'uretra, e rimuovere la discesa / aorta addominale fino a quando non si biforca nelle arterie iliache comuni. Liberare il PN o il LSN dal loro surrounding tessuti per via smussa e seguire il nervo da fuori cresta iliaca fino al suo punto di ingresso ventrale nel L6 e S1 la colonna vertebrale (per PN) o T13 e L1 la colonna vertebrale (per LSN).
  5. Tagliare la sinfisi pubica e destra e giunti acetabolari sinistra, e togliere l'osso iliaco. Gratuito con attenzione sia la PN o LSN dal muscolo attaccato e del tessuto connettivo dal vicino al colon-retto fino dove il nervo entra la colonna vertebrale.
  6. Resecare attentamente l'osso iliaco per esporre il colon-retto distale. Sezionare il colon-retto distale con il PN collegato o LSN in continuum.
  7. Trasferire il colon retto con il nervo allegata al vano bagno di camera di tessuti. Rimuovere eccessivo tessuto connettivo da ulteriori dissezione, e aprire il colon-retto longitudinalmente lungo il confine anti-mesenterica.
  8. Con lato mucosa rivolto verso l'alto, pin bordo mesenterica del colon-retto adiacente al vano di registrazione nella base di silicone della chamber e fissare la lunghezza del colon-retto antimesenterico ad un rastrello di ganci collegati ad un attuatore forza (illustrata nella figura 1 e fotografato in Figura 2A).
  9. Estrarre il PN o LSN nel vano registrazione, che è collegato al vano vasca da un foro mouse e cancello. Adagiare il tronco nervoso su un piccolo specchio di vetro nel vano registrazione, che fornisce una superficie idrofila per il nervo di aderire. Superfuse vano bagno con calda (30 - 32 ° C), soluzione di Krebs ossigenata e riempire il vano di registrazione con olio minerale.

3. Single-fibra Registrazione e localizzazione del campo recettivo

  1. Rimuovere con cautela indietro il epinevrio (guaina del nervo) dal PN o LSN allo stereomicroscopio ad alto ingrandimento (50 - 60X). Utilizzando una pinza sottile, prendere in giro il tronco nervoso in 5-8 fasci nervosi di ~ 100 micron di spessore.
  2. Collocare il platino-iridioelettrodi a contatto con la soluzione Krebs nella camera tessuti. Posizionare in sequenza i singoli fasci nervosi sull'elettrodo registrazione fatta dello stesso materiale.
  3. Usare un pennello morbido per evocare gli AP delle afferenze colorettali delicatamente accarezzando su e giù per la superficie del colon-retto. Individuare il fascio nervoso (s) che innervano il colon attraverso rilevabile AP (potenziale d'azione) registrazioni.
    NOTA: Il PN e LSN anche innervano la vescica urinaria e di altri organi pelvici.
  4. Utilizzare un paio di 30 punte degli aghi G di dividere ulteriormente il fascio nervoso in sottili filamenti fascicolo di ~ 10 micron di spessore e posizionare un individuo filamento sul elettrodo di registrazione.
  5. Posizionare l'elettrodo concentrico con punta arrotondata perpendicolare alla superficie della mucosa per eccitare elettricamente terminazioni afferenti a intensità suprathreshold stimolo (10 mA magnitudo 0,5 durata msec @ 0,3 Hz), che produce un mm di raggio di diffusione attuale ~ 2. Spostare l'elettrodo sistematicamente (~ 1,5 mm passi) Lungo la lunghezza e la larghezza del colon-retto appiattita localizzare terminazioni ricettive.
  6. Quando un desinenza afferente è eccitato, regolare la posizione degli elettrodi di individuare il sito di attivazione (campo recettivo, RF) che richiede intensità dello stimolo minimo (soglia di stimolo). Scartare terminazioni con una soglia di stimolo> 3 mA 19.
  7. Calcolare la velocità di conduzione (CV) da 1) la distanza tra l'elettrodo di stimolazione al campo recettivo (RF) e il sito registrazione e 2) il ritardo di conduzione (ad esempio, la Figura 2B) tra il manufatto stimolo e l'inizio del potenziale d'azione .
    CV (m / sec) = distanza (mm) / ritardo di conduzione (msec).

