Method Article

Indagare le proteine ​​prioniche-come diffusione e tossicità di utilizzare i metazoi Organismo modello C. elegans

DOI:

10.3791/52321

⸱

January 8th, 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biosciences, Rice Institute for Biomedical Research, Northwestern University

In This Article

Summary

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La propagazione di aggregati proteici simile ai prioni è recentemente emersa come implicata in molte malattie neurodegenerative. L'obiettivo di questo protocollo è quello di descrivere come utilizzare il nematode C. elegans come sistema modello per monitorare la diffusione delle proteine e per studiare fenomeni simili ai prioni.

Abstract

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I prioni sono particelle proteiche autopropaganti non convenzionali, prive di qualsiasi acido nucleico codificante. Questi semi proteici fungono da modelli per la conversione e la replicazione della loro isoforma cellulare benigna. L'accumulo di prove suggerisce che molti aggregati proteici possono agire come modelli autopropaganti e corrompere il ripiegamento delle proteine affini. Sebbene gli aggregati possano essere funzionali in determinate circostanze, questo processo spesso porta all'interruzione dell'omeostasi delle proteine cellulari (proteostasi), portando infine a malattie devastanti come il morbo di Alzheimer (AD), il morbo di Parkinson (PD), la sclerosi laterale amiotrofica (SLA) o le encefalopatie spongiformi trasmissibili (TSE). Gli esatti meccanismi di propagazione dei prioni e di diffusione da cellula a cellula degli aggregati proteici sono ancora oggetto di intense indagini. Per approfondire queste conoscenze, recentemente è stato stabilito un nuovo modello di metazoo in Caenorhabditis elegans, per l'espressione del dominio prionico della proteina prionica di lievito citosolico Sup35. Questo modello di prioni offre diversi vantaggi, in quanto consente il monitoraggio diretto del dominio dei prioni marcati in fluorescenza negli animali viventi e facilita gli approcci genetici. Qui descritti sono i metodi per studiare il comportamento simile ai prioni degli aggregati proteici e per identificare i modificatori della tossicità indotta dai prioni utilizzando C. elegans.

Introduction

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Molte malattie neurodegenerative, tra cui la malattia di Alzheimer (AD), malattia di Parkinson (PD), la sclerosi laterale amiotrofica (SLA), e le encefalopatie spongiformi trasmissibili (TSE), sono associati con le proteine ​​di aggregazione a rischio e sono, quindi, noti collettivamente come misfolding disturbi (PMD ). EST o malattie da prioni costituiscono una classe unica di PMD in che possono essere infettivi in entrambi gli esseri umani e gli animali 1. A livello molecolare, i prioni replicano reclutando e convertendo monomerico α-elica-ricchi PrP cellulari host-codificato (PrP C) nel patologico β-sheet-ricchi PrP Sc conformazion....

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Protocol

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1. Monitoraggio transcellulare Diffusione delle proteine ​​prioniche come in vivo Time-lapse imaging

NOTA: Grow C. elegans wild-type (WT) (N2) e linee transgeniche secondo metodi standard e controllare attentamente la temperatura di coltivazione 47.

  1. Generare linee transgeniche di C. elegans esprimere la proteina prionica simile, taggati con proteina monomerica fluorescente rossa (MRFP). Guarda questo video che illustra come utilizzare microiniezione 48. Per ulteriori dettagli e metodi che descrivono come integrare queste linee extracromosomici, vedi 49.
  2. Prepa....

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Results

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Monitoraggio intercellulare diffusione di proteine ​​prioniche come in vivo time-lapse imaging

Transgenici C. Linee elegans esprimono il dominio prione sono particolarmente adatti per l'analisi di alcuni aspetti di proteine ​​prioniche come, ad esempio, la trasmissione di cellule-cellula e cellula non tossicità autonomo. La trasparenza degli animali consente il monitoraggio di fluorescente contrassegnati proteine ​​dall'interno dell'organi.......

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Discussion

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I metodi descritti qui aiutano a illustrare la diffusione e la cella di tossicità autonoma cella complesso autonomo e non di proteine ​​prioniche-like. Abbiamo recentemente scoperto che un dominio citosolico prioni aggregazione incline è ripreso in vescicole di membrana in un processo di autofagia correlato. Un sottoinsieme specifico di queste vescicole trasporta il dominio prione all'interno e tra cellule e tessuti 40. La chiave per monitorare il loro movimento nel animale vivente è che la proteina deve .......

