L'obiettivo di questa tecnica è quello di consentire ai ricercatori di eseguire la dissezione, l'immunocolorazione e il montaggio di dischi oculari pupali da Drosophila melanogaster di qualsiasi età.
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Articolo metodologico
Dissezione e Montaggio di
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il disco oculare di Drosophila melanogaster è un potente sistema che può essere utilizzato per studiare molti processi biologici diversi. Contiene circa 800 unità oculari separate, denominate ommatidi1. Ogni ommatidio contiene otto fotorecettori neuronali che si sviluppano da cellule indifferenziate in seguito al passaggio del solco morfogenetico nel terzo stadio larvale2. A seguito della differenziazione sequenziale dei fotorecettori, si sviluppano cellule non neuronali, comprese le cellule coniche e pigmentate, insieme alle cellule setole meccanosensoriali3. I processi finali di differenziamento, tra cui la disposizione strutturata di tutti i tipi cellulari ommatidiali, la morte cellulare programmata di tipi cellulari indifferenziati e l'espressione della rodopsina, avvengono attraverso la fase pupale4-7. Questa tecnica si concentra sulla manipolazione del disco oculare pupale, fornendo informazioni e istruzioni su come sezionare il disco oculare durante la fase pupale, che è intrinsecamente più difficile da eseguire rispetto al disco oculare del terzo stadio comunemente sezionato. Questa tecnica fornisce anche dettagli sull'immunocolorazione per consentire la visualizzazione di varie proteine e altri componenti cellulari.
Introduzione
I campi di biologia dello sviluppo e delle cellule sono stati notevolmente influenzati dalla organismo modello: Drosophila melanogaster. All'interno di questo modello, gli studi del disco occhi hanno contribuito una grande quantità di conoscenze in materia di segnalazione, biologia cellulare e in altri settori. Il terzo disco in ritardo stadio larvale occhio è stato ampiamente studiato ed è un potente modello di utilizzare, in quanto dà una fotografia istantanea di una serie di periodi di sviluppo, ciascuno con le proprie molecole e dei processi di segnalazione unica, come il solco morfogenetica progredisce attraverso il disco occhio 8. Tuttav....
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Protocollo
Questa procedura è una procedura di 2 giorni.
1 ° giorno (2 ore + tempo di dissezione)
1. pupa Disco Eye Dissection
- Selezionare una pupa per la dissezione.
NOTA: L'età della pupa essere sezionato sarà determinata dalle esigenze sperimentali. Tuttavia, se l'esame di morfologia cellulare, questo è spesso fatto a 42 ore dopo la formazione puparium (APF) a 25 ° C, che è l'età delle pupe mostrato nel video. Raccogliere bianco pupe (considerato APF 0 ore) con un pennello bagnata e disporli in ordine cronologico (in base al tempo di raccolta) in un nuovo flacone mosca cibo mantenuta a 25 ° C. ....
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Risultati
Come esempio dell'uso di questo protocollo, risultati illustrano midpupal (42 ore APF a 25 ° C) dischi occhio immunostained con anticorpi differenti sono rappresentati nella figura 2. Utilizzando un anticorpo diretto contro residui fosfotirosina, la membrana delle cellule può essere osservati (Figura 2A). Questo può essere utilizzato per identificare la disposizione regolare di celle ommatidial nell'occhio pupa seguenti processi patterning finali che si verificano prima della fase midpupal. Un&#.......