4. Classificazione funzionale di meccanosensibili colorettale afferenze

  1. Dopo aver individuato un RF da stimolazione elettrica, si applicano le seguenti tre stimoli meccanici alla RF:
    1. Effettuare lo stimolo tastatura premendo la punta di un calibramonofilamento ted von Frey-come il nylon (0,4 e 1 g di forza) perpendicolarmente verso la RF sul colon-retto appiattita.
    2. Effettuare lo stimolo accarezzando accarezzando delicatamente la mucosa del colon-retto con un bel filo di nylon filamento (10 mg forza) per generare un piccolo sforzo di taglio superficiale alla RF.
    3. Condurre il tratto circonferenziale con una forza attuatore controllato dal computer, che offre una forza tratto rampa (0-170 milioni di euro a 5 mN / sec) in direzione circonferenziale lungo il bordo anti-mesenterica del colon-retto attraverso la rake di ganci descritti al punto 2.8 .
  2. Classificare afferenze come sierose (solo rispondere a smussare sondare), della mucosa (rispondere alle mucose accarezzare e smussare sondare), muscolare (rispondere tratto circonferenziale e smussare sondare) muscolare / mucose (rispondere tratto circonferenziale, mucosa carezze e smussare sondare), o MIA (non reattivo a qualsiasi dei tre stimoli meccanici).
  3. Per afferenze mesenterici (solo inl'innervazione LSN), che sono difficili da attivare selettivamente dalla stimolazione elettrica, individuare le loro terminazioni ricettive da accarezzare meccanica / sondare del mesentere.
  4. Per afferenze tratto sensibili (muscolare e muscolo-mucose), determinare la soglia di risposta, che è definita come la forza che evoca il primo AP durante tratto rampa.
  5. Per afferenze sierose, registrare le loro risposte alla crescente livelli di puntata sondare il campo recettivo guidato dalla forza attuatore controllato dal computer.

5. Chemical Applicazione / Modulazione di Endings ricettive

  1. Registrare una risposta di base ad uno stimolo meccanico (cioè, la risposta al tratto rampa, puntata di sondaggio, o mucose carezze).
  2. Coat il bordo inferiore di un pezzo di tubo (ottone o acciaio inossidabile, altezza 10 mm e 4 x 4 mm 2 quadrata o 4 - diametro di 5 mm) con vaselina e posizionarlo sopra il campo recettivo sul colon-retto.
  3. Rimuoverela soluzione Krebs all'interno del tubo, ed esporre il finale ricettivo da 3 - 5 minuti a 170 microlitri della soluzione contenente la sostanza chimica (s) da testare.
  4. Monitorare la risposta del afferente durante l'applicazione chimica (alcune afferenze sono chemiosensibile).
  5. Rimuovere la soluzione chimica e il tubo di interrompere l'azione della sostanza chimica. Da 4 - 6 min, testare la risposta afferenti allo stesso stimolo meccanico nella risposta basale.
  6. Riapplicare di nuovo lo stimolo meccanico dopo periodo sufficiente di wash-out (> 15 min).

6. picchi Registrazione e discriminante AP

  1. Digitalizzare i segnali elettrici registrati da assoni a 20 kHz e salvare i dati su un computer. Monitorare il segnale in linea da un monitor audio.
  2. Analizzare le punte AP off-line e discriminare singole unità basate su analisi delle componenti principali delle singole forme d'onda picco 25.
    NOTA: Un record deve contenere non più thun due unità attive facilmente discriminabili.

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Risultati

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La configurazione è illustrata nella figura 1. Esso comprende una camera di tessuto su misura che ospita il colon retto in un vano vasca silicone rivestito e il nervo attaccato in un vano d'olio minerale contigui. La camera a due compartimenti stato lavorato da un blocco solido di plastica acrilica da una macchina CNC; il fondo di entrambi gli scomparti è stato successivamente rivestito con silicone ferma per consentire una facile pin giù del tessuto colorettale. AP extracellulari da fasci nervosi presi...

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Discussione

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La vitro preparazione colon-retto-nervo qui descritta ha dimostrato di essere un approccio efficace per studiare le funzioni di codifica neurale delle singole afferenze del colon-retto, che integra ben altri approcci non funzionali (ad esempio, studi cellulari, molecolari e istologiche) sui neuroni sensoriali viscerali ( vedi recensione 27 per i dettagli). Meccanismi neuronali che contribuiscono alla nocicezione e ipersensibilità colorettale a lungo termine sono stati rivelati e man...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Supportato dal premio NIH R01 DK093525 (GFG). Apprezziamo molto la revisione scientifica e l'editing grammaticale del manoscritto da parte della dottoressa Amber Shaffer (Università di Pittsburgh) e ringraziamo Michael Burcham per l'assistenza nella preparazione delle figure.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Stereomicroscopio Leica MZ16Leica Microsystems Inc.
Fotocamera Leica IC DLeica Microsystems Inc.
AmplificatoreMondo Strumenti di precisione, Inc.SYS-DAM80Amplificatore differenziale a basso rumore
Camera tissutale a due compartimentiSu
Power1401Cambridge Electronic Design LimitedPower1401Acquisizione dati, ingresso/uscita segnale analogico
Spike2 v5.02Cambridge Electronic Design LimitedPacchetto software che funziona con il monitor audio Power1401
NatusAm
Stimolatore a impulsi quadratiNatusS48Per erogare stimoli elettrici
Unità di isolamento fotoelettricoNatusPSIU6Isolamento dello stimolo per ridurre il rumore
Microelettrodo bipolare concentricoFHC Inc.CBFFG75Per erogare stimoli elettrici
Sistema a leva a doppia modalitàAurora Scientific Inc.Serie 300CPer erogare stimoli meccanici
PinzeStrumenti per la scienza fine11252-00Pinze con punte fini
misura8

Riferimenti

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