L'obiettivo di questa tecnica è quello di consentire ai ricercatori di eseguire la dissezione, l'immunocolorazione e il montaggio di dischi oculari pupali da Drosophila melanogaster di qualsiasi età.
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Articolo metodologico
Dissezione e Montaggio di
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il disco oculare di Drosophila melanogaster è un potente sistema che può essere utilizzato per studiare molti processi biologici diversi. Contiene circa 800 unità oculari separate, denominate ommatidi1. Ogni ommatidio contiene otto fotorecettori neuronali che si sviluppano da cellule indifferenziate in seguito al passaggio del solco morfogenetico nel terzo stadio larvale2. A seguito della differenziazione sequenziale dei fotorecettori, si sviluppano cellule non neuronali, comprese le cellule coniche e pigmentate, insieme alle cellule setole meccanosensoriali3. I processi finali di differenziamento, tra cui la disposizione strutturata di tutti i tipi cellulari ommatidiali, la morte cellulare programmata di tipi cellulari indifferenziati e l'espressione della rodopsina, avvengono attraverso la fase pupale4-7. Questa tecnica si concentra sulla manipolazione del disco oculare pupale, fornendo informazioni e istruzioni su come sezionare il disco oculare durante la fase pupale, che è intrinsecamente più difficile da eseguire rispetto al disco oculare del terzo stadio comunemente sezionato. Questa tecnica fornisce anche dettagli sull'immunocolorazione per consentire la visualizzazione di varie proteine e altri componenti cellulari.
Introduzione
I campi di biologia dello sviluppo e delle cellule sono stati notevolmente influenzati dalla organismo modello: Drosophila melanogaster. All'interno di questo modello, gli studi del disco occhi hanno contribuito una grande quantità di conoscenze in materia di segnalazione, biologia cellulare e in altri settori. Il terzo disco in ritardo stadio larvale occhio è stato ampiamente studiato ed è un potente modello di utilizzare, in quanto dà una fotografia istantanea di una serie di periodi di sviluppo, ciascuno con le proprie molecole e dei processi di segnalazione unica, come il solco morfogenetica progredisce attraverso il disco occhio 8. Tuttavia, vi è la necessità di ampliare ulteriormente la nostra comprensione dei processi di sviluppo nella fase di pupa dello sviluppo. Mentre ci sono stati studi sul disco occhio pupa 3-7, la nostra conoscenza non si avvicina l'ampiezza del lavoro che è stato eseguito il terzo disco instar occhio. Ciò è dovuto, in parte, alla maggiore difficoltà di sezionare il disco dell'occhio pupa. Pertanto, una presentazione delcorretto metodo di dissezione potrebbe espandere notevolmente la ricerca in questo settore.
Mentre ci sono fasi di sviluppo all'interno di pupa disco occhio che sono facilmente sezionati, in particolare intorno alla metà del periodo di pupa, altri periodi di tempo sono molto più difficili da sezionare. Questo protocollo rappresenta un metodo per sezionare i dischi degli occhi pupa che può essere usato universalmente per tutte le pupe tempi di sviluppo. Questo protocollo può essere utilizzato in alternativa a un altro protocollo 9, che mostra un metodo semplice e veloce per sezionare i dischi occhio dai punti temporali midpupal. Questo protocollo è stato originariamente girato e sviluppato per la formazione di studenti universitari avanzati in Undergraduate Research Consortium UCLA in Genomica Funzionale (URCFG) 10,11 nella tecnica di pupa dissezione dell'occhio. Molti studenti universitari sono stati in grado di utilizzare questo video e metodo per imparare questa tecnica impegnativa.
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Protocollo
Questa procedura è una procedura di 2 giorni.
1 ° giorno (2 ore + tempo di dissezione)
1. pupa Disco Eye Dissection
- Selezionare una pupa per la dissezione.
NOTA: L'età della pupa essere sezionato sarà determinata dalle esigenze sperimentali. Tuttavia, se l'esame di morfologia cellulare, questo è spesso fatto a 42 ore dopo la formazione puparium (APF) a 25 ° C, che è l'età delle pupe mostrato nel video. Raccogliere bianco pupe (considerato APF 0 ore) con un pennello bagnata e disporli in ordine cronologico (in base al tempo di raccolta) in un nuovo flacone mosca cibo mantenuta a 25 ° C. Sezionare il pupe affinato in questo stesso ordine cronologico di mantenere le differenze di tempo tra pupe più vicino possibile. - Trasferire la pupa in una goccia di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS, pH 7,4, vedi materiali per ricetta) su una piastra di dissezione silicone.
- Tenere la parte superiore del case pupa con una pinza e forare e aprire il lparte ower del caso pupa con un paio di pinze taglienti. Rimuovere la pupa dal caso nel foro appena formata.
- Fare un taglio diagonale con le forbici, a metà del torace, in pupa. Rimuovere i detriti o trasferire la testa pupa di una nuova goccia di PBS. Pulire utilizzando il tubo pipetta soffiante (vedi materiali e la Figura 1 per i dettagli) e aggiungere ulteriori PBS, se necessario. Assicurati di evitare la disidratazione.
- Afferrare saldamente la parte superiore della cuticola testa di pupa con un paio di pinze. Utilizzando la punta del tubo soffiatore, premere delicatamente sul caso pupa per estrudere il cervello e altri tessuti, tra cui i dischi degli occhi, fuori dal bozzolo. Essere sicuri di evitare di afferrare qualsiasi tessuto all'interno della cuticola.
- Utilizzando il tubo soffiatore riempito con PBS, soffiare delicatamente il tessuto grasso corporeo e altri detriti fuori del caso testa di separare in modo chiaro e identificare i dischi del cervello e degli occhi.
NOTA: Mantenere il cervello attaccato alla testa caso pupa permetterà ai ricercatori di utilizzare il luicaso ad una "maniglia" per la futura manipolazione del tessuto senza danneggiare i dischi occhi o cervello. Tuttavia, è comune per rimuovere i dischi cervello e degli occhi da quelle della testa e questo non è dannoso per la procedura generale ei risultati. Spesso ci vogliono diversi tentativi di soffiaggio e spingendo per estrarre correttamente i dischi occhi e cervello dall'interno del bozzolo testa e in modo che siano nettamente separate dal tessuto circostante. Il più pulito e più un separato possono ottenere i dischi occhi dal tessuto circostante contribuisce a prevenire i tessuti estranei di fissare ai dischi degli occhi. - Dopo la dissezione, trasferire immediatamente il tessuto di un piatto di vetro 3 bene su ghiaccio con 0,5 ml di soluzione Fix (vedi materiali). Float il tessuto sulla superficie della soluzione Fix per alcuni minuti (in genere il tempo necessario per sezionare il successivo insieme di dischi oculari).
NOTA: Se questo non è il primo disco occhio ad essere sezionato in questo giro di dissezione, completely immergere il disco precedente occhio nella soluzione Fix. Se l'esecuzione di procedure di colorazione speciali (ad esempio, le specie reattive dell'ossigeno, lisosomi, ecc), questo deve essere fatto prima della fissazione. Per fare questo, conservare i dischi occhio sezionato in PBS freddo prima di continuare con il protocollo di colorazione appropriata. - A seguito di dissezione e la sommersione di tutti i dischi degli occhi viene sezionato, spostare il piatto di vetro 3 oltre a un rocker e rock a temperatura ambiente per 30 minuti.
2. Immunostaining
- Rimuovere con cautela la soluzione Fix e aggiungere 0,5 ml di PBS con 0,3% Triton X-100 (0,3% PBT, vedi materiali) e lavare il tessuto su una sedia a dondolo per 10 minuti. Ripetere questa operazione per altre tre volte per un totale di 4 lavaggi (10 min ciascuna).
NOTA: la rimozione accurata della soluzione dal pozzo può essere eseguita sotto un microscopio da dissezione per evitare danni ai tessuti o di perdita. La soluzione può essere aspirato accuratamente con una pipetta; preferiamo un fine-Tipped, pipetta di trasferimento monouso che ha avuto l'apertura appiattita per ridurre la possibilità di aspirare il tessuto. - Alla fine del quarto lavaggio, rimuovere la pulizia e aggiungere 0,5 ml di soluzione di blocco (vedi materiali) al pozzetto ed incubare per 30 min.
NOTA: Questo lasso di tempo può essere esteso in base alle vostre esigenze. - Alla fine del tempo di blocco 30 min, pipettare 10 ml di soluzione di anticorpo primario (diluito in soluzione Block) nel numero appropriato di pozzetti in una micropiastra.