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Disclosures

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Acknowledgements

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Ringraziamo Cindy Voisine e Yoko Shibata per l'utile discussione e i commenti critici sul manoscritto. Ringraziamo l'High Throughput Analysis Laboratory (HTAL) e il Biological Imaging Facility (BIF) della Northwestern University per la loro assistenza. Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni del National Institutes of Health (NIGMS, NIA, NINDS), della Ellison Medical Foundation e della Daniel F. e Ada L. Rice Foundation (a R.I.M.). C.I.N.-K. era sostenuta dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (KR 3726/1-1).

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Reagente
Nanosfere standard di dimensioni 100 nmThermoScientific3100A
LevamisoleSigmaL-9756
IPTGSigma15502-10G
Ahringer Libreria RNAiFonte BioScience LifeSciences http://www.lifesciences.sourcebioscience
.com/prodotti-cloni/non-mammiferi/c-elegans/c-elegans-rnai-library/
Attrezzatura
Centrifuga refrigerata Sorvall Legend XTR, 120VACThermoScientific75004521http://www.coleparmer.com/Product/Thermo_Scientific_Sorvall_Legend_
XTR_Refrigerated_Centrifuge_120
VAC/EW-17707-60
Replicatore a 96 pin Scionomix   http://www.scinomix.com/all-products/96-pin-replicator/
Agitatore di incubazione ad alta capacità HiGro Digilabhttp://www.digilabglobal.com/higro
Dispenser di reagenti combinati multidrop Titertrekhttp://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/titertek.htm
Biomek FX AP96 Stazione di lavoro automatizzata Beckman Coulterhttp://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/biomek_multi.htm
Innova44 agitatoreNew Brunswickhttp://www.eppendorf.com/int///index.php?sitemap=2.3&pb=d78efbc05310ec
04& azione=prodotti& contentid=1&
catalognode=83389
M205 FA Leicahttp://www.leica-microsystems.com/de/produkte/stereomikroskope-makroskope/fluoreszenz/details/product/leica-m205-fa/
ORCA-R2 C10600-10BDittatrice CCD gitaleHamamatsuhttp://www.hamamatsu.com/jp/en/community/life_science_camera/product/search/C10600-10B/index.html
Spinning Disc AF Confocal Microscope Leicahttp://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/life-science-research/fluorescence-microscopes/details/product/leica-sd-af/
Fotocamera Falcon 4M60 Teledyne Dalsahttp://www.teledynedalsa.com/imaging/products/cameras/area-scan/falcon/PT-41-04M60/
Software
MetaMorph Microscopy Automation & Software di analisi delle immaginimolecolarihttp://www.moleculardevices.com/products/software/meta-imaging-series/metamorph.html
Hamamatsu SimplePCI Software di analisi delle immaginiMeyer Instrumentshttp://meyerinst.com/imaging-software/hamamatsu/index.htm
ImageJNIH
http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html il plug-in wrMTrck per ImageJhttp://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html
C. elegans ceppi
N2 (WT)Caenorhabditis Genetics Center (CGC)http://www.cgc.cbs.umn.edu/strain.php?id=10570
AM815                                                                                                      rmIs323[myo-3p::sup35(r2e2)::rfp]Laboratoriodisponibile presso il nostro laboratorio 
Vedere la tabella 1 per una fonte di deformazioni
Dispositivi Morimoto del sensore di piegatura e del segnalatore di stress

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Prusiner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216 (4542), 136-144 (1982).
  2. Jarrett, J. T., Lansbury, P. T. Seeding 'one-dimensional crystallization' of amyloid: a pathogenic mechanism in Alzheimer's disease and scrapie.....

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Prion like ProteinsC elegans ModelTime lapse Fluorescence MicroscopyGenome wide RNAi ScreenWorm Tracker AnalysisCell Autonomous ToxicityNon cell Autonomous EffectsVesicle Transport MonitoringThrashing Motility AssayOxidative Stress Response

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