Questo video dimostra un protocollo per condurre registrazioni elettrofisiologiche a fibra singola su un preparato di nervo colorettato di topo in vitro.
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Articolo metodologico
In vitro Caratterizzazione funzionale del topo colorettale Afferent Endings
In questo articolo
Sommario
Abstract
Questo video dimostra in dettaglio una singola fibra protocollo registrazione elettrofisiologica in vitro utilizzando un preparato del mouse colon-retto-nervo. L'approccio permette l'identificazione imparziale e caratterizzazione funzionale delle singole afferenze del colon-retto. Registrazioni extracellulari di potenziali d'azione propagate (AP) che provengono da uno o pochi afferente (cioè, singolo-fibra) campi recettivi (RFS) del colon-retto sono costituiti da fasci di fibre nervose presi in giro. Il colon-retto viene rimosso sia con il bacino (PN) o splanchnic lombare (LSN) nervo collegato e aperta longitudinalmente. Il tessuto viene posto in una camera di registrazione, bloccato piatta e perfuso con soluzione di Krebs ossigenata. Stimolazione elettrica focale viene utilizzato per individuare le terminazioni afferenti colorettali, che vengono ulteriormente testati da tre stimoli meccanici distinti (smussare sondaggio, mucosa carezze e tratto circonferenziale) di categorizzare funzionalmente le afferenze in cinque mechanosensiclassi tive. Endings rispondono a nessuno di questi stimoli meccanici sono classificati come afferenze meccanico-insensitive (MIAS). Sia meccanosensibili e MIAS possono essere valutati per la sensibilizzazione (ad esempio, la risposta maggiore, soglia ridotta, e / o acquisizione di mechanosensitivity) per esposizioni localizzate del RFs ai prodotti chimici (per esempio, la zuppa infiammatoria (IS), la capsaicina, l'adenosina trifosfato (ATP)). Descriviamo l'apparecchio e la preparazione registrazione colorectum-nervo, raccolta di colon-retto con annesso PN o LSN, identificazione del RFs nel colon-retto, registrazione singola fibra da fasci nervosi, e l'applicazione localizzata di prodotti chimici per l'RF. Inoltre, le sfide della preparazione e l'applicazione di stimolazione meccanica standardizzati vengono anche discussi.
Introduzione
Il dolore e ipersensibilità sono le lamentele predominanti dei pazienti affetti da disturbi gastrointestinali funzionali, tra cui la sindrome dell'intestino irritabile (IBS), che esistono in assenza di apparenti cause patobiologico o danni ai tessuti. Ad esempio, i pazienti IBS presentano ipersensibilità, comprese reazioni accresciute a rettale distensione palloncino e una maggiore sensibilità durante la normale funzione intestinale, così come ipersensibilità di rinvio somatiche (ossia, la tenerezza alla palpazione della zona addominale) 1. Perché il targeting afferenze colorettali ha dimostrato di essere efficace per alleviare il dolore e ipe....
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Protocollo
NOTA: Questo protocollo è stato esaminato e approvato dalla University of Pittsburgh Istituzionale Animal Care and Use Committee.
1. Preparazione della soluzione di Krebs Modified e Drug Test Aliquote
- Rendere 6 L di soluzione di Krebs modificato contenente (in mM): NaCl 117,9, 4.7 KCl, 25 NaHCO 3, 1.3 NaH 2 PO 4, 1.2 MgSO4, CaCl 2 2,5, 11,1 D-glucosio, 2 butirrato di sodio, acetato di sodio 20 , 0.004 nifedipina (per bloccare le contrazioni muscolari spontanee), e 0,003 indometacina (per bloccare la sintesi di prostaglandine endogene). Utilizzare soluzioni Krebs ghiaccio fr....
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Risultati
La configurazione è illustrata nella figura 1. Esso comprende una camera di tessuto su misura che ospita il colon retto in un vano vasca silicone rivestito e il nervo attaccato in un vano d'olio minerale contigui. La camera a due compartimenti stato lavorato da un blocco solido di plastica acrilica da una macchina CNC; il fondo di entrambi gli scomparti è stato successivamente rivestito con silicone ferma per consentire una facile pin giù del tessuto colorettale. AP extracellulari da fasci nervosi p.......
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Discussione
La vitro preparazione colon-retto-nervo qui descritta ha dimostrato di essere un approccio efficace per studiare le funzioni di codifica neurale delle singole afferenze del colon-retto, che integra ben altri approcci non funzionali (ad esempio, studi cellulari, molecolari e istologiche) sui neuroni sensoriali viscerali ( vedi recensione 27 per i dettagli). Meccanismi neuronali che contribuiscono alla nocicezione e ipersensibilità colorettale a lungo termine sono stati rivelati e man.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Supportato dal premio NIH R01 DK093525 (GFG). Apprezziamo molto la revisione scientifica e l'editing grammaticale del manoscritto da parte della dottoressa Amber Shaffer (Università di Pittsburgh) e ringraziamo Michael Burcham per l'assistenza nella preparazione delle figure.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Stereomicroscopio Leica MZ16 | Leica Microsystems Inc. | ||
| Fotocamera Leica IC D | Leica Microsystems Inc. | ||
| Amplificatore | Mondo Strumenti di precisione, Inc. | SYS-DAM80 | Amplificatore differenziale a basso rumore |
| Camera tissutale a due compartimenti | Su | ||
| Power1401 | Cambridge Electronic Design Limited | Power1401 | Acquisizione dati, ingresso/uscita segnale analogico |
| Spike2 v5.02 | Cambridge Electronic Design Limited | Pacchetto software che funziona con il monitor audio Power1401 | |
| Natus | Am | ||
| Stimolatore a impulsi quadrati | Natus | S48 | Per erogare stimoli elettrici |
| Unità di isolamento fotoelettrico | Natus | PSIU6 | Isolamento dello stimolo per ridurre il rumore |
| Microelettrodo bipolare concentrico | FHC Inc. | CBFFG75 | Per erogare stimoli elettrici |
| Sistema a leva a doppia modalità | Aurora Scientific Inc. | Serie 300C | Per erogare stimoli meccanici |
| Pinze | Strumenti per la scienza fine | 11252-00 | Pinze con punte fini |
Riferimenti
- Naliboff, B. D., et al. Evidence for two distinct perceptual alterations in irritable bowel syndrome. Gut. 41, 505-512 (1997).
- Verne, G. N., Robinson, M. E., Vase, L., Price, D. D. Reversal of visceral and cutaneous hyperalgesia....
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Ristampe e permessi
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