NOTA: Un pozzetto di una micropiastra ospiterà circa 4 coppie di dischi occhi collegati al caso pupa o 8 coppie isolate di dischi occhio con il cervello attaccato. Gli anticorpi primari utilizzati nel presente protocollo per i dati rappresentativi sono anti-fosfotirosina (diluizione 1: 500) e anti-Cut (diluizione 1: 200). - Trasferire il tessuto sezionato nei pozzetti per micropiastre riempiti con la soluzione di anticorpo primario dal piatto di vetro 3 bene.
- Luogola micropiastra su un tovagliolo di carta bagnato (per evitare la disidratazione) in una scatola vuota pipetta punta (o altro contenitore simile) e conservare a 4 ° C per una notte.
2 ° giorno (4 ore + tempo di montaggio)
- Trasferire il tessuto dalla micropiastra in un piatto di vetro 3 bene con 0,3% PBT (≈0.5 ml) e lavare il tessuto per 10 min a bilanciere. Ripetere questa operazione per altre tre volte per un totale di 4 lavaggi (10 min ciascuna)
- Rimuovere l'ultimo lavaggio e aggiungere 0,5 ml di soluzione di blocco al pozzo. Blocco per 30 min.
NOTA: Questo lasso di tempo può essere esteso in base alle vostre esigenze. - Rimuovere la soluzione di blocco e aggiungere 0,5 ml di Soluzione Anticorpi secondaria (a base di anticorpi fluorescente appropriate per il vostro anticorpo primario e lunghezza d'onda fluorescente, diluito in soluzione Block) per il bene e proteggere il piatto di vetro 3 e dalla luce con un coperchio o di alluminio sventare e incubare per almeno 2 ore a cameratemperatura.
NOTA: Tutti i passi successivi devono essere protetti in modo analogo da esposizione alla luce. Questo incubazione può essere estesa a tutta la notte a 4 ° C, in una configurazione simile a quella di incubazione dell'anticorpo primario, ma può essere eseguita anche in un piatto di vetro 3 ben coperta con la pellicola di laboratorio, o una micropiastra qualora la conservazione degli anticorpi è desiderato. - Al termine dell'incubazione anticorpi, rimuovere la Soluzione Anticorpi secondari e aggiungere 0,5 ml di 0,3% PBT al pozzo e lavare il bilanciere per 10 min. Ripetere questo passaggio per un totale di 4 lavaggi (10 minuti ciascuno).
NOTA: Se colorazione DAPI si desidera, prima di iniziare il primo lavaggio, aggiungere 0,5 ml di DAPI soluzione madre (vedi materiali) ai 500 ml di PBT che saranno utilizzati per il primo lavaggio (1: 1.000 diluizione).
3. Montaggio
- Alla fine l'ultimo lavaggio, montare i dischi delle antenne / occhio su un vetrino utilizzando 70% glicerolo o PBS come mezzo per rimuovere il brain e altri tessuti indesiderati in una piscina su un lato della slitta.
- Spostare con attenzione il tessuto con pressione idrostatica tra le pinze, o molto delicatamente con una punta pinza, e allineare i dischi degli occhi in una colonna verso il centro della diapositiva.
- Rimuovere tutti glicerolo estraneo o PBS provenienti da tutto il tessuto (con wicking azione di un laboratorio wipe o la pinza lavorare per questo).
- Mettere una piccola quantità (≈10 ml) di mezzo di montaggio lungo un lato della colonna disco occhi e posizionare un coprioggetto sul tessuto in modo da distribuire la soluzione di montaggio sui dischi oculari.
- Lasciate scivolo sedersi per 1 o 2 minuti per consentire il / mezzo di montaggio tessuto a diffondersi completamente.
- Pulire qualsiasi mezzo di montaggio in più fuori intorno ai bordi del coprioggetto e sigillare con smalto trasparente.
- Cattura immagini fluorescenti dei dischi oculari utilizzando la microscopia confocale.
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Risultati
Come esempio dell'uso di questo protocollo, risultati illustrano midpupal (42 ore APF a 25 ° C) dischi occhio immunostained con anticorpi differenti sono rappresentati nella figura 2. Utilizzando un anticorpo diretto contro residui fosfotirosina, la membrana delle cellule può essere osservati (Figura 2A). Questo può essere utilizzato per identificare la disposizione regolare di celle ommatidial nell'occhio pupa seguenti processi patterning finali che si verificano prima della fase midpupal. Un&#...