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Discussione
Anche se sembra che il processo sia semplice e facile da eseguire, in realtà questa tecnica richiede molta pratica per essere padroneggiata. Di routine, iniziamo gli studenti imparando a sezionare e montare i dischi oculari12 del terzo stadio, che sono molto più facili da lavorare. Questa pratica aiuta a sviluppare un'appropriata posizione di dissezione delle braccia, delle mani e delle dita13 in modo che la manipolazione delle pinze al microscopio da dissezione sia stabile, facile ed esperta. In.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Apprezziamo e vorremmo ringraziare l'Howard Hughes Medical Institute per il premio HHMI Professor a U.B. che ha reso possibile questo progetto. Ringraziamo il college dell'Università della California, Los Angeles, per aver fornito strutture e supporto alle infrastrutture didattiche per questo lavoro. Il lavoro è stato sostenuto anche con finanziamenti dalla Midwestern University e una generosa donazione dal Charity Fidelity Gift Fund. Ringraziamo John VandenBrooks per i commenti sul manoscritto e Krista Pearman per la sua assistenza tecnica.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS, pH 7,4) | 80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na2HPO4, 2,4 g KH2PO4, Porta il volume a 1 μ l, regolare il pH a 7,4, sterilizzare in autoclave o con filtro, diluire a 1x PBS con ddH2O autoclavato prima dell'uso. | ||
| Triton X-100 | Promega | H5142 | Attenzione: irritante! Indossare i guanti. |
| 0,3% PBT | 1,5 ml di Triton X-100, 500 ml 1X PBS. | ||
| Soluzione di formaldeide al 37% | Fisher Scientific | F75P1GAL | Attenzione: Tossico, probabile cancerogeno per l'uomo! Indossa i guanti. |
| Soluzione fissa | (≈ 4% Formaldeide in PBS) 50 μ l di 37% Formaldeide, 450 μ l 1x PBS, preparare fresco prima dell'uso | ||
| Siero di capra normale | Anticorpi Rockland e saggi | B304 | Aliquotare in volumi da 1 ml e conservare a -80 ° |
| Soluzione | 10% NGS in PBT. Questo può essere fatto e conservato a 4 gradi C per alcuni giorni prima dell'uso. | ||
| Soluzione madre DAPI | Life Technologies | D3571 | Per nuclei di colorazione coutner. Preparare una soluzione di 1 mg/ml con ddH2O. |
| VectaShield Montaggio medio | Vector Labs | H-1000 | Supporto di montaggio |
| Glycerol | Sigma | G5516 | Per il montaggio. Preparare una diluizione al 70% con ddH2O. |
| Attrezzatura | |||
| Miscelatore di nutazione | VWR | 82007-202 | Utilizzato per scuotere i tessuti in un piatto di vetro a 3 pozzetti |
| Kit di elastomero siliconico SylGard 182 | Krayden | NC9897184 | Utilizzato per realizzare un piatto di dissezione in silicone |
| Piatto | di dissezione in siliconeMiscelare delicatamente il kit di elastomeri Sylgard (sopra) secondo le indicazioni (per evitare bolle). Versare il composto nella capsula di Petri (di qualsiasi dimensione). Lasciare che SylGard indurisca durante la notte in 37 gradi C incubatrice. | ||
| Piatto di vetro a 3 pozzetti | Corning | 7220-85 | La varietà a 3 pozzetti di questi non è più disponibile, questo è il prodotto a 9 pozzetti. |
| Minivassoio a 72 pozzetti | Nunc | 438733 | |
| Pinze affilate (Dumont #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Micro forbici tipo Vannas, dritte, lama da 5 mm | Ted Pella | 1346 | |
| Capillari in vetro borosilicato da 100 mm | World Precision Instruments | 1B100-4 | Tirare con l'estrattore dell'ago per creare una punta a punta fine che consente il flusso di un piccolo flusso di PBS. |
| Pipette di trasferimento monouso, punta fine | Samco Scientific | 231 | |
| Le dimensioni del tubo indicate sono diametro interno (ID) x diametro esterno (OD) x spessore della parete in pollici | |||
| Tubo in PVC (1/8 x 3/16 x 1/32) | Nalgene | 8000-0010 | Utilizzare questi con ago tirato per assemblare il tubo del soffiatore come mostrato nella Figura 2. |
| Tygon Tubi in silicone (3/32 x 5/32 x 1/32) | Saint Gobain Performance Plastics | ABW00004 | |
| Tygon Tubi in silicone (1/32 x 3/32 x 1/32) | Saint Gobain Performance Plastics | ABW00001 |
Riferimenti
- Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice. Dev Biol. 53 (2), 217-240 (1976).
- Wolff, T., Ready, D. F. The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the ....
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Ristampe e permessi