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Discussione
Anche se sembra che il processo sia semplice e facile da eseguire, in realtà questa tecnica richiede molta pratica per essere padroneggiata. Di routine, iniziamo gli studenti imparando a sezionare e montare i dischi oculari12 del terzo stadio, che sono molto più facili da lavorare. Questa pratica aiuta a sviluppare un'appropriata posizione di dissezione delle braccia, delle mani e delle dita13 in modo che la manipolazione delle pinze al microscopio da dissezione sia stabile, facile ed esperta. In...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Apprezziamo e vorremmo ringraziare l'Howard Hughes Medical Institute per il premio HHMI Professor a U.B. che ha reso possibile questo progetto. Ringraziamo il college dell'Università della California, Los Angeles, per aver fornito strutture e supporto alle infrastrutture didattiche per questo lavoro. Il lavoro è stato sostenuto anche con finanziamenti dalla Midwestern University e una generosa donazione dal Charity Fidelity Gift Fund. Ringraziamo John VandenBrooks per i commenti sul manoscritto e Krista Pearman per la sua assistenza tecnica.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS, pH 7,4) | 80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na2HPO4, 2,4 g KH2PO4, Porta il volume a 1 μ l, regolare il pH a 7,4, sterilizzare in autoclave o con filtro, diluire a 1x PBS con ddH2O autoclavato prima dell'uso. | ||
| Triton X-100 | Promega | H5142 | Attenzione: irritante! Indossare i guanti. |
| 0,3% PBT | 1,5 ml di Triton X-100, 500 ml 1X PBS. | ||
| Soluzione di formaldeide al 37% | Fisher Scientific | F75P1GAL | Attenzione: Tossico, probabile cancerogeno per l'uomo! Indossa i guanti. |
| Soluzione fissa | (≈ 4% Formaldeide in PBS) 50 μ l di 37% Formaldeide, 450 μ l 1x PBS, preparare fresco prima dell'uso | ||
| Siero di capra normale | Anticorpi Rockland e saggi | B304 | Aliquotare in volumi da 1 ml e conservare a -80 ° |
| Soluzione | 10% NGS in PBT. Questo può essere fatto e conservato a 4 gradi C per alcuni giorni prima dell'uso. | ||
| Soluzione madre DAPI | Life Technologies | D3571 | Per nuclei di colorazione coutner. Preparare una soluzione di 1 mg/ml con ddH2O. |
| VectaShield Montaggio medio | Vector Labs | H-1000 | Supporto di montaggio |
| Glycerol | Sigma | G5516 | Per il montaggio. Preparare una diluizione al 70% con ddH2O. |
| Attrezzatura | |||
| Miscelatore di nutazione | VWR | 82007-202 | Utilizzato per scuotere i tessuti in un piatto di vetro a 3 pozzetti |
| Kit di elastomero siliconico SylGard 182 | Krayden | NC9897184 | Utilizzato per realizzare un piatto di dissezione in silicone |
| Piatto | di dissezione in siliconeMiscelare delicatamente il kit di elastomeri Sylgard (sopra) secondo le indicazioni (per evitare bolle). Versare il composto nella capsula di Petri (di qualsiasi dimensione). Lasciare che SylGard indurisca durante la notte in 37 gradi C incubatrice. | ||
| Piatto di vetro a 3 pozzetti | Corning | 7220-85 | La varietà a 3 pozzetti di questi non è più disponibile, questo è il prodotto a 9 pozzetti. |
| Minivassoio a 72 pozzetti | Nunc | 438733 | |
| Pinze affilate (Dumont #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Micro forbici tipo Vannas, dritte, lama da 5 mm | Ted Pella | 1346 | |
| Capillari in vetro borosilicato da 100 mm | World Precision Instruments | 1B100-4 | Tirare con l'estrattore dell'ago per creare una punta a punta fine che consente il flusso di un piccolo flusso di PBS. |
| Pipette di trasferimento monouso, punta fine | Samco Scientific | 231 | |
| Le dimensioni del tubo indicate sono diametro interno (ID) x diametro esterno (OD) x spessore della parete in pollici | |||
| Tubo in PVC (1/8 x 3/16 x 1/32) | Nalgene | 8000-0010 | Utilizzare questi con ago tirato per assemblare il tubo del soffiatore come mostrato nella Figura 2. |
| Tygon Tubi in silicone (3/32 x 5/32 x 1/32) | Saint Gobain Performance Plastics | ABW00004 | |
| Tygon Tubi in silicone (1/32 x 3/32 x 1/32) | Saint Gobain Performance Plastics | ABW00001 |
Riferimenti
